实验六、七 聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳分离血清蛋白.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,实验六,聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳分离血清蛋白质,指导教师,刘建昌、池雪林,一、目的,1,、掌握聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳的原理、操作方法。,2,、学会用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。,二、原理,“不连续系统”最大的特点在于大大提高了样品分离的分辨率，这种电泳的主要特点是：（,1,）使用两种不同浓度的凝胶系统；（,2,）配制 两种凝胶的缓冲溶液成分及,PH,值不同；（,3,）配胶缓冲液与电泳槽中电泳缓冲液的成分、,PH,值也不相同。在实验中，电泳凝胶分为两层：上层胶为低浓度的大孔胶，称为浓缩胶，成胶的缓冲液是,Tris-HCL,，,PH6.7,；下层胶则是高浓度的小孔胶，称为分离胶，成胶的缓冲液是,Tris-HCL,PH8.9,。电极缓冲液则是,Tris-,甘氨酸，,PH8.3,。可见，凝胶浓度、成胶成分、,PH,值与电泳缓冲液系统各不相同，形成了一个不连续系统。,在不连续系统中电泳时，甘氨酸、蛋白质、盐酸中的氯离子和溴酚蓝等均解离为阴离子，形成离子流向阳极泳动。当电极缓冲液（,pH8.3,）中的甘氨酸离子进入浓缩胶时，,pH,值降到接近于甘氨酸等电点（,5.97,），于是甘氨酸的解离度突然降低，所带电荷明显减少，迁移率减慢。样品中蛋白质成分也进入浓缩胶，,pH,值的改变虽对其解离度有影响，但比对甘氨酸小得多，其迁移率比甘氨酸要大，而且浓缩胶的胶孔较大对蛋白质分子不会造成阻碍。浓缩胶中的,Tris-HCl,中,Cl,离子则全部解离，其迁移率最快。于是在浓缩胶中各种离子的迁移率形成：甘氨酸,蛋白质,溴酚蓝,Cl,离子的顺序。,甘氨酸分子进入浓缩胶后解离度的下降，造成移动离子流的突然缺失，出现电流减少电导率下降，然而整个电泳系统中其他部分的电流仍维持不变，根据电导及电位梯度成反比，于是在前导离子,Cl,与慢离子甘氨酸离子之间突然形成了较高的局部电位梯度。处在这个局部高电位梯度区域中的血浆蛋白质各成分，在高电场作用下迅速以不同的速度泳向前导,Cl,离子区域。当到达前导,Cl,离子区域时因不缺少离子，大的电场强度减弱，离子移动速度急速减慢下来，结果在甘氨酸和,Cl,离子之间的蛋白质样品就按其分子的大小浓缩成层。蛋白质样品浓缩了好几百倍，且蛋白质各成分也按一定的顺序排列成层。,当离子流继续向前，进入以,pH8.9,缓冲液配制的小孔胶时，蛋白质分子在小孔胶里遇到阻力，迁移率减慢，同时在,pH8.9,条件下，甘氨酸又充分解离，其带电量增加，消除了离子流缺失的现象，小分子的甘氨酸离子赶上了蛋白质。凝胶各部分恢复具有恒定的电场强度，蛋白质的分离完全按一般区带电泳方式进行。,不连续电泳最主要的优点就是使蛋白质样品经浓缩胶后，形成紧密地压缩层进入分离胶。蛋白质各成分预先分开且压缩成层，可以减少在电泳时由于自由扩散而造成的区带相互重叠，这样就是提高了电泳的分辨能力。,三、试剂及器材,（,1,）制备两种胶的贮存液：见操作。,（,2,）电极缓冲溶液 取甘氨酸,28.8g,及,Tris6g,分别溶解后，加蒸馏水到,1000ml,，为,pH8.5,。用前稀释,10,倍。,（,3,）染色液：,0.25g,考马氏亮蓝,R250,加入,454ml,甲醇水溶液和,46ml,冰醋酸。