蛋白沉淀反应.ppt

Click to edit Master title style.,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,SSB 10.30.02,实验,2,蛋白质的等电点测定和沉淀反应,实验目的,了解蛋白质的两性解离性质,学习测定蛋白质等电点的一种方法,加深对蛋白质溶液稳定因素的认识,了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义,蛋白结构改变可导致其,溶解度发生改变,在,pH,pI,时，蛋白带负电，蛋白分子相互排斥,蛋白呈溶解状,在,pH,pI,时，蛋白带正电，蛋白分子相互排斥,蛋白呈溶解状态,实验原理,在,pH=,pI,时，蛋白不带电，蛋白溶解度最低(,注:不一定沉淀,),蛋白的可逆沉淀:结构可以恢复(非变性),蛋白带电性质的改变所引起的,溶解度发生改变,蛋白的不可逆沉淀:结构不可以恢复(变性),蛋白经高温加热,盐析和特定条件下的乙醇作用(低温和短时间),蛋白和重金属作用:如硝酸银,蛋白和某些有机酸作用:如三氯乙酸,试剂和器材,试剂,&,新鲜鸡蛋,&,0.4%,酪蛋白醋酸钠溶液,取,0.4,g,酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质悬胶液移入,200,mL,锥形瓶内，用少量,40,-,50,的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。加入,10,mL,1mol/L,醋酸钠溶液。把锥形瓶放到,50,水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。将锥形瓶内的溶液全部移到,100,mL,容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。,&,1.00,mol/L、0.10 mol/L、0.01 mol/L,醋酸溶液,&,蛋白质溶液,5%,卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清,：水,=1:9,）,&,pH4.7,醋酸,醋酸钠的缓冲溶液,100,mL,3%,硝酸银溶液,10,mL,5%,三氯乙酸溶液,50,mL,95%,乙醇,250,mL,饱和硫酸铵溶液,250,mL,硫酸铵结晶粉末,0.1mol/L,盐酸溶液,300,mL,0.1mol/L,氢氧化钠溶液,300,mL,0.05mol/L,碳酸钠溶液,300,mL,甲基红溶液,20,mL,器材,水浴锅,温度计,200,mL,锥形瓶,100,mL,容量瓶,吸管,试管及试管架,乳钵,实验操作,酪蛋白等电点的测定,&,取同样规格的试管,4,支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀。,试管号 蒸馏水,0.01 mol/L,醋,酸,0.1 mol/L,醋,酸,1.0 mol/L,醋,酸,pH,混浊程度,(,mL,),(,mL,),(,mL,),(,mL,),1 8.4 0.6 5.9,2 8.7 0.3 5.5,3 8.0 1.0 4.7,4 7.4 ,1.6,3.5,&,4支试管中各加,4%,酪蛋白醋酸钠溶液,1,mL,并马上,摇匀。观察其混浊程度。静置,10,min,后，再观察其混浊度。最混浊的一管,pH,即为酪蛋白的等电点。,蛋白质的沉淀及变性,蛋白质的可逆沉淀,盐析:无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）能析出蛋白质。,加蛋白质溶液,5,mL,于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数,min,观察是否有沉淀,为什么？(,沉淀为球蛋白,)。,倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？,将管内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止。观察是否有沉淀,为什么？(,沉淀为清蛋白,)。,蛋白质的不可逆沉淀,&,重金属离子沉淀蛋白质 重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。,取,1,支试管，加入,4%,酪,蛋白醋酸溶液,2,mL,，,再加,3%,硝酸银溶液,1,-,2,滴，振荡试管，,观察是否有沉淀,为什么？,如有沉淀产生。倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？,&,某些有机酸沉淀蛋白质,取,1,支试管，加入,4%,酪蛋白醋酸溶液,2,mL,，,和,1,ml 5%,三氯乙酸溶液,，振荡试管，,观察是否有沉淀,为什么？,如有沉淀产生。倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？,&,有机溶剂沉淀蛋白质,取,1,支试管，加入,4%,酪蛋白醋酸溶液,2,mL,，,再加入2,mL95%,乙醇。观察沉淀的生成（如果沉淀不明显，加点,NaCl,，,混匀)。,如有沉淀产生。倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？,&,乙醇沉淀蛋白质,取,3,支试管，,取3支试管，编号。依下表顺序加入试剂,摇匀并观察是否有沉淀生成：,试管号 蛋白溶液,0.1 mol/L,NaOH,0.1 mol/L,HCl,95%,乙醇,pH4.7,(,mL,),(,mL,),(,mL,),(,mL,),缓冲液(,mL,),1 1 1 1,2 1 1 1 ,3 1 1 1 ,以上3,支试管再分别加入以下试剂,观察颜色和沉淀现象,试管号,水,甲基红,0.1 mol/L,醋酸,0.05 mol/L,碳酸钠,0.1 mol/,LHCl,(,mL,)(,滴),1 8 ,2 8 1,滴,(,观察颜色)用,醋酸中和,pH,数,滴,3 8 1,滴,(,观察颜色),用碳酸钠中和,pH,数,滴,