融合蛋白.ppt

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白常常,沉淀成不溶性包涵体聚合物,，需要,复杂的变性和复性过程,；大量蛋白的,分泌较困难,。,（一）融合蛋白技术的特点,真核表达系统的特点是,蛋白翻译后加工机会多,，甚至可被改造成人源型；真核细胞,易被转染,，具有,遗传稳定性和可重复性,；产物可被分泌，,提纯简单，成本低,。,（二）融合蛋白技术的内容,构建融合蛋白的基本原则是，将第一个蛋白的,终止密码子删除,，再接上,带有终止密码子的第二个蛋白基因,，以实现两个基因的,共同表达,。具体步骤有：,1.,进行目的基因的克隆：,根据基因序列互补原则，设计合适的引物序列，以,cDNA,为模板，利用,PCR,技术扩增不同的目的,DNA,片段。,（二）融合蛋白技术的内容,2.,在载体中进行重组：,通过限制内切酶将两个,DNA,片段进行酶切并回收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。,（二）融合蛋白技术的内容,3.,将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及测序。,4.,融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化。,（三）融合蛋白技术的关键,在构建融合蛋白中，一个关键的问题是两蛋白间的,接头序列,(Linker),，即连接肽,。,它的长度对蛋白质的折叠和稳定性非常重要,。如果接头序列太短，可能影响两蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰；如果接头序列太长，又涉及免疫原性的问题，因为接头序列本身就是新的抗原。,（三）融合蛋白技术的关键,一般来说，,3-5,个氨基酸的,Linker,可满足大部分融合蛋白的正确折叠的要求。有人尝试在融合蛋白间加入一段有,疏水性和一定伸展性的较长肽链,，如,(Gly4Ser1),，目的是将两者分开，以缓解相互干扰作用，并获得了满意的结果。,（三）融合蛋白技术的关键,但具体涉及到每种蛋白时，需具体分析。当我们构建融合蛋白时，应多选择几种融合方式，从中优化出理想的连接方式。,另外，大量研究表明,连接肽的柔性和疏水性,对不扰乱蛋白质的功能结构域是十分重要的。,（三）融合蛋白技术的关键,遗憾的是，目前对于连接肽序列的设计还没有可靠的选择标准。现在，大多数连接肽序列的设计和选择仍主要依赖于直觉。尽管依赖于蛋白质的一级结构来预测其二级结构已经产生了重大的进步，但是我们对于,序列和结构之间的关系,的了解还是很有限的。,三、融合蛋白技术的临床 应用,DNA,疫苗,双功能酶（多功能酶）,定向药物,溶栓剂,抗菌肽,（一）,DNA,疫苗,目前，疫苗已经经历了三代：,第一代疫苗是用,减毒或杀死的病原体,来激活机体免疫系统；,第二代疫苗是用,生物技术和重组,DNA,技术,研制的组分疫苗注射机体诱导免疫应答；,第三代疫苗是直接注射,基因重组的抗原基 因,来激活人体免疫系统，即,DNA,疫苗。,（一）,DNA,疫苗,DNA,疫苗与传统疫苗相比有着明显的优势，如易于生产，稳定性强，成本低廉等，并可同时,诱导体液与细胞免疫应答,。