单胞藻培养.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四节 单细胞藻类的培养方式和设备,1,、培养方式,按培养的场所分室内培养和室外培养,按培养基的形态分固体培养和液体培养,按培养的纯度分,纯种培养和单种培养,按藻液的流动情况分静止培养和循环流动水培养,按气体交换情况分充气培养和不充气培养,按采收方式分,一次培养、连续培养和半连续培养,按藻液与外界接触程度分,封闭式培养和开放式培养,按培养规模和目的分,小型培养、中继培养和大量培养,（,1,）纯培养和单种培养,纯培养（,axenic,culture,）,：,是无菌培养，指排除了包括细菌在内的一切生物的条件下进行的培养。,纯培养操作要求十分严格，要求有无菌室、超净台等设备，容器、工具、培养液等均须彻底灭菌。培养成功率很高，是进行科学研究不可缺少的技术。,单种培养（,single-species culture,）,：,指区别于纯培养的不排除细菌存在的培养（可以是生产性的，也可以是非生产性的）,回培养方式,（,2,）封闭式培养和开放式培养,封闭式培养（,closed culture,）,：,指把培养液密封在透明的容器中，与外界空气隔离，暴露在阳光中，,CO,2,完全采用人工供给的方法。,封闭式循环培养装置，封闭培养瓶等；,我国生产上常应用封闭式塑料薄膜袋培养，方法简单，成本低、培养的藻细胞密度大，不易污染且生产周期短，效果很好，目前在生产上应用很多。,开放式培养,：指把藻类培养在开敞容器中，如广口玻璃瓶、水族箱、玻璃钢水槽、水泥池等。,一般是在水泥池中，是目前培养单胞藻的主要方式。因光照充足、通风较好，藻细胞生长繁殖迅速，但与外界接触面大，易污染。,封闭式薄膜装置,封闭式薄膜装置,回封闭,式培养,（,3,）一次培养、半连续培养和连续培养,一次培养（,batch culture,）,：,又称有限培养（,culture of limited volume,），,是在一定的容器中，接入少量藻种，在适宜的环境条件下培养，待藻细胞达到一定的密度后，便一次性采收或进一步扩大培养。,一次性培养是单细胞藻类培养中最常用的方法。,半连续培养（,semi-continuous culture,）,：又称间收培养。是在一次性培养的基础上，当培养的藻液达到一定密度后，每天采收一部分，并加入新的营养液，继续培养。,半连续培养是生产上单胞藻大量培养中常用的方法,，每天的收获量根据需要及藻液的生长情况而定。,连续培养,（,continuous culture,）,：,是在培养容器内，新的培养液不断流入，达到一定密度的培养液不断流出。培养液的流入量和流出量可根据微藻的生长情况及需要进行人为控制，保持平衡。,一般在在室内进行，采用自动控温、人工光源、封闭式通气培养。在培养过程中，营养物质浓度和藻类细胞密度相对稳定，环境因子变化较小。,连续培养可通过人为调节，始终控制藻类的生长在指数生长期，大大提高生产效率，产量高，但要求较高的自动化程度和较复杂的和生产设备。,连续培养在国外应用较多，我国目前应用很少。,国外连续培养两种最普通的方式为,“,恒浊器,”,和,“,恒化器,”,。,恒浊器是人为确定藻液收获密度，由光电仪器自动监测，当培养容器中藻细胞超过规定数值，藻液自动流出，新培养液同时流入，自动化仪器不断调整流出率，保持藻液细胞密度相对稳定；,恒化器是以一种重要的营养物质（如硝酸盐）的浓度为指标，当这种营养物质的浓度降到某一水平时，收获一定量的藻液，同时加入等量的含有一定数量的营养物质的培养液，保持培养容器中藻细胞生长率的稳定。,回培养方式,（,4,）小型培养、中继培养和大量培养,小型培养,：又称保种培养或,一级培养,，目的是培养和供应藻种（进行纯藻种的分离、培养、保存和开展科学研究等）。一般采用封闭式不充气一次性培养方式，培养容器一般采用,100,3000ml,的三角烧瓶。,中继培养,：又称,二级培养,，目的是藻种扩大培养，供应生产性大量培养的藻种。一般在室内大的玻璃容器或塑料大袋中进行。根据需要可分为一级中继培养和二级中继培养。,一级中继培养常用,10,20,升的细口瓶、大口玻璃瓶或钢桶、鱼苗袋等，封闭或开放，充气或不充气，一次性培养方式。,二级中继培养一般为,0.2,0.4m,3,的水族箱，,0.5,1.0m,3,的玻璃水槽、水泥池或塑料薄膜袋等，开放式充气一次性培养方式。,大量培养,：也叫生产性培养或,三级培养,，目的是为培养动物提供大量单胞藻饵料。