动物细胞工程(优质课).ppt

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宠辱皆空,“,汉水丑生的生物同行,”,超级群出品,本卷制作：,【,冀,】,大拇哥,植物组织培养,植物体细胞杂交,回顾：,植物细胞工程常用的技术手段有哪些？,植物组织培养技术的原理是什么？,细胞的全能性,专题,2,细胞工程,动物细胞工程,课题,2,动物细胞培养,动物细胞融合,单克隆抗体技术,核移植,动物细胞工程常用技术,其它动物细胞工程的基础,一、动物细胞培养的应用和概念：,1,、概念：,动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的,组织,将它分散成,单个细胞,然后,放在适宜的,培养基,中,让这些,细胞生长和增殖,.,2,、原理：,细胞增殖,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,细胞悬浮液,10,代细胞,50,代细胞,传代培养,无限传代,单个细胞,加培养液,原代培养,胰蛋白酶,剪碎,细胞株,细胞系,遗传物质,未,改变,遗传物质,已,改变,3,、过程,（,1,）细胞贴壁：,悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上（单层）。要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。,（,2,）接触抑制：,当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。,动物细胞培养特点,：,贴壁生长、接触抑制,解答概念,细胞贴壁过程,培养瓶或培养皿壁要求：,表面光滑、无毒、易于帖附。,(3),原代培养,(primary culture),定义：,指将要培养的动物细胞取出后，先用,胰蛋白酶,等使组织分散成单个细胞，然后配制成一定浓度的,细胞悬液,，再将该悬液放入,培养瓶中,培养。,过程：从动物机体中取出组织,剪碎,加胰蛋白酶 细胞游离 制成细胞悬液 将细胞,接种到培养瓶内,培养（,1-2,天换一次培养液）,细胞贴壁生长,长成单层细胞,定义：,当原代培养的,细胞生长停止,，这时如果要使细胞继续生长，就要及时用,胰蛋白酶,等,，使细胞从瓶壁上解离下来，然后加入新的培养液，将,细胞分离稀释，并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内，这个过程称传代培养,(4),传代培养,(subculture),细胞株：传代细胞一般能传到,40-50,代，,遗传物质一般不会发生改变,，叫细胞株。,强调：细胞系、细胞株（,了解即可，老课本体系,）,细胞系：传代,50,代以后不能再传下去，部分细胞,遗传物质发生了改变,，能连续传代，获得不死性，叫细胞系。,细胞株和细胞系的区别：,细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。,细胞悬浮液,培养瓶中培养,50代细胞,无限传代,原代培养,传代培养,细胞株,细胞系,知识点小结：各个新名词之间的联系,多数组织细胞固定在表面生长和分裂。,随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖,遗传物质改变,1,、无菌、无毒的环境,（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）,2,、营养,（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清、微量元素等,）,3,、温度和,PH,温度,36.5,+,0.5,度，,pH7.2,7.4,4,、气体环境,O,2,和,CO,2,（,95%,空气和,5%CO,2,）,4,、动物细胞培养条件,保证细胞顺利的生长增殖,离体培养的细胞对微生物和有毒物质没有防御能力,能否用胃蛋白酶代替胰蛋白酶？,无菌操作,培养箱,问题,3,：为什么用胰蛋白酶处理？,问题,1,：、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？,因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。,问题,2,、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？,扩大细胞与培养液的接触面积，利与细胞吸收营养。,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，胰,蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和,细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。,问题,4,：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？,动物细胞培养的最适,PH,值为,7.2-7.4,，胰蛋白酶作用的适宜,PH,为,7.2-8.4,，胃蛋白酶适宜,PH,为,2.,胃蛋白酶在,PH,为,7.2-7.4,的动物细胞培养中无活性。,问题,5,：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？,控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。,问题,6,、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？