,（一）,DNA,疫苗,DNA,疫苗的免疫方法是将带有目的基因并能在真核细胞中表达的,细菌质粒,直接导入动物体内，通过在体内表达目的蛋白以引起机体对该蛋白的免疫应答。,（一）,DNA,疫苗,目前利用基因工程成功制成的,多价重组抗体融合蛋白,CYF196,(,国内尚未上市,),就是一种,DNA,疫苗，它能有效防治下呼吸道感染和哮喘。因为,CYF196,对病毒的主要受体,-,位于呼吸道上皮中的细胞间黏附分子,有高度亲和力，对鼻病毒感染有较强,的防御功能。,（二）双功能酶（多功能酶）,以往研究发现，在利用基因融合所构建的大的酶分子中，如果用以构成融合蛋白的各个酶分子的整个编码序列均保留于新的酶分子中，则融合蛋白一般均保留所构成的酶分子各自的酶活性。,（二）双功能酶（多功能酶）,并且发现在这些新构建的融合蛋白中，蛋白的正确折叠以及各个酶的活性部位均未受到影响，与单个酶相比，融合蛋白的酶的比活力为,50%-100%,，对于催化连续反应的两种或几种酶，利用基因融合的方法构成的融合蛋白可产生,“邻近效应”（,proximity effect,）。,（二）双功能酶（多功能酶）,目前研究发现，,-,半乳糖苷酶,-,半乳糖脱氢酶融合蛋白,在一定条件下，其偶联反应产生,NADH,的速度是同时加入这两种酶的反应速度的两倍以上。同时过渡态时间缩短近四倍。,（三）定向药物,定向药物一般由两部分组成：一部分是,药物,；另一部分是可以与病灶特异性结合的,配基,。通过融合蛋白技术将这两部分融合在一起，即可构成,一个具有独特构象与功能的蛋白质。,（三）定向药物,特点：它可以特异性地与靶细胞或致病因子结合，并把药物引导至病灶处，从而大大提高药物的效力。可以,选择性地杀伤相应的抗原相关细胞或受体相关细胞,，对其他无关细胞影响较少或无影响。,（三）定向药物,配基常是肿瘤特异性抗体、细胞因子或激素等,导向物质,，药物常是,毒性分子,（如动植物毒素、放疗、化疗药物或细菌毒素等）。,（四）溶栓剂,新型溶栓剂的要求是具有多种功能，既有较高的,溶栓活性,，又有较强的,纤维蛋白的亲和性或抑制血栓的功能,，从而使溶栓剂具有较高的纤维蛋白专一性，减少出血副作用，降低溶栓药物使用后再栓塞形成的可能性。,（四）溶栓剂,凝血酶,在血小板激活后促进纤维蛋白酶原转化为纤维蛋白，在凝血过程中起主要作用，在动物模型和人体中，,肝素,是凝血酶间接抑制剂，,水蛭素则,是其直接抑制剂。单克隆抗体,mAb59D,能靶向血块，mAb59D8与纤溶酶原,活化因子偶合能达到靶向治疗和有效溶栓的目的。,（四）溶栓剂,但两者化学结合不仅产量低,，,而且在生产过程中部分损失了,水蛭素的溶栓活性,。利用基因融合技术，把水蛭素,和,mAb59D8,的纤维蛋白原片段融合，融合蛋白在稳态时无作用，只有用凝血酶原激酶,(Ax),对它进行切割激活后，才有活性。,（四）溶栓剂,利用分子克隆技术，这种融合蛋白能成功 转录并高效表达于,59D8,杂交瘤细胞系，这种策略结合了,靶向溶栓,和,Ax,因子激活,，有效地在血栓处发挥作用，对全身的副作用很小。,（五）抗菌肽,肽类抗生素又名抗菌肽，机体天然产生的抗菌肽由于其对耐药菌的强大抗菌作用而受到人们关注。它广泛存在于动植物体内，是由生物体特定基因编码的,一类阳离子小分子多肽，具有广谱抗菌活性，是机体天然免疫的重要组成部分。,（五）抗菌肽,研究结果表明，抗菌肽可以在亚毒性浓度下抑制,HIV-1,的基因表达，减少,HIV-1,的增殖。