,有室内和室外两种。,目前主要采取,室内、开放式、通气、一次性或半连续培养法,，培养容器有大型玻璃钢水槽、大型水泥池或塑料薄膜袋等（也有用土池）。,回培养方式,2,、培养设备与设施,单胞藻,培养设备与设施主要包括：,工作室,培养容器,培养室与培养池,水处理系统,充气系统,（,1,）工作室,工作室是饵料培养工作人员进行单胞藻培养经常性工作的地方，常位于车间的一端。,工作室配备显微镜、常用仪器、工具、试剂、药品、肥料等；,工作室附设一保种间和一清洗消毒间。,保种间主要进行藻种的分离、保存和培养等工作，面积视培养规模而定，一般为,10,20m,2,，,配有空调、冰箱、具人工光源的培养架等；,清洗消毒间，主要供少量海水和容器、工具等消毒用，设有清洗水池、消毒池、灭菌锅、电炉等面积一般,10,15m,2,。,回培养设备,（,2,）培养容器,小型培养中常用的培养容器主要有：,三角烧瓶。容量,100,5000ml,等，主要用于小型培养；,广口玻璃缸（俗称糖果缸）。容量,8,10L,，,用于中继培养；,玻璃细口瓶。容量,10,20L,，,用于中继培养；,玻璃水族箱（玻璃钢桶）。用于中继培养；,透明塑料袋。农用薄膜制成，用于中继培养和大量培养。,回培养设备,保种,多用,100ml,的三角烧瓶，开始扩种时，培养容器逐步扩大。,100ml 250ml 500ml 3000ml 5000ml,三角烧瓶的优点是瓶口小，不易落入孢子，不易被污染。可以煮沸消毒，也可以在烘箱中消毒。,（,3,）培养室和培养池,培养室是进行中继培养和大量培养的场所。,培养室要求光线充足，一般采用投光率,80,左右的玻璃钢瓦覆盖，四周墙壁均开设大面积的玻璃窗。房子四周应通风、宽畅，避免背风闷热。,培养室内主要设施有培养池、培养容器和操作工具等。,培养池有贴白瓷砖的小型水泥池和一般的大型水泥池。,培养池一般为长方形，平行排列成套，南北走向（避免光的长时间照射）,小型培养池容量从,0.5,10m,3,不等，典型的有,3.5,1.2,0.8m,。,大型培养池较多的是利用育苗池，容量从,5,10m,3,到,40,60m,3,不等。,培养池结构,（,4,）水处理系统,单胞藻培养用水要求比较严格，必须经过过滤或化学方法处理，除去或杀死水中的敌害生物。,水处理系统包括沉淀、水过滤装置和水消毒池。,培养用水的一般处理流程,海水,沉淀,砂滤,脱脂棉,烧开,冷却,过滤器,水消毒池,一级培养,二、三级培养,沉淀,沉淀的主要作用是除去水中的粗大颗粒，降低混浊度，即在重力作用下，依靠悬浮颗粒或液滴与水的密度差进行分离,。,为减少水中浮游植物的繁殖，一般采用暗沉淀。,沉淀时间依据水质不同而异。较清净的水只需几小时，一般在,24h,后进行过滤；较混浊的海水一般进行,24h,以上的预沉淀（一级沉淀），再,48,96h,以上的沉淀后过滤。,沉淀池应建在较高处，兼作高位水池。一般呈长方形或圆形，高一般,2.5,3 m,左右。顶部设进水口和溢水口，池下部设排污口和供水口。,砂滤,滤水装置的主要作用是滤去水中的杂质、原生动物、轮虫、桡足类等小型生物及部分微生物。目前生产上常用的滤水装置有,砂滤池,、,筛绢加脱脂棉,、,陶瓷过滤器,三种方法。,砂,滤是水经,沉淀（一般在,24,48h,以上）后的第一次过滤，是育苗场必备的水过滤装置。,南方多用砂滤池，北方多用砂滤罐。两者作用原理与结构基本相同，但砂滤池常为开放形系统，依靠水的自身重力作用通过砂滤层，过滤速度较慢；砂滤罐为封闭形系统，水在较大压力下过滤，效率较高，但砂滤面积一般较小，总体速度仍较慢。（过滤速度由砂滤池面积决定）,砂滤池,砂滤池,主要有圆形和方形两种，大小、规格各育苗场不一。,砂滤池结构,粒径 厚度,细砂,0.1mm 60,80cm,2,3,层网目,0.1mm,的筛绢网布,粗砂,3,4mm 8,10cm,1,层网目,1mm,的胶丝网布,碎石,2.5,3.5cm 5,8cm,1,层网目,1,2mm,胶丝网布,筛板,筛孔,2cm 5cm,砂滤原理,砂滤池清除敌害生物的作用,主要依靠细砂层,，即真正起过滤作用的是细砂层。,粗砂层和碎石层的作用有两个方面：,（,1,）支撑作用,（,2,）使空隙由细砂、粗砂、碎石、筛板到池底蓄水间逐步扩大，容水量逐步增加，加快流水的速度，形成连续的水流由水管流出。,砂滤因细砂间的空隙较大，只能除去大型生物和非生物碎块，,一般,10,15u,以下的微小生物较难滤除,。