亲和层析的应用.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,亲和层析的应用,亲和层析,亲和层析,（,affinity chromatography,）,是利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的的一类特殊层析技术。,亲和层析法具有多方面的应用。,核酸的纯化,因为,DNA,与,RNA,之间具有专一性的亲和力，所以亲和层析可应用于核酸的研究，例如从大肠杆菌的,RNA,混合物中分离出专一于噬菌体,T4,的,RNA,，可将,T4,的,DNA,以共价键结方式接于,cellulose,材质的管柱中，再将所要的,RNA,分离出。,此外，根据核酸与蛋白质之间交互作用的原理，可以将单股,DNA,接在,Sepharose,上，纯化,DNA,聚合酶或,RNA,聚合酶。,激素,受体,的,纯化,激素受体是细胞膜上与特定激素结合的成份，激素和受体的作用具有特异性，目前用亲和层析法已经能够将激素与,sephrose,的组合，纯化胰岛素、正甲状腺素的受体。,抗体与抗原的纯化,抗体与抗原结合具有高度专一性，,Sepharose,是这一类亲和层析较佳的载体，由于抗原,-,抗体复合物的解离常数很低，因此抗原在固定化抗体上被吸附后，要尽快将它洗出，冲洗液的条件通常是控制,pH,值至,3,以下，成份为醋酸、盐酸、,Tris-HCl,缓冲液、,20%,甲酸或,1mol/L,丙酸，也有使用尿素这一类的蛋白质变性剂作为洗出用的溶液。,酶和酶的抑制剂纯化,使用亲和层析法纯化酶，可以得到相当好的效果。例如，要分离猪和牛的胰蛋白酶，可以连接鸡卵黏蛋白（胰蛋白酶的抑制剂）与,Sepharose 4B,当作层析柱材质，用它纯化出来的胰蛋白酶相当于,5,次再结晶的纯度。,除了使用抑制剂当配体，也可以反过来用酶作为配体来纯化抑制剂，例如，将胰蛋白酶接到,Sepharose,上，能有效分离纯化大肠杆菌中的胰蛋白抑制剂,Ecotin,。,Chitin,几丁质,CHOM,鸡蛋粘多糖蛋白,Trypsin,胰岛素,亲和层析的应用,亲和层析法分离胆固醇氧化酶,季文明,陈毅力等,江南大学生物工程学院,亲和层析法分离胆固醇氧化酶,胆固醇氧化酶是一种多功能酶。目前,医院应用胆固醇氧化酶检测血清胆固醇含量。胆固醇氧化酶可以降低食品中的胆固醇含量；能有效抑制鳞翅目昆虫的生长繁殖,是一种生物杀虫剂；胆固醇的氧化产物胆甾,-4-,烯,-3-,酮还具有抗肥胖、治疗肝病等药效。,亲和层析法分离胆固醇氧化酶,发酵产物经过盐析操作以后，得到层析用样品。,他们利用一种脂溶性凝胶,SepherdexLH20,作为胆固醇的载体,其分离的分子量小于,3000,。胆固醇也为脂溶性的化合物,与凝胶,LH20,有很好的相容性,而酶蛋白不能进入凝胶。,亲和层析法分离胆固醇氧化酶,他们每次进行实验时加入,15ml,的样品,用,15,倍体积的缓冲液,A,洗去杂物,流速为,0.52ml/min,；然后再用缓冲液,B,洗脱酶蛋白,流速为,0152ml/min,。,亲和层析法分离胆固醇氧化酶,他们对表面活性剂的浓度和洗脱速度的条件进行了考察，得到用亲和层析分离纯化胆固醇氧化酶,酶比活从,0.45U/mg,提高到,15.5U/mg,。亲和层析的适合条件为洗脱液,A,的流速是,015ml/min,洗脱液,B,的流速是,210ml/min,。,实验室内可用此法分离纯化胆固醇氧化酶,但是从实际操作和经济角度考虑，该法不适合大规模处理。,谢谢大家！,