,问题,7,、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？,主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维生素和动物血清等。独特之处有：,1,、液体培养基,2,、成分中有动物血清等,不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体,问题,8,、动物细胞培养的原理：,细胞增殖。,问题,9,、目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在,10,代以内，为什么？,10,代以内的细胞,遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。,5.,动物细胞培养技术的应用,:,1.,蛋白质生物制品的生产,如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体,2.,应用于基因工程,主要用于作为受体细胞,3.,检测有毒物质，判断某种物质的毒性,4.,细胞的生理、药理、病理研究,如用于筛选抗癌药物,6,、植物组织培养和动物细胞培养的比较：,比较项目,植物组织培养,动物细胞培养,原理,细胞的全能性,细胞增殖,培养基性质,固体培养基,液体培养基,培养基特有成分,蔗糖 植物激素,葡萄糖 促,-,动物血清,培养结果,植物体,细胞株、细胞系,培养目的,快速繁殖、培育无病毒植株,获得细胞或细胞分泌蛋白,取材,植物幼嫩部分或花药,胚胎或幼龄动物的器官或组织,其他条件,无菌无毒，适宜条件,无菌无毒，适宜条件,复习回顾,1,、动物细胞培养的过程、特点及原理？,2,、植物组织培养与动物细胞培养的比较？,卵细胞,C,母绵羊子宫,母绵羊,母绵羊,乳腺细胞,细胞质,细胞核,细胞核移植,胚胎移植,早期胚胎,多莉羊,分娩,卵裂,融合后的卵细胞,细胞拆合技术,妊娠,多莉羊的培育过程,无性生殖,二、动物体细胞核移植技术和克隆动物,1,、,定义：,动物核移植是将动物的,一个细胞的细胞核,移入一个已经,去掉细胞核的卵母细胞中,.,使其重组并发育成一个,新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为,动物个体,.,3,、,分类：,胚胎核移植、体细胞核移植。,胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易。,动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难,2,、,原理：,动物细胞核具有全能性,4,、体细胞核移植过程,-,示动物克隆,-,无性繁殖,1.,）克隆羊多利培育过程：,黑面绵羊去核卵母细胞,白面绵羊乳腺细胞核,细胞核移植,重组细胞,电脉冲刺激,早期重组胚胎,胚胎移植,另一头绵羊的子宫,妊娠、出生,克隆羊多利,特别注意：,克隆动物性状与供体动物完全一样吗？,不可能！,因为：,一、供体动物只提供细胞核，而细胞质中的遗传物质（如线粒体,DNA,）来自于受体卵母细胞,.,二、生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境的影响。,供体,受体,代孕,受体,取供体细胞传代培养,10,代以内的细胞,.,为什么？,用的是去核的减数第二次分裂中期细胞（,M,中期）为什么？,激活方法：,激活目的：,促融方法：电刺激,胚胎移植至代孕受体内,妊娠、分娩,2.,）核移植流程,供体：优质高产奶牛,受体：普通奶牛（卵母细胞的采集与培养）,1.,体积大，易操作。,2.,含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。,有人说它三个母亲，对吗？,供体细胞（供核）,细胞培养,体细胞,卵巢卵母细胞,（,M,中期：供质）,去核,无核卵母细胞,注入,细胞融合,重组细胞,构建重组胚胎,胚胎移植,代孕母体,生出与供体奶牛遗传基础相同的犊牛,归纳,:,1.,共分成两大阶段：,核移植和胚胎移植,2.,取卵细胞作受体细胞的原因是,:,它是最大的细胞,易操作,它发育可直接表达性状,3.,严格来说新个体有卵巢母细胞的细胞质所以有两个亲本的性状,小结：核移植过程,5.,体细胞核移植技术的应用前景,克隆动物的研究意义,1.,克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白,2.,加速改良动物品种,3.,治疗人类疾病提供供体（器官、细胞、组织）,4.,保护濒危动物,体细胞核移植技术存在的问题,1.,许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，免疫失调等。,2.,成功率非常低,3.,克隆动物食品的安全性问题。,2-2,动物细胞融合与,单克隆抗体,一、动物细胞融合（细胞杂交）,1,、概念：,指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。,2,、结果,:,形成,单核,的杂交细胞,3,、原理：,细胞膜的流动性,4,、诱导方式：,物理法,：离心、振动、电激,化学法：,聚乙二醇（,PEG),生物法,：灭活的病毒,细胞融合是正常的生命活动,两个细胞正在融合,受精作用,诱导融合的方式,生物法：,灭活的病毒,诱导融合,.(,利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。这是由于病毒的磷脂外衣与动物细胞的膜十分相似的缘故。病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合的功能。