淀粉酶米氏常数测定(1).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,淀粉酶米氏常数的测定,生物化学实验之八,安徽师范大学生科院生化教研室,一、实验目的,了解并掌握米氏常数的意义和测定方法,二、实验原理,酶促反应,v-S,曲线,推导出米氏方程为：,米氏常数,Km,是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数,Km,往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。,测定,Km,和,Vm,，可通过作图法求得。最常用的,Lineweaver,-Burk,双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即：,以,1/v,对,1/S,作图，可得一条直线，所得直线的截距是,1/Vm,，斜率为,Km/,Vm,。通过,Lineweaver,-Burk,作图法作图后可方便的求出,Km,值。,试管,移液抢,秒表,吸耳球,恒温水浴锅,7200,型分光光度计。,三 仪器和试剂,三 仪器和试剂,试剂,（,1,）酶液：精确称取酶制剂,0.1g(,以大约,2000 U,g,计,),，先用少量,40,蒸馏水溶解、浸提。将上层液小心倾入,500ml,容量瓶内，沉淀再加水捣研。如此重复，最后全部移入容量瓶中，定容后摇匀，用四层纱布过滤，滤液供测试定用,（,2,）原碘液 称取碘,11 g,，碘化钾,(KI)22 g,，先用少量蒸馏水使碘,-,碘化钾完全溶解，定容至,500,mL,，贮于棕色瓶内。,（,3,）稀碘液 取原碘液,2mL,，加碘化钾,20 g,，用蒸馏水定容至,500,mL,贮于棕色瓶内。,（,4,）,4,可溶性淀粉 精确称取可溶性淀粉,4.000g,（精确至,0.001g,），用少量蒸馏水调匀。边搅拌边加入煮水,70mL,，加热煮沸至透明，冷却后定容至,100,mL,此溶液现配现用。,（,5,）,0.02mLpH6.0,磷酸氢二钠,柠檬酸缓冲液,称取磷酸氢二钠,(Na,2,HPO,4,.12H,2,O)45,23g,和柠檬酸,(C,6,H,8,O,7,H,2,O)8.07g,，用蒸馏水溶解，用酸度计或,pH,试纸校正,pH,，定容至,1000,mI,。,（,6,）,0.2moL/L,HCl,取,36%,盐酸（饱和浓盐酸）,0.86ml,加入已加有少量蒸馏水的,50ml,容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀即可。,四、实验操作,1.,淀粉浓度梯度吸光度,不同底物浓度（,0.5%,、,1.0%,、,1.5%,、,2.0%,、,2.5%,、,3.0%,）的可溶性淀粉,4ml,，加入缓冲液,0.75ml,和蒸馏水,0.25ml,，充分摇匀，,60,放置,10min,，立即加入,3.0ml,的,0.2moL/L,HCl,终止反应，然后立即取出,1.00ml,溶液置于,5.00ml,稀碘液摇匀，显色，并以稀碘液作对照，于,660nm,处测定吸光度（按操作表,1,操作）,瓶号,试剂,1,2,3,4,5,6,4%,可溶性淀粉（,ml,）,0.5,1,1.5,2,2.5,3,H,2,O(ml),3.5,3,2.5,2,1.5,1,缓冲液,(ml),0.75,0.75,0.75,0.75,0.75,0.75,蒸馏水,(ml),0.25,0.25,0.25,0.25,0.25,0.25,充分摇匀，,60,放置,10min,加入,3.0ml,的,0.2moL/L,HCl,，,摇匀,取出,1.0ml,溶液置于,5.00ml,稀碘液显色,A660,不同底物,(,可溶性淀粉,),浓度（,0.5%,、,1.0%,、,1.5%,、,2.0%,、,2.5%,、,3.0%,）可溶性淀粉,4mL,，缓冲液,0.75mL,，摇匀后，在,60,水浴中平衡,5 min,，加入,0.25,mL,稀释好的酶液，立即记时，充分摇匀，准确反应,10 min,，立即加入,3.0ml,的,0.2moL/L,HCl,终止反应，然后立即取出,1.00ml,溶液置于,5.00ml,稀碘液显色，摇匀，并以稀碘液作对照，于,660nm,处测定吸光度（按操作表,2,操作）。,2.Km,测定,瓶号,试剂,1,2,3,4,5,6,4%,可溶性淀粉（,ml,）,0.5,1,1.5,2,2.5,3,H,2,O(ml),3.5,3,2.5,2,1.5,1,缓冲液,(ml),0.75,0.75,0.75,0.75,0.75,0.75,60,放置，预热,5min,酶液,(ml),0.25,0.25,0.25,0.25,0.25,0.25,充分摇匀，,60,放置,10min,取出，加入,3.0ml,的,0.2moL/L,HCl,取出,1.0ml,溶液置于,5.00ml,稀碘液，显色,A660,可溶性淀粉量浓度,%,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,s,1/s,v,1/v,酶的反应速度,V,：以单位时间内吸光度的减少量,d(A,0,-A,1,),dt,来表示,以,1/,v,对,1/S,双倒数法作图,计算,Km,值。,3.,数据处理与作图,五、实验注意事项,取液量一定要准确。,反应时间一定要精确。,加酶前后一定要将试剂混匀。,分光光度计的正确使用。,取液器的使用,六、思考题,(1),试说明米氏常数,Km,的物理意义和生物学意义。,(2),为什么说米氏常数,Km,是酶的一个特征常数而,Vm,则不是？,