而人源溶菌酶除了具有一般溶菌酶的抗菌活性外，也具有抗病毒的特性，已有研究证实人源溶菌酶具有抗,HIV-1,的作用。,（五）抗菌肽,目前已有人构建了,抗菌肽,B,和人溶菌酶的融合蛋白表达载体,。并成功表达出了具有抗菌和抗病毒双重活性的重组蛋白。,四、常见的几种融合蛋白,（一）免疫球蛋白（,Ig,）融合,蛋白,（二）,甲状旁腺激素,（,PTH,）,融合蛋白,（三）细胞因子重组融合蛋白,（,一）免疫球蛋白（,Ig,）融合蛋白,Ig,融合蛋白是指在基因水平将目的基因同,Ig,部分片段基因相连，并在真核或原核细胞中表达出的具有上述两部分结构域的重组蛋白。据目的蛋白与,Ig,不同片断相连，可将其分为二大类：,一类为Fab(Fv)融合蛋白；另一类为 Fc融合蛋白。,1,、,Fab(Fv),融合蛋,Fab(Fv),融合蛋白主要是将,Fab(Fv),段与其他生物活性蛋白结合，利用,抗体对抗原的特异识别功能将活性蛋白导向特定部位,。使活性蛋白在特定部位发挥生物作用。常见的与,Fab,融合的蛋白有毒素、细胞因子、受体、酶等。,肿瘤靶向免疫治疗,将一些生物活性蛋白,(,如毒素、细胞因子等,),与抗肿瘤抗体的,Fab,段融合，利用抗体对肿瘤抗原的识别作用而进行,靶向免疫治疗。,肿瘤靶向免疫治疗,如,Forsberg G,等利用抗癌胚抗原,(CEA),抗体的,Fab,段与葡萄球菌肠毒素,(SEA),融合组成 一个,超抗原,，融合超抗原可导向肿瘤细胞并激活,T,细胞杀死表达有癌胚抗原肿瘤细胞。,肿瘤靶向免疫治疗,而将,T,细胞共刺激分子,B7,与抗瘤抗体结合就可将,B7,导向肿瘤细胞。,B7-,抗瘤抗体，一方面,与肿瘤细胞表面抗原结合,，一方面,提供共刺激信号给,T,细胞能有效触发肿瘤特异细胞毒,T,细胞反应,。,2,、,Fc,融合蛋白,Fc,融合蛋白主要是将,生物活性蛋白与,Ig,的绞链区及,CH2,、,CH3,区结合,。与,Fc,段融合的蛋白种类很多，其作用也各不相同，归纳起来有如下几方面：,（,1,）抗病毒感染,目前发现使用,DNA,疫苗加上,IL-2-,Ig,融合蛋白,注射到实验用的恒河猴，然后高剂量静脉内给恒河猴注射,SHIV,病毒。虽然它们不能阻止猴被,SHIV,病毒感染，但确实可控制病毒血症到几乎测不到的水平，并,预防免疫缺陷和临床症状,。,（,1,）抗病毒感染,目前,IL-2,已用于临床治疗,HIV,和癌症，但由于,IL-2,在活体内,半衰期短，有毒性作用及成本高,，其临床治疗作用受限。而用,IL2-,Ig,融合蛋白，它有,IL-2,的免疫刺激活性且半衰期长,，用它注入健康恒河猴可诱导,T,细胞数目增加并表达,CD25,。,（,2,）治疗痛觉过敏,Etanercept,，一个重组,TNFR-Fc,融合蛋白，可竞争性抑制,TNF,，它已成功用于治疗,类风湿性关节炎,的病人，能减少疼痛和炎症，在神经损伤后，由于局部产生前炎性细胞因子对疼痛产生起一 个主要作用。给坐骨神经慢性压缩性损伤的鼠注射,Etanercept,可,减少热痛觉过敏和机械性异常性疼痛,。,（,2,）治疗痛觉过敏,实验诱导猪神经根损伤，同时给猪 注射,Etanercept 7,天后显示,Etanercept,能,预防神经传导速度的减低，限制神经纤维损伤，防止毛细血管内血栓和神经内水肿形成,。