实验1 DNA提取纯化检测.ppt

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,实验一 真核细胞染色体,DNA,的 分离、纯化和检测,实 验 目 的,通过实验学习从血液中制备染色体,DNA,的方法。,学习琼脂糖凝胶电泳，检测,DNA,的纯度、,DNA,的构型、含量以及分子量的大小。,掌握,DNA,样品的纯化和定量检测方法。,红细胞裂解液裂解红细胞,细胞裂解液裂解白细胞,用蛋白酶,K,水解蛋白质,有机溶剂酚、氯仿抽提,在高盐条件下，用乙醇沉淀,DNA,再用,70%,乙醇洗除沉淀中的盐分,即可获得染色体,DNA,实 验 原 理,DNA,分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。前者由分子所带净电荷量的多少而定，后者则主要与分子大小及其构型有关。,DNA,分子在高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动，在用电泳法测定,DNA,分子大小时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度的差异所决定，提高分辨率。同时适当减低电泳时的电压，也可使分子筛效应相对增加而提高分辨率。,实 验 原 理,纯净的,DNA A260/A280=1.8,，,制备的,DNA,样品应该为,1.71.8,纯净的,RNA A260/A280=2.0,，制备的,RNA,样品应该大于,2.0,如果制备的,DNA,样品,A260/A2802,，,说明样品中,RNA,过高，可用,RNase,消化后，用酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉淀,DNA,；,如果样品,A260/A280,为,1.82.0,，说明样品中盐的含量过高，样品沉淀后应用,70%,乙醇多洗一遍。,提取的,RNA,样品,A260/A280,应大于,1.80,。,RNA,样品含有蛋白质会使,A260/A280,比值下降。,实 验 原 理,实 验 材 料,红细胞裂解液,KHCO,3,1g (10mM),NH,4,Cl 8.3g (155mM),EDTANa,2,37mg (0.1mM),裂解缓冲液（,lysis buffer,）,10mM Tris-Cl (pH8.0),0.1M EDTA (pH8.0),0.5%(m/v)SDS,ACD,抗凝液,柠檬酸,0.48g,柠檬酸钠,1.32g,右旋葡萄糖,1.47g,加水至,100ml,使用时每,6ml,新鲜血液加,1ml ACD,液,组织细胞,动物血液样品，将,20ml,新鲜血液与,3.5mlACD,抗凝液混匀，,0,下保存数天或,-70,下长期冻存，备用。,酚：氯仿：异戊醇（,25,：,24,：,1,）,70%,乙醇,琼脂糖,TAE,电泳缓冲液,电泳设备,紫外分光光度计,凝胶成像系统,实 验 材 料,染色体,DNA,的制备方法,1.,取,800l,抗凝血液置于,5ml,离心管中。,2.,往管中加,3ml,红细胞裂解液，轻摇数次，置冰上,5,分钟，期间间歇摇动,几次。,3.4000rpm,，室温离心,5,分钟，弃上清。,4.,往管中加入,3ml,红细胞裂解液，重悬沉淀，冰上,5,分钟，期间摇几次。,5.4000rpm,，离心,5,分钟，弃上清。,6.,重复步骤,4,、,5,四至五遍，至出现明显白色沉淀。,7,.,用,1,PBS,重悬白色沉淀。,8.4000rpm,，离心,5,分钟，弃上清。,9.,每管中加入,500l,白细胞裂解缓冲液（每小组配制,1ml),，重悬细胞，加入,20l proteinase K,（,20mg/ml,），混匀后转移至,1.5ml,离心管，置,55,水浴,1,小时。,10.,加入酚：氯仿,500l,，盖紧后上下颠倒几次,10000rpm,，离心,5,分钟，取上层水相，至,1.5ml,离心管，加入氯仿,500l,，盖紧后上下颠倒几次,10000rpm,，离心,5,分钟，取上层水相至,5ml,离心管。（两次取上清前用剪刀将枪头尖剪去,3mm),11.,加入,1ml,无水乙醇,可见混浊，盖紧后上下颠倒混匀可见,DNA,凝集成絮状，溶液又变澄清。,12.12000rpm,，离心,2,分钟，弃上清。,13.,用,1ml 70%,乙醇洗涤沉淀，,12000rpm,，离心,2,分钟，弃上清。,14.,开盖室温干燥沉淀,2,分钟。,15.,加入,50l,DDW,（无菌水）,55,水浴,5,分钟溶解,DNA,取,10l,电泳。,16.,加入,3ml DDW,至剩余样品中，室温混合,2,分钟，测,OD260,和,0D280,，计算,DNA,浓度及,OD,260,/0D,280,。,染色体,DNA,的制备方法,琼脂糖凝胶电泳方 法,1.,选择合适的电泳仪和水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平，检查稳压电源与正负极的线路。,2.,将电泳板置于制胶器中或用玻璃胶带封好制胶板两端，防止浇板时出现渗漏。选择孔径大小适宜的点样梳，垂直架在电泳板负极的一端，使点样梳底部电泳板水平面的距离为,0.5-1.0mm,。