,砂滤水还不符合单胞藻培养用水的要求，需进一步过滤或进行水消毒。（目前也有较多采用二次砂滤，效果较好，二次砂滤水，用于大量培养单胞藻，几乎不用消毒。）,水消毒池,由于砂滤清除敌害生物不彻底，砂滤水需经化学药品再消毒处理。,一般中等规模以上的生产单位，应建专用的水消毒池，且最好有两个，以交替进行消毒和供应培养用水。,无条件单位，可用饵料培养池代替水消毒池。,（,5,）充气系统,鼓风机,+,空气过滤器,罗茨鼓风机,空气过滤器,充气管和散气石,一般供气管采用塑料硬管，池内充气管采用塑料软管。,散气石采用低标号（如,80,号）的炭化硅胶气石,第五节 单细胞藻的培养方法,单胞藻的培养过程,可分为五个步骤：,1,、消毒,（,1,）容器、工具的消毒,（,2,）水的消毒,2,、,配制培养,液,3,、,接种,4,、,培养管理,5,、,收获,单胞藻培养的一般工艺程序,1,、容器、工具的消毒,单胞藻的纯,培养，容器、工具和培养基等都必须经过严格灭菌；,生产性单种培养，只须达到消毒效果。,消毒只杀死营养体，不杀死牙胞。,灭菌是杀死一切微生物，包括营养体和牙胞；,容器和工具常用的消毒方法有加热消毒法和化学药品消毒,法。,（,1,）加热消毒,加热消毒法是利用高温杀死微生物的方法。因此，不耐高温的容器、工具如塑料和橡胶制品不能用此法消毒。,加热消毒法主要有：,直接灼烧灭菌。直接在酒精灯火焰上短暂灼烧。简单、方便、快速、效果好，但只适用于小型金属或玻璃工具，如接种环、镊子、小刀、试管口、瓶口等；,煮沸消毒。,5,10min,。,烘箱干燥消毒。,120,，恒温,1h,。,加热消毒法主要用于小型培养（一级培养）,。,（,2,）化学药品消毒,生产性大量培养中，大型容器、工具、玻璃钢和水泥池等，一般都用化学药剂消毒。常用消毒剂有：,酒精,（,C,2,H,5,OH,）：,能使生物蛋白质脱水变性凝固。一般用浓度,70,的酒精。用于一级培养的中、小型容器的消毒。,洗液：,15g,重铬酸钾,+200ml,浓硫酸,，搅匀，倒出上清液，常用于一级培养的玻璃容器的洗涤。,高锰酸钾,（,KMnO,4,）：,是一种强氧化剂，使蛋白质变性，杀菌能力很强。,10,20ppm,，,5,10min,。,用于二、三级容器、工具。,漂白粉,Ca,（,ClO,）,2,：,又称氯石灰，在水中释放氯气和初生氧，有强杀菌作用。成本低，消毒也比较彻底，是生产上二、三级培养池和大型容器、工具常用的消毒方法。,工业用漂白粉一般含有效氯,30,35,，消毒时按,100,300ppm,的有效氯含量配成水溶液，容器、工具浸泡,30min,以上，消毒水冲洗,2,3,次即可；培养池消毒，用高浓度浆糊状洒淋池壁，半小时后用消毒水冲洗干净。,市售漂白精一般含有效氯,70,，比漂白粉高一倍，其使用参照漂白粉。,2,、水的消毒,培养单胞藻用水必须经过严格的消毒，以防敌害生物的污染。通常在选择消毒方法时，必须考虑以下几个方面：,能够达到杀灭敌害生物的目的；,经消毒处理后的水必须无毒，对藻类的生长、繁殖无不良影响或影响不大；,对三级培养所采取的方法必须能够在有限时间内对大量水进行消毒而不影响生产；,消毒方法必须经济、简单、易行,。,常用水消毒方法,（,1,）烧开。用于一级培养。,（,2,）过滤。砂滤，过滤器，脱脂棉，超滤膜。,（,3,）紫外线消毒。浸入式紫外线消毒器，消毒效果较好。,砂滤水以一定的流速经过紫外线消毒器，即完成水的消毒。,（,4,）漂白粉消毒,漂白粉消毒是生产上最常用的水消毒方法。,漂白粉消毒原理,NaOCI+H,2,O,NaOH+Cl+O,NaOCl+CO,2,+H,2,O,HClO+NaHCO,3,漂白粉浓度,80,100ppm,有效氯,漂白粉消毒具体方法,漂白粉处理,12,24h,加入等量,硫代硫酸钠清除余氯,强充气并经,2h,沉淀后,吸取上清液作培养用水。,硫代硫酸钠中和原理,2Na,2,S,2,O,3,.5H,2,O+Cl,2,2NaCl+Na,2,S,4,O,6,+10H,2,O,如果没有中和而接种，藻液会很快变色发白而死亡。,检验余氯的常用方法是用,硫酸,-,碘化钾,-,淀粉试液,。,容器、工具和水消毒方法总结,一级培养（保种培养）：,金属器具和试管口、瓶口：直接灼烧,玻璃器皿：洗液,+,烘箱,纸、棉花、纱布：烘箱,培养用水：砂滤水,脱脂棉,煮沸,冷却,二、三级培养（中继、大量培养）：,容器、工具：漂白粉：,100,300ppm,高锰酸钾：,10,1-200ppm,，,5,10min,培养用水：砂滤水,漂白粉处理,硫代硫酸钠中和,回培养方法,3,、配制培养液,配制培养液是根据培养藻类对营养的要求，选用合适的配方，在消毒水中按配方加入各种营养物质。