预示,Etanercept,可用于治疗椎间盘突出和坐骨神经痛。,（,3,）类风湿性关节炎的治疗,类风湿性关节炎,(RA),是一个系统性疾病，以关节滑膜慢性炎症反应为特征并有软骨变性和关节旁骨的侵蚀。,（,3,）类风湿性关节炎的治疗,已知,TNF,与,RA,的发病机理有很大关系，许多实验证实用人可溶性重组,TNF,受体与,Ig,Fc,段蛋白融合,可完全竞争性抑制,TNF,结合到细胞表面受体，使,TNF,无生物活性,。给病人注射,Etanercept,可减少关节肿胀及炎症，减少关节腔狭窄。临床上已用于治疗类风湿性关节炎。,（,4,）用于其他科学研究,融合蛋白还可以作为一种研究工具应用 于许多方面的研究，如人表皮生长因子受体,2,蛋白,(HER2),向上调节血管促白细胞生成素,(Ang-2),的表达，而利用酪氨酸蛋白激酶受体,-2-Fc(Tie-2/Fc),融合蛋白将减少肿瘤细胞释放血管促白细胞生成素，这样就可研究,HER2,对微血管的折除,(dismantle),作用。,（二）,PTH,融合蛋白,甲状旁腺激素,(Parathyroid Hormone,，,PTH),是由,甲状旁腺主细胞合成和分泌的一种单链多肽激素,，成熟,PTH,含,84,个氨基酸残基，,分子量约为,9500,，是人体内调节钙磷代谢及骨转换的最为重要的激素之一。它主要通过作用于靶细胞膜上腺苷酸环化酶系统，增加胞浆内,cAMP,及焦磷酸盐,(PPi),的水平来发挥作用。,蛋白类药物的分子量若,小于,20kD,在代谢过程中易被 肾小球滤过，且在体内的半衰期较短，皮下给药或肌肉注射的半衰期一般在,12h,左右。因此，长效蛋白药物的研制 已成为对第一代基因工程产品进行二次开发的一个重要方向，而,增加分子量,则是一个通用的策略。人们已经采用多种方法来 对,PTH,的性质进行改进，以在保留它的活性 的同时提高半衰期。其中包括构建突变体、化学修饰以及基因融合等，而,基因融合技术,为最突出的。,常用的融合蛋白的载体有,人血清白蛋白,(Huma serum albumin,，,HSA),融合蛋白,、,-,半乳糖苷酶融合蛋白、谷胱甘肽,S-,转移酶,(GST),融合蛋白以及硫氧还蛋白,(Trx),融合蛋白等。而人血清白蛋白,(HSA),则由于本身特殊的优点，更适合于充当长效融合蛋白类 药物的融合载体。,HSA,是包含,585,个氨基酸残基的,单链无糖基化的球形蛋白质,，分子量,65kD,。它是,人血浆中含量最高的单一蛋白质,(,达,40g/L),，在体内有维持血液渗透压，运输营养和其它重要生物物质的作用。,HSA,本身是许多,内源因子和外源药物,的载体。药物和血清白蛋白结合后。可以减少其生物利用度，增加在体内的半衰期至,19d,之久。,人血清白蛋白融合技术具有明显 的优点，包括：,HSA,与目标蛋白在胞内经蛋白翻译系统通过肽键连接，,不需额外的体外处理,；,HSA,表达水平较高，融合后可以提高,目的蛋白的表达水平,；,HSA,是一个稳定的“惰性”蛋白，融合后可以提,高目的蛋白的稳定性,；,HAS,融合蛋白具有比,PEG,修饰的蛋白药物更长的半衰期。,（三）细胞因子重组融合蛋白,细胞因子重组融合蛋白是,一类利用基因工程的方法将编码细胞因子和其他有特定功能的蛋白分子基因序列连接并表达相应蛋白质融合产物,。其结构特点为将细胞因子功能活性域与其他分子的活性域融合，各组分可发挥协同作用，使融合蛋白的生物学活性较各单体大大增强。