,),化学法：,聚乙二醇,PEG,诱导融合,.,物理法：,电激,融合,病毒颗粒黏 附细胞表面,细胞膜连接,细胞膜被 病毒颗粒穿通,细胞融合、形成杂种细胞,5,、过程：,动物细胞,A,动物细胞,B,诱导，融合,1,个完整的杂交细胞,AB,（,膜融合、质融合,）,（核融合,）,细胞融合完成的标志,:,细胞核融合成一个核,6,、意义：,突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。,7,、应用：,成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。,最有价值的应用,制备单克隆抗体,动物细胞融合,杂种细胞,愈伤组织,杂种植株,植物细胞,A,植物细胞,B,原生质体,A,原生质体,B,植物体细胞杂交,去壁,原生质体融合,植物组织培养,物理法,化学法,生物法：,灭活的病毒,动物细胞,A,动物细胞,B,杂种细胞,常用方法,主要用于制备,单克隆抗体,获得杂种植株,用途,物理、化学方法,（同左）,灭活的病毒,物理（离心、振荡、电刺激）,化学（聚乙二醇）,诱导方法,使细胞分散后诱,导细胞融合,去除细胞壁后诱,导原生质体融合,细胞融合的方法,细胞膜的流动性,细胞膜的流动性、,植物细胞全能性,原理,动物细胞融合,植物体细胞杂交,比较项目,植物体细胞杂交、动物细胞融合的比较,1,.动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于-（）,A.,培养基不同；,B.,动物细胞培养不需要在无菌条件下进行；,C.,动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能；,D.,动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培,养成植株。,A,课堂练习：,2,、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是-（）,A,细胞系,B,细胞株,C,原代细胞,D,传代细胞,3,、动物细胞工程技术的基础是-（）,A.,动物细胞融合,B.,单克隆抗体,C.,胚胎移植,D.,动物细胞培养,A,D,4,、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞（）,A.,容易产生各种变异,B,具有更强的全能性,C.,取材十分方便,D,分裂增殖的能力强,D,5.,下图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据此回答：,（,1,）容器,A,中放置的是动物器官或组织。它一般取自,_,。,（,2,）容器,A,中的动物器官或组织首先要进行的处理是,，然后用,酶处理，这是为了使细胞,分散开来，这样做的目的是,（,3,）培养首先在,B,瓶中进行，瓶中的培养基成分有,_,等。,幼龄动物或胚胎的组织或器官,剪碎组织,胰蛋白,使细胞与培养液充分接触,葡萄糖、氨基酸、水、无机盐、促生长因子,与微量元素和动物血清,在此瓶中培养一段时间后，有许多细胞衰老死亡，这是培,养到第,代，到这时的培养称为,_,。,为了把,B,瓶中的细胞分装到,C,瓶中，用,处理,然后配置成,，再分装。,在,C,瓶中正常培养了一段时间后，发现细胞全部死亡，,原因是,10,原代培养,胰蛋白酶,细胞悬液,细胞没有发生癌变,（,2008,宁夏）,6.,生物选修,3,现代生物科技专题（,15,分）回答下列有关动物细胞培养的问题：,(1),在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面,时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的,。此时，瓶壁上形成的细胞层数是,。要使贴壁细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的酶是,。,(2),随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现,的现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成,细胞，该种细胞的黏着性,，细胞膜表面蛋白质（糖蛋白）的量,。,“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题,PPT,版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的。,2012,年,1,月,15,日，汉水丑生标记。,相互接触,接触抑制,单层（或一层）,胰蛋白酶,衰老甚至死亡,不死性,降低,减少,（,2007,宁夏）,7,B,生物,选修,3,现代生物科技专题现有,A,和,B,两个肉牛品种，,A,品种牛的细胞组成可表示为,A,细胞核、,A,细胞质，,B,品种牛则为,B,细胞核、,B,细胞质。,（,1,）如果要获得一头克隆牛，使其细胞由,A,细胞核和,B,细胞质组成，基本步骤是，从,A,品种牛体内取出体细胞，进行体外培养。然后再从培养细胞中取出,_,注入,B,品种牛的,_,卵母细胞，经过某处刺激和培养后，可形成胚胎，该胚胎被称为,_,_,，将该胚胎移入代孕母牛的,_,中，通过培育可达到目的。,“,汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题,PPT,版制作。本课件为公益作品，版权所有，未经允许不得擅自修改或用于任何形式的商业用途。,2012,年,1,月,15,日，汉水丑生标记。,子宫,细胞核,重组胚胎,去核,二、单克隆抗体,什么是抗体？