,（,1,）培养液的成分,（,2,）营养元素的浓度,（,3,）培养液的配方,（,4,）培养液的配制,回培养方法,（,1,）培养液的成分,配制单胞藻培养配方的注意事项,特异性。不同的单胞藻，对营养元素的需求有所不同，同时，不同的营养元素及不同的营养盐的种类对不同的单胞藻所起的作用也有所差别。,需要在清楚了解不同藻类对营养物质的需求基础上（通过一定的试验）研制不同的培养液配方。,共性。各种藻类对营养的需要有很多共同点。,一些培养液的配方，能应用于多种藻类的培养。,培养液的主要成分,大量元素,微量元素,辅助生长有机物质,土壤抽出液,络合剂,植物生长调节剂,缓冲剂,不是所有单胞藻培养液都必须具备这七类成分，其中,最重要而且是必不可少的是大量元素，其次是微量元素和辅助生长有机物质,，其他成分只在某些培养液配方中使用其中的一类或两类。,必需元素,必需元素,必需元素是单胞藻在生长发育过程中不可缺少的元素。,按其存在于植物体内的数量多寡分为大量元素和微量元素。,二者具有同等的重要性，而且不能相互替代，对于植物的生长和发育都各有其一定的功能，各元素之间也存在着一些作用。,微量元素在培养液中所需量很小，但又不能没有。,大量元素和微量元素,大量元素有：碳（,C,）、氢（,H,）、,氧（,O,）、氮（,N,）、磷（,P,）、铁（,Fe,）、钾（,K,）、镁（,Mg,）、硫（,S,）、,钙（,Ca,）,等，硅藻类还必须有硅,（,Si,）。,微量元素种类很多，但常用的约十余种。如硼（,B,）、锰（,Mn,）、锌（,Zn,）、铜（,Cu,）、钼（,Mo,）、铝（,Al,）、碘（,I,）、锶（,Sr,）,等。,大量元素,大量元素也叫主要营养元素或主要元素。,在大量元素中，其中最重要、需要量较大的有碳、氢、氧、氮、磷、铁等,6,种。,碳、氢、氧,3,种可从水、空气中取得，氮、磷、铁,3,种要从水中或土壤中的若干化合物中取得，来源不及前,3,种丰富，人工培养时必须补充。硅藻类培养还必须补充硅。,因此，,在人工培养中，需补充的大量元素主要是,氮、磷、铁、硅,4,种元素,。,大量元素的来源用效用,氮源及其效用,磷源及其效用,铁源及其效用,硅源及其效用,其它元素,P,58,氮源,及其效用,氮是植物蛋白质的主要组成成分，对植物的生长发育具有重要的意义。氮源是否充足对微藻的培养至关重要。,生产上常用的氮源：,硝酸钾（,KNO,3,）,硝酸钠,（,NaNO,3,）,硝酸铵,（,NH,4,NO,3,）,硝酸钙,Ca,（,NO,3,）,2,尿素,（,NH,2,）,2,CO,氯化铵,（,NH,4,Cl,）,硫酸铵,（,NH,4,）,2,SO,4,发酵人尿,单胞藻对氮元素的利用,（,1,）氮元素的存在形式,无机态氮,：,硝酸态,氮（,NO,3,-,-N,、,NO,2,-,-N,）,铵,氮（,NH,4,+,-N,、,NH,3,-N,）,有机态氮,：尿素,有效氮,：能被藻类利用的无机态或有机态氮。,（,2,）氮的转化,氨化作用：含氮有机物转化为游离态氮,硝化作用：铵氮转化为硝酸态氮；,脱氮作用：缺氧情况下，硝酸态氮转化为,NO,2,或,N,2,。,（,3,）单胞藻对氮的吸收方式,不同的藻类对硝酸态氮和铵氮的吸收利用情况不同。,大多数单胞藻能吸收无机态氮，但对硝酸态氮和铵氮吸收的速度和利用的情况有差异，,优先吸收铵氮,（吸收完后再吸收,NO,3,N,）。,少数藻类（如小球藻等）能吸收有机态氮。,硝酸态氮培养单胞藻较好。培养小球藻，尿素的效果比硝酸盐好。,生产中，一般,一级培养多用硝酸钾和硝酸钠，二三级培养多用尿素,。应尽量避免使用会导致藻液中铵氮上升的氮源。,（,4,）硝酸态氮、铵氮和尿素的优缺,硝酸态氮缺点：,往往会引起脱氮作用（,NO,3,缺,O,N,2,）。,有铵氮存在时，会影响吸收。,铵氮缺点：,具毒害作用。特别是对养殖对象的毒害远超硝酸态氮，当其在水中浓度超过,0.025ppm,就对鱼类有毒害作用；,微量铵氮存在，会影响硝酸态氮和有机态氮的吸收，造成这些氮的浪费；,铵氮优先吸收，但吸收后的生长率并不比硝酸态氮和有机态氮好。,尿素缺点：,对某些藻类有毒害作用；,后吸收；,有,NH,3,-N,存在时，尿素效用大大减弱；,磷源,及其效用,磷是组成核酸、能量转换物质、脂类物质和维生素等不可缺少的元素之一，对植物的生命活动有重要意义。