,3.,制备琼脂糖凝胶：按照被分离,DNA,分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。称取琼脂糖，溶解在电泳缓冲液中，大电泳槽约,160,毫升，小电泳槽约,35,毫升凝胶液，置微波炉或水浴锅中加热，至琼脂糖全部溶化。,4.,待凝胶溶液冷至,50,左右时，在凝胶溶液中加入,EB,（终浓度,0.5g/ml,），摇匀，轻轻倒入电泳板上，除去气泡。,5,待凝胶冷却凝固后（约,30,分钟），在电泳槽内加入电泳缓冲液，大电泳槽约需,1200ml,，小电泳槽约,180ml,。从制胶器取出电泳板，放入电泳槽，然后小心取出点样梳，保持点样孔的完好，去除空内气泡。,6,待测的,DNA,样品中，加五分之一体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液（,6loading Buffer,）。如果待测样品太小要用电泳缓冲液稀释，再加五分之一体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液。如点样体积,10l,样品与,2l,溴酚蓝指示剂点样缓冲液，混匀后小心地进行点样，记录点样顺序和点样量。,7,打开电源，,DNA,的迁移速度与电压成正比，与琼脂糖含量有关。最高电压不超过,5V/cm(,大电泳槽不超过,200V,，小电泳槽不超过,150V),。,8,电泳时间看实验的具体要求而定，在电泳途中可用紫外灯直接观察，,DNA,各条条带分开后，可以结束电泳。一般,20,分钟,2,小时，取电泳凝胶块直接用凝胶成像系统成像和分析。,琼脂糖凝胶电泳方 法,DNA,样品的纯化和定量检测方法,1,取,DNA,粗制样品，加入,RNase,至终浓度,10,g/,l,，,37,反应,0.5,小时。,2,加入酚：氯仿：异戊醇（,25,：,4,：,1,）等体积抽提,13,次，,12000 rpm,，离心,5,分钟,取上清。,3,加入,1/10,倍体积,3M,NaAc,（,pH5.2,），,2,倍体积无水乙醇混匀，室温下,3060min,。,4,15000 rpm,，离心,10,分钟。,5,DNA,沉淀用冰预冷,70%,乙醇洗,1,次，开盖,37,干燥,10min,（使乙醇挥发）。,6,加入,30,l TE buffer,，,37,水浴至沉淀溶解。,7,取,10,l DNA 1%,琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统记录和分析结果，估计样品,DNA,分子量。,8,取,10,l DNA,母液稀释至,1000ul,，在紫外分光光度计上测,A260,和,A280,。计算样品,DNA,浓度，判断样品浓度和,DNA,纯度。,电泳注意事项,1.,琼脂糖的质量：,琼脂糖（,agarose,）是以质量较好的琼脂作原料制成的。琼脂是由琼脂糖和琼脂胶组成的复合物。琼脂胶是一种含有硫酸根和羟基的多糖。它具有离子交换性质，这种性质将给电泳带来电渗作用的不良影响，因而必须去除干净。所谓琼脂糖的质量不过关就是琼脂糖内含有较高比例的琼脂胶。琼脂糖是一种直链多糖，它由,D-,半乳糖和,3,，,6-,脱水,-L-,半乳糖的残基交替排列组成的线性多聚糖。由于链状琼脂糖分子相互以氢键交联，因此与琼脂一样能形成凝胶。琼脂糖带有亲水性，不含有带电荷的基因，不引起,DNA,变性，又不吸附被分离的物质，因此它是一种很好的凝胶剂。,2.DNA,分子的迁移率：,影响,DNA,分子在电泳中的迁移率的因素是多方面的，除了决定于,DNA,分子大小与构型外，还有琼脂糖的浓度、电压大小、缓冲液,pH,值和电泳时的温度等。为了精确测定其分子量的大小，采用一下措施：,(1),每次测定时，要有已知分子量的,DNA,片段作为标准，进行对照。电泳。,(2),选择最合适的电泳条件。,(3),提高分子筛效应，降低电荷效应。,电泳注意事项,3.EB,染色：,EB,是核酸的显色剂，使用,EB,对,DNA,染色的,3,种方法：,(1),在制胶中与电泳缓冲液中同时加入,EB,。,(2),只在胶中加入,EB,，在电泳缓冲液中不加。这样可减少操作时双手受,EB,污染的可能。,(3),在电泳结束后，取出凝胶，放在含有,EB,的电泳缓冲液或,DDW,中浸染,10-30,分钟。,4,溴酚蓝指示剂缓冲溶液的作用：含有,50%,蔗糖，可增加上样,DNA,溶液的密度，以确保,DNA,样品沉入点样孔内，起,DNA,电泳时的前沿指示剂作用。一般溴酚蓝的电泳迁移位置相当于,300400bp,双链线状,DNA,。,5,点样量太高易产生拖尾与弥散现象，样品迁移速度减慢。点样量太少，分辨不清，影响结果。,6,EB,为强诱变剂，剧毒，操作时要带一次性手套，并在专区间操作。用过的手套要及时将手套顺手翻过来，让有,EB,的面朝里，有,EB,的废液和器皿不能随便丢弃，要用专门方法处理后丢弃。,电泳注意事项,DNA,定量检测注意事项,测定光吸收值时，用稀释,DNA,样品的溶液做对照。,选择稀释要适当，应在检测范围之内。,思 考 题,实验中影响染色体,DNA,完整的因素有哪些？如何减少这些因素对完整性的影响？,如何判断提取的染色体,DNA,样品的质量？,为了获得清晰的,DNA,样品电泳图，在琼脂糖凝胶电泳过程中应该注意哪些问题？,如何选择测量,DNA,的合适的稀释倍数？,为什么需要对,DNA,进行纯化？,