,由何种细胞产生？,主要分布在哪里？,起何作用？,效应,B,细胞,血清,特异性免疫作用,抗体：,机体受抗原刺激后产生的，并且能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。,克隆,概念：,是指从一个共同的祖先，通过,无性繁殖,的方法产生出来的一群遗传特性相同的,DNA,分子、细胞或个体,不同层次的克隆：,a.,分子水平,：,如,DNA,的复制,b.,细胞水平,：,动物细胞的培养,c.,个体水平：,“,多莉,”,羊的产生,接受抗原刺激后，能,分泌,针对该抗原的,特异性抗体,，在体液免疫中具有重要功能。,B,淋巴细胞本身是一种,终末分化细胞,，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间后便会死亡,短命细胞,B,淋巴细胞,所以,B,淋巴细胞在体外培养时不能无限增殖，而癌细胞是可以无限增殖的。,骨髓瘤细胞,恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可永远分裂和存活,长命细胞,。,经筛选与驯化，现已建立多种骨髓瘤细胞株,没有抗体分泌物,。,因此可以利用小鼠骨髓瘤细胞与之融合，就可获得既能无限增殖又能产生单一抗体的细胞。,单克隆抗体的制备,极富创造性的方案,将能够产生特定抗体的,B,淋巴细胞,和具有无限增殖能力的,骨髓瘤细胞,融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种,单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。,米尔斯坦,(,阿根廷,),和科勒,(,德国,),因此在,1984,年获诺贝尔奖。,特点：产量低、特异性差、纯度低、反应不够灵敏,1,、常规抗体制备,一个,B,淋巴细胞,：只分泌一种,特异性抗体,2,、单克隆抗体,杂交瘤细胞,小鼠,骨髓瘤细胞,：能,无限增殖,融合,单克隆抗体,培养,向动物体内反复注射抗原，使动物产生抗体，然后从血清中分离,所需抗体。,优点,：,特异性强，灵敏度高，可大量制备。,B,淋巴细胞,注射特定抗原蛋白,骨髓瘤细胞,培养骨髓瘤细胞,融合,多种,杂交细胞,在具有筛选作用的培养基上培养,专一抗体检验阳性,克隆上述杂交细胞,分开不同杂交细胞，克隆专一抗体，,检验阳性细胞,单克隆抗体,注射到小鼠体内,体外培养,3,、单克隆抗体的制备过程,第,1,次筛选目的：得到杂交瘤细胞（多种）。,第,2,次筛选目的：在杂交瘤细胞中筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。,该细胞继承,双亲细胞,的遗传特性，既能,产生专一抗体,又能,无限增殖,。,杂交瘤细胞有何特点？,特异性强，灵敏度高,原理：,杂交瘤细胞具有两个亲本的特性，即能迅速大量增殖，又能产生足够数量的单一抗体。,过程,B,淋巴细胞,骨髓瘤细胞,诱导融合,B-B,细胞,B-,瘤细胞,瘤,-,瘤细胞,选择培养,杂交瘤细胞,（,B-,瘤细胞）,克隆化培养,抗体检测,杂交瘤细胞,体外培养,小鼠腹腔内增殖,单克隆抗体,（,1,）为什么用小鼠骨髓瘤细胞与,B,淋巴细胞融合？,思考,：,因为,B,淋巴细胞具有,分泌特异性抗体,的能力，而骨髓瘤细胞具有在体外培养条件下,大量增殖,的本领，所以由某种,B,淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合产生的杂交瘤细胞，,能够在体外大量繁殖，并且产生特定的单克隆抗体。,（,2,）单克隆抗体制备过程中应用哪些细胞 工程技术手段？,动物细胞融合技术,动物细胞培养技术,4,、,应用,可用于作为诊断试剂：,准确，高效，简易,快速,。,可用于疾病治疗。,可用于运载药物（作为运载对应疾病的药物的,“,生物导弹,“,。,位置准确,副作用小,疗效高,）,生物导弹：,抗癌细胞的单克隆抗体,+,放射性同位素,+,化学药物或细胞毒素,。（单克隆抗体：导向。准确找到癌细胞位置，原位杀死癌细胞。）,1,在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是（）,A,结果是相同的,B,杂种细胞的形成过程基本相同,C,操作过程中酶的作用相同,D,诱导融合的手段相同,2.,单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和,B,淋巴细胞,诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，,在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（）,淋巴细胞,小鼠骨髓瘤细胞,B,淋巴细胞自身融合细胞,小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞,杂交瘤细胞,A,B,C,D,C,B,体外培养,骨髓瘤细胞,杂交瘤细胞,足够数量的细胞群,注射到,小鼠腹腔,A,C,3,、下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌单克隆抗体的实验方案,3,、图中,B,为,_,过程，常用,_,作为诱导剂，该细胞继承,_,的遗传特性，既能,_,又能,_,。,1,、该实验方案的目的是,_,2,、,A,是从小鼠的脾脏中取得,_,该细胞能够产生,_,4,、,C,过程指细胞培养，该过程包括,_,培养和,_,培养两个阶段，其中,_,代以内的的细胞属于细胞株。,制备单克隆抗体,B,细胞,抗体,细胞融合,灭活病毒,双亲细胞,分泌抗体,无限增殖,原代,传代,50,再见,