,生产中常用磷源：,磷酸二氢钾,（,KH,2,PO,4,）,磷酸氢二钠（,Na,2,HPO,4,）（其次）,磷酸二氢钠（,NaH,2,PO,4,）,磷酸氢二钾（,K,2,HPO,4,）,过磷酸钙,重过磷酸钙,磷酸铵（商品名：安福,粉）,单胞藻对磷元素的利用,（,1,）磷元素的存在形式,溶解磷,：能通过某种固定超滤膜过滤的磷；,不溶解磷,：不能通过某种固定超滤膜过滤的磷；,活性磷,：能被钼兰法测定出来的磷；,非活性磷,：不能被钼兰法测定出来的磷；,活性磷有：,无机正态磷：有四种形式,H,3,PO,3,、,H,2,PO,3,-,、,HPO,3,2-,、,PO,3,3-,在,PH6.5,9,时，主要以,H,2,PO,3,-,、,HPO,3,2-,形式存在。,聚缩磷酸盐：,P,2,O,3,、,P,3,O,4,有机磷：腺磷、脂磷,海水微藻培养液应用磷酸二氢钾（,KH,2,PO,4,），如用磷酸氢二钾（,K,2,HPO,4,），培养液会产生大量沉淀。,铁源,及其效用,铁是,植物体内许多氧化酶所必需的一种元素，且有促进叶绿素作用。,常用铁源：,三氯化铁（,FeCl,3,）,硫酸亚铁,（,FeSO,4,）,硫酸高铁,Fe,2,（,SO,4,）,3,氧化铁,（,FeO,）,柠檬酸铁（,FeC,6,H,5,O,7,）,柠檬酸铁铵,（,Fe,（,NH,4,）,3,（,C,6,H,5,O,7,）,单胞藻对铁元素的利用,微藻对,铁的需要量很小，但要满足这种需要却比其他营养元素更为困难。,（,1,）铁元素的存在形式,无机态铁,：往往是不溶态的铁，在水中容易形成一种胶体复合物，不能为生物利用，同时容易与其他离子结合形成沉淀。,有机态铁,：可溶性，易为藻类细胞利用。,无机态铁的改善利用,聚缩磷酸盐反应。使不溶态铁转化为溶态铁。,加络合物防止铁和微量元素发生沉淀。常用,EDTA-Na,2,（乙二胺四乙酸钠盐）,加某种有机酸或其盐类以形成可溶性铁化合物。常用有苹果酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸等。,加土壤抽出液。因腐殖酸的作用可阻止铁的沉淀和溶胶化。,使用有机态铁代替无机态铁。,硅源,及其利用,单胞藻,中，特别是硅藻，不但细胞壁（硅酸占,96.5,）需要大量的硅酸来形成，在整个生长发育中（尤其在分裂时）都需要硅，而且不能由其它元素来代替。,常用硅源：,硅酸钠（,Na,2,SiO,3,）,硅酸钾（,K,2,SiO,3,）,偏硅酸钠,（,NaSiO,3,9H,2,O,）,更高度聚合形式的硅化合物不能为硅藻所利用。,其它元素,钾、钙、镁、硫的来源与效用,钾,在生物体内的主要作用不是结构功能，而是代谢功能。它能使原生质胶体保持一定程度的膨胀，且对光合作用、碳水化合物和蛋白质的合成有一定促进作用；,钙,能调节原生质的活动和植物体内的酸碱反应；,镁,是叶绿素的主要组成物质，同时又常与磷酸结合，对植物的生命活动过程起调节作用；,硫,是蛋白质的重要组成成分之一。,钾、钙、镁、硫,元素在培养液中一般不需要单独加入。原因：,（,1,）海水中的自然含量比较丰富，一般能满足要求。,（,2,）在加入其他营养盐的同时，附带加入了该元素。如加入,KNO,3,在补充了氮元素的同时也补充了钾元素。,常用,钾源,：氯化钾,（,KCI,）、,硝酸钾,（,KNO,3,）、,磷酸二氢钾（,KH,2,PO,4,）、,磷酸氢二钾（,K,2,HPO,4,）,常用,钙源,：氯化钙,（,CaCI,2,）、,硝酸钙,Ca,（,NO,3,）,2,常用,镁源,：硫酸镁,（,MgSO,4,）、,氯化镁（,MgCI,2,）,常用,硫源,：硫酸铵、硫酸铁、硫酸镁、硫酸铜、硫酸锰等。,微量元素,常用微量元素化合物,（,P,59,）,硼（,B,）：,硼酸（,H,3,BO,3,）,硼砂,（,Na,2,B,4,O,7,10H,2,O,）（,焦性硼酸钠）,锰（,Mn,）：,硫酸锰（,MnSO,4,）、,氯化,锰（,MnCl,2,）、,氧化锰（,MnO,）,锌（,Zn,）：,硫酸锌（,ZnSO,4,）、,氯化锌（,ZnCl,2,）,铜（,Cu,）：,硫酸铜（,CuSO,4,）、,氯化铜（,CuCl,2,）,钼（,Mo,）：,钼华（,MoO,3,）,钼酸铵,（,NH,4,）,2,O,7MoO,3,常用微量元素化合物,钴（,Co,）：,氯化钴,（,CoCl,2,）,钛（,Ti,）：,氯化钛（,TiCl,2,）,钨（,W,）：,钨酸钠（,Na,2,WO,4,）,铬（,Cr,）：,硫酸铬钾,CrK(SO,4,),2,、,铬酸钾,（,K,2,CrO,4,）,镍（,Ni,）：,硫酸镍,（,NiSO,4,）,钒（,V,）：,钒酸钠（,NaVO,3,）、,钒酸铵（,NH,4,VO,3,）,镉（,Cd,）：,氯化镉（,CdCl,2,）,锶（,Sr,）：,硫酸锶,（,SrSO,4,）,辅助生长有机物质,辅助生长有机物质：,培养液中对单胞藻的生长有辅助促进作用的有机物质。