,（,4,）脱色液：,75ml,冰醋酸、,875ml,蒸馏水与,50ml,甲醇混合。,（,5,）凝胶电泳玻管：选内径,5,6mm,、外径,7,8mm,、长,80,100mm,光滑均匀的玻璃管。,（,6,）,5,10ml,注射器,（,7,）,10cm,长注射器针头（,7,号）,（,8,）,100l,微量取样器。,（,9,）圆盘电泳槽,（,10,）,0.05%,溴酚蓝,四、操作,1,、凝胶柱的制备,将洗净烘干的玻璃管一端插入疫苗瓶的橡皮帽中，或用其他材料将玻璃管一端封闭。将封闭的一端朝底垂直放于桌面支架上。,按表,6-1,先配制分离胶，在,50ml,干燥小烧杯中按比例加入,1,、,2,号溶液及蒸馏水，放入干燥器中，用水泵或抽气机抽气至溶液中无气泡冒出为止。取出，加入新配制的过硫酸铵，用玻璃棒混匀，及时用皮头滴管吸取胶液灌入玻璃管内约,6.5cm,高。然后立即顺管壁加入,5,10mm,高的水层，以隔离空气加速凝胶的过程。待,30min,既凝聚成胶，此时胶与水之间形成一条明显的界线。倒出胶面上的水，也可用滤纸条吸干。,100ml,溶液中的含量,溶液混合比例,1,号,1mol/L HCl,Tris,TEMED,用浓,HCl,调至,pH8.9,48.0ml,36.6g,0.23ml,分离胶,1,号,1,份,2,号,2,份,H,2,O 1,份,（抽气）,3,号,4,份,凝胶浓度,7.5%,，,pH8.9,2,号,Acr,Bis,30.0g,0.8g,3,号,过硫酸铵,0.3g,100ml,溶液中的含量,溶液混合比例,4,号,1mol/L HCl,Tris,TEMED,用浓,HCl,调至,pH6.7,约,48.0ml,5.98g,0.46ml,分离胶,4,号,1,份,5,号,2,份,7,号,4,份,（抽气）,6,号,1,份,凝胶浓度,2.5%,，,pH6.7,5,号,Acr,Bis,10.0g,2.5g,6,号,核黄素,4.0mg,7,号,蔗糖,40.0g,按表,6-1,配制浓缩胶，在抽气后加入核黄素，混匀。先用部分胶液冲洗分离胶面，倒出，在立即灌入余下的浓缩胶约,1cm,高，再沿管壁加入缓缓加入蒸馏水约,0.5cm,高度，放置约,30,分钟左右。此时可见浓缩胶呈一层明显的灰白色胶柱。除去水层，用电极缓冲液洗涤胶面，吸弃，再用电极缓冲液加满至管顶，即可上样电泳。,2,加样,取新鲜血清（动物或人）,5l,，加,40%,蔗糖,5l,和溴酚蓝,5l,，放置在干净的白瓷板孔中，混匀。用微量取样器吸取样品，让针头穿过胶面上的缓冲液，缓慢推动取样器，使样品慢慢落在胶面上。推动取样器时不宜过猛，以免样品和缓冲液混合。,3,电泳,将已加好样品的凝胶管，轻轻除去下端的皮塞或封闭物，将管插入圆盘电泳槽孔中，管要插得垂直。插好后加入少量电极缓冲液于槽中，检查是否漏水。如不漏水即可加足电极缓冲液，至少要淹没过凝胶管顶部。电泳槽下槽中也加入电极缓冲液，至少要淹没电极。然后接通电源，负极在上，正极在下。电泳初期电压控制在,80V,，待样品进入分离胶后，加大电压到,160V,，继续电泳。当指示剂到达距管底,1cm,处时停止电泳，关闭电源。,4,、剥胶,倒出电极缓冲液，取出凝胶玻璃管。用带长注射针头（,10cm,）的注射器吸满水，针头插入玻璃管壁与凝胶之间，边插入边推水，并使针头沿管壁转动，直到针头插到头。这样凝胶柱即可脱离玻璃管滑出。若仍不自动滑出，可用洗耳球轻轻把凝胶柱吹出。但不能用力过大，以免凝胶滑出过猛而断裂。,5,染色,将取出的凝胶柱放入大试管或平皿中，加入染色液，染色,20,30min,。倒处染色液并回收，换成脱色液漂洗，多次更换脱色液或放在,37,处加热促进脱色，直至无蛋白区带处背景的颜色腿净，可见清晰的血清蛋白质电泳图谱为止。,电泳结果可用扫描仪扫描记录或拍照。凝胶柱在,7%,的醋酸溶液中可长期保存。,