,按生物学功能的不同可分为：细胞因子与抗体的融合蛋白、,细胞因子与毒素的融合蛋白,、不同细胞因子的融合蛋白、,细胞因子与细胞因子受体的融合蛋白,以及,细胞因子与其他分子的融合蛋白,。这些兼具特异 性与高效性的新型重组融合蛋白有些已走向临床，在抗肿瘤、抗风湿病、抗,HIV,感染等领域发挥作用，为人类疾病的治疗提供新的手段。,1,、细胞因子与毒素的融合蛋白,在一些肿瘤细胞表面存在许多细胞因子受体，可利用细胞因子作为靶向载体将细胞毒素运送到肿瘤微环境以杀伤肿瘤细胞。,白喉毒素与细胞因子的重组融合蛋白,便是这样一类能直接杀伤靶细胞的免疫制剂。,体外试验表明，白喉毒素,-IL-2,的融合蛋白,(DAB,389,IL-2),对表达高亲和力,IL-2,受体的细胞株起毒性作用，而缺乏完整的高亲和力受体的细胞株,(,有,p55,亚单位而无,p75,亚单位,),则对该融合毒素相对耐受。细胞结合该融合毒素后，可观察到类似于,IL-2,刺激之后的情况，即,IL-2,、,IL-2,受体的,mRNA,的表达增高，蛋白合成在,4-6h,内开始受抑制，继发的凋亡则在,40-72h,内发生。,Saleh,等报道,DAB,389,IL-2,在皮肤,T,细胞淋巴瘤,(cutaneous T cell lymphoma,，,CTCL)1,期临床试验中单独使用显示出显著的临床治疗效果。,DAB,389,IL-2,已成为美国食品与药品管理局,(FDA),核准的临床治疗药物。,2,、细胞因子与细胞因 子受体的融合蛋白,通过将在体内发挥作用时相互依赖或者所具有的协同作用细胞因子与细胞因子受体基因重组，可大大促进其生物学活性的发挥。,IL-6,在肝细胞的增殖中起着增强作用。,IL-6,和,IL-6R,(gp80,),的结合使其易于和另一个受体,IL-6R(gpl30),结合。,Fischer,等用基因重组的方法构建了一种,IL-6-slL-6R,融合蛋白,hyper-IL-6,。在,gpl30,细胞上，该融合蛋白表现出了完全的生物学活性，而所需浓度仅为非融合形式的,IL-6,和,slL-6 R,的,100,至,1000,分之一，因而被用于在体外有效的扩增造血祖细胞，且该作用具有剂量依赖关系。进一步的大鼠体内试验表明，,hyper-IL-6,可逆转亚致死性或致死性肝毒性损伤，且此作用不可被,IL-6,替代。,3,、细胞因子与其他 分子的融合蛋白,细胞因子还被设计与其他生物活性分子如某些肿瘤相 关抗原，信号转导途径中的相关分子等融合。,Aqeilan,等报道了一个新的人融合蛋白,I L-2-Bax,用于靶向治疗。,Bax,属于,Bcl-2,蛋白家族，为促凋亡因子。,诱导,Bax,表达便可,介导细胞凋亡而不需要附加的细胞死亡刺激信号,，且通过凋亡途径杀伤靶细胞可使组织损伤和全身性反应降至最低。研究表明，该融合蛋白介导的靶细胞凋亡呈,剂量依赖关系,。靶向性细胞因子和凋亡蛋白融合产物在体内及 体外可选择性杀伤特定类型细胞，开创了疾病靶向治疗新视野。,目前，细胞因子融舍蛋白在肿瘤治疗 研究 中取得了很大进展，已成为细胞因子研究中的一个热点领域。由于机体很多功能是由细胞因子共 同作用、相互协调完成的。因此，双因子的协同作用 能够实现细胞因子与其它功能分子之间作用 的优化，为肿瘤治疗提供了新的途径。,THANK,YOU,