,目前常用的有,4,类：,（,1,）,维生素类,：维生素,B,1,、,维生素,B,2,、,维生素,B,6,、,维生素,B,12,、,维生素,H,、,生物素、烟酸、叶酸等。其中对单胞藻类影响较显著的是,B,族维生素，尤其对等鞭金藻的培养非常重要。,（,2,）,抗生素类,：链霉素、红霉素、土霉素、金霉素等。抗生素对单胞藻生长有促进和抑制两方面的作用，目前对它的研究较弱，生产上尚未大量使用。,（,3,）,生长素和生长物质类,：萘乙酸、吲哚乙酸、赤霉素、秋水仙素、核酸等。,（,4,）,其他,：葡萄糖、有机酸盐、肝抽出物、酵母抽出物、贝肉汤、鱼粉、咸鱼汁、氨基酸等。,土壤抽出液,土壤抽出液除含有无机微量元素外，还含有某些单胞藻类需要的辅助生长有机物质（腐殖酸及其盐类）。,培养液中加入适量的土壤抽出液，一般能获得良好效果，尤其是对一些较难培养的种类，常能获得培养成功。,土壤抽出液因处理过程不同，其营养的成分和数量变化较大。,（,1,）,取用土壤或海泥时，必须固定地方，不要经常更换。,（,2,）,对培养效果和使用量，均应通过培养试验来掌握了解。,土壤抽出液的制作,常用的方法（,P,60,）,1,土壤抽取液,I,土壤,1,千克加,1,升纯水，煮沸,60,分钟，暗处放置两天后过滤，取滤液,500,毫升加纯水,400,毫升使用。,2,土壤抽取液,土壤,1,千克加纯水,1,升，再加入,NaOH,2,3,克，煮沸,120,分钟，冷却过滤后使用。,3,土壤抽取液,土壤,1,千克加纯水,2,升，煮沸煎浓，次日取上清液再煮沸煎浓，第三天如法炮制，直到得到,1000,毫升深褐色土壤抽取液。,4,海泥抽取液,取海滩上砂质较少，有机质较多而又不是过分淤黑的上层软泥，清除其中的小石块等杂物，以容量计算一份海泥加海水或淡水,2,份，静置,1,2,分钟，弃去底部粗砂、小石块等杂物，按每,1000,毫升泥浆加入,1,克氢氧化钠的量加入氢氧化钠，煮沸,20,30,分钟，静置,24,小时取上清液使用。,络,合剂,络,合剂的主要作用是使之与无机态铁等微量金属离子结合形成络离子，以防产生沉淀。络合离子能根据质量作用定律不断释放出金属离子为微藻所吸收利用。,最常用的络合剂有：乙二胺四乙酸（,EDTA,）,或其钠盐（,EDTA-2Na,）,植物生长调节剂,植物生长调节剂：又称植物生长激素，有促进藻类细胞生长繁殖的作用。,（,2,）营养元素的浓度,单胞藻,培养液中营养元素的浓度依单胞藻的种类、培养目的、培养方式、培养条件等情况的不同而各不相同。但在一个大体范围内又具有许多共同点。,生产上主要施加氮、磷、铁、硅四种元素，一般根据不同的情况选用,低量、中量、高量三,种不同的浓度。,回配制培养液,氮、磷、铁、硅的浓度,元素,低量,中量,高量,氮,5-15,15-30,80,KNO,3,3-50,100-200,400-500,磷,0.1-1,1-4,4,K,2,HPO,4,1-5,10-20,200,铁,0.02-0.04,0.05-0.1,0.3,FeCl,3,0.1,0.2-0.3,0.8-1,硅,2-15,20-70,Na,2,SiO,3,10-50,根据元素浓度，通过分子量换算出化合物的浓度,单位：,ppm,（,3,）培养液的配方,P,61,一些培养液配方是较普遍适用的，有一些是针对某一种或几种单胞藻而定的。有些配方只要加入几种特需的营养元素就可适用不同的单胞藻类。,生产中培养液的配方，常以这些配方为基础，再结合实际情况不断进行调整。一般控制主要元素浓度之间的比例为：,N,：,P,：,S,：,Fe=10,：,1,：,1,：,0.1,回配制培养液,3,母液（浙江水产学院）配方,药品,用量,药品,用量,KNO,3,100g,EDTA-Na,2,20g,KH,2,PO,4,10g,VB,1,6mg,FeSO,4,2.5g,VB,12,50ug,MnSO,4,0.25g,蒸馏水,1000ml,为通用配方，适合培养多种藻类,（,4,）培养液的配制,母,液,：为减少每次称量的麻烦，根据配方配成的浓营养溶液。母液是培养液的浓缩。,通常在配制培养液时以每,1000mL,水中加入母液,1mL,为宜,(1:1000),。如配方,中,KNO,3,用量为,100g/L,，,母液每毫升就应含,KNO,3,0.1g,。,贮液,：固体营养元素为减少每次称量的麻烦和使用方便而配成的重量百分比溶液。,如配,1,KNO,3,贮液，,100ml,水加,1gKNO,3,。,贮液,可以是单项营养元素配成，也可以是两种或多种营养元素同配而成，但要尽量防止沉淀。,回配制培养液,培养液的配制用水,培养液的配制有用纯水（无离子水或蒸馏水）和天然淡、海水配制两种方法。,用纯水配制的培养液，营养元素种类必须齐全，使用的化合物较多，主要用于科学研究或保种，而一般的实验室培养和生产性培养都使用天然淡、海水配制。,天然淡、海水是水生生物长期适应于其中生活的优良环境，已存在着植物需要的各种营养物质，因此在配制时只需增加某些在培养中可能引起缺乏的营养元素就成。在生产性大量培养中往往只加入最主要的几种营养元素，且不要求使用纯度较高的化学试剂，可使用工业纯和农肥。,培养液配制中的注意事项,1,、保种用的营养盐应用试剂级（,A,R,或,C,P,）。,一般生产性培养只需选用纯和工业纯。,药品试剂规格,保证试剂：,G.R,分析纯：,A.R,化学纯：,C.P,纯：药典规格,工业纯：杂质较多,2,、营养元素的加入要有一定的顺序，一般先加,N,，,再加,P,，,后加,Fe,。,同时，,Fe,应在,EDTA,之后加。,3,、维生素溶液的配制要将各种维生素分别溶解后再混合。若培养用水是加热消毒，一定要待冷却后才能加入。,4,、每加入一种营养元素，要搅拌均匀后再加入第二种。,4,、接种,接种就是把选为藻种的藻液接入新配好的培养液中。,接种时应注意的三个问题：,（,1,）,藻种质量,（,2,）,接种数量,（,3,）,接种时间,回培养方法,（,1,）藻种质量,藻种质量，对培养效果影响很大，一般要求选取生活力强，生长旺盛的藻种。,常用判别藻种的质量主要从外观和镜检二个方面考虑。,外观：三看,第一看颜色是否正常，正常情况下，绿藻类呈鲜绿色，硅藻类呈黄褐色，金藻类呈金褐色；,第二看水中分布情况，有运动能力的种类上浮活泼运动；无运动能力的种类均匀悬浮于水中；,第三看附壁和沉淀情况，好的藻种无明显附壁，无大量沉淀。,镜检：好的藻种细胞颜色鲜艳，运动种类运动活泼，无杂藻和敌害生物存在。,回接种,（,2,）接种数量,接种藻液的浓度,藻种藻液的细胞数量应达到收获的浓度或接近收获的浓度。,一是藻种处于指数生长期，生长繁殖旺盛；,二是利用藻细胞分泌的较大量的胞外产物对污染生物进行抑制。,常用培养种要求达到的藻种密度：,亚心形扁藻：,30,40,万个细胞,/ml,以上,三角褐指藻：,300,万个细胞,/ml,以上,球等鞭金藻：,250,万个细胞,/ml,以上,回接种,接种比例,接种比例为藻种藻液量与培养液量的比例。,接种比例大，可使培养液中的藻类一开始就占优势，有两方面作用：,一是可对其他可能污染的生物起抑制作用；,二是可缩短培养周期。,在环境因子不很适宜，藻类生长不良，敌害生物大量出现的可能性较大时，高比例的接种量尢为重要。,接种比例,保种培养一般为,1,：,1,小型培养一般为,1,：,2,1,：,3,；,中继培养和生产性大量培养可根据具体情况灵活掌握，一般以,1,：,3,1,：,6,为宜，最好,1,：,1,。若培养条件良好而藻种不足，也可在,1,：,10,1,：,20,。,一般根据藻种浓度和预定的接种比例确定。,N,1,V,1,=N,2,V,2,N,1,藻种细胞浓度,V,1,藻种用量的体积,N,2,接种后培养液的藻种浓度,V,2,接种后培养液的体积,生产性大量培养的接种方法,培养池容量大，藻种供应不足时，可采用,分次加入培养液,的方法，既解决不足，同时对藻类的生长繁殖效果比一次培养好。,如一个,20m,3,水容量的培养池，如一次按,1,：,1,的高比例接种，需藻种,10m,3,，,而采用两次加培养液，只需藻种,5m,3,。,第一次加培养液,5m,3,，,接藻,种,5m,3,，,总水量为,10m,3,，,即培养池的一半，培养,3,4,天达较大密度后再加培养液,10m,3,，,继续培养，这样始终保持,1,：,1,的高比例接种量。,（,3,）接种时间,一般接种时间最好是在,上午,8,10,点,进行，不宜在晚上接种。,晚上有不少藻细胞沉底，而白天藻细胞趋光上浮，特别是具有运动能力的藻类更明显。上午,810,点一般是藻细胞上浮明显的时候，此时接种可以吸取上浮的运动能力强的藻细胞做藻种，而弃去底部沉淀的藻细胞（此类藻细胞往往活力较弱），起着择优选种的作用。,5,、培养管理,单胞藻的,培养管理包括三个方面：,（,1,）,日常管理工作,（,2,）,生长情况的观察和检查,（,3,）,出现问题的分析处理,回培养方法,（,1,）日常管理工作,搅动和充气。,作用表现在三个方面：,（,1,）增加水和空气的接触面，使空气中更多的二氧化碳溶解到水中，补充由于藻类细胞的光合作用对二氧化碳的消耗；,（,2,）防止水表面产生菌膜；,（,3,）使藻类细胞均匀受光，使藻类细胞均匀分布，帮助沉淀的藻细胞上浮而获得光照。,不同培养法应根据具体情况分别采用摇动、搅动和充气的方法。,小型培养采用摇动培养瓶的方法；,大口玻璃缸开放式培养采用棒形工具搅动的方法；,塑料薄膜袋封闭式培养、玻璃钢桶以及水泥池开放式培养采用充气方法。,摇动和搅动每天至少进行三次，定时进行，每次半分钟左右。充气一般通入空气，用罗茨鼓风机、小型充气泵或无油的气体压缩机。充气时要对空气进行过滤，使气体先通过空气过滤器，然后再通入藻类培养液中。,调节光照,光照适合与否，对藻类的生长关系很大。,大多,单胞藻类不能忍受强烈的直射阳光,。,一般饵料培养室的顶部都用玻璃钢瓦采光，中午自然光比较强时，可用白布进行遮光；自然光较弱时，需增加人工光源，常用的人工光源有日光灯、碘钨灯、生物效应灯等。,控温,每一种藻类都有其适应温度范围和最适温度范围。,目前绝大多数饵料培养室还不具备控温条件，顺从自然温度的变化，在不同季节选择能适应或能基本适应当地温度变化的培养种。,一般高温对培养藻类生长不利，在夏季室内培养时，须把门窗打开通风降温，必要时需增加换气扇或风扇等设备。如果气温急降，须关闭门窗，防止温差过大。,注意酸碱度的变化（测定,PH,）,藻类细胞大量繁殖后，因大量吸收,CO,2,，可导致藻液,PH,值上升。同时，一些营养元素的吸收，也会引起,PH,值的上升或下降。,培养藻类对酸碱度都有一定的适应范围，,PH,值过高或过低都会对藻类细胞的生长繁殖产生影响。,培养过程中，最好每天测定,PH,值并掌握其变化规律。发现,PH,值过高或过低，可用,1N,的,HCl,或,NaOH,调节。,正常情况下，一般海水,PH,为,8.0,左右，接种后约为,8.4,8.5,，,3,4,天后，升至,9,左右，一星期后达收获密度时约在,11,左右。,防虫和防雨,防虫,主要是防蚊子幼虫（孑孓）和各种水生昆虫。,小型培养池或室外培养池常采用加纱窗布盖来防止。若已有虫，则用小网捞掉。,下雨刮风时应加塑料薄膜盖，防止雨水打入或被风吹入大量泥尘,。,回培养管理,（,2,）,藻类生长情况的观察和检查,藻类培养情况的好坏是培养成败的标准。,在日常管理工作中，每天上、下午必须定时各作一次全面观察（肉眼观察），必要时配合显微镜检查，了解并掌握藻类的生长情况。,藻类生长情况，可以通过培养液呈现的颜色，藻类细胞运动情况，是否有沉淀、附壁现象，菌膜及敌害生物污染迹象的有无等几个方面进行观察了解大体情况。,颜色,绿藻类（扁藻、盐藻等）：,生长发育良好时，随着密度的增加，培养液由嫩绿到深绿色。,如果接种后，颜色由浅到深改变不明显，表明繁殖速度慢；,如果颜色变黄，表明生长不良；,如果出现其他别的色彩，如粉红、乳白、纯蓝等，表明有污染，而且敌害生物已大量繁殖。,硅藻类：,三角褐指藻、新月菱形藻正常生长时藻液呈现褐色，藻体悬浮于水中呈云雾状水团，随着密度的增加，颜色由浅褐色转变为深褐色。,若水色灰暗，藻体下沉，镜检时发现有藻体粘连成絮体，即为生长不良的现象；,如果出现其他特别的颜色，表明有敌害生物的污染。,如果水色变淡，除受强光、高温及敌害生物影响外，肥料不足，也能出现此现象,。,金藻类：,球等鞭金藻、湛江叉鞭金藻生长良好时呈金褐色。,接种后，各种藻类的细胞浓度逐渐增加，正常情况颜色由浅变深。若颜色由深变浅则可能是由于环境因子不适宜,(,如肥料不足、光线过强、温度过高等,),引起的；若出现其他的颜色，如蓝色、黄色、乳白色等，说明被别的藻类污染,。,黄藻类：,异,胶藻,一般是黄绿色，呈悬浮状，细胞在整个藻液中均匀分布，藻液色泽一致，没有分层现象，但也有所变化。,当光照弱、营养不良时，藻液从黄绿色偏向土黄色；,当光照强、营养充足