生物化学 蛋白质2.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,第三节 蛋白质结构与功能的关系,一、蛋白质一级结构与功能的关系,（一）蛋白质一级结构与空间结构、功能的关系,蛋白质一级结构的某些差异对其功能的影响,(1),胰岛素一级结构与功能的关系,(2),丝氨酸蛋白酶一级结构与功能的关系,(3),镰刀细胞血红蛋白,一级结构差别很大的蛋白质可能有相似的空间结构,（,二）蛋白质一级结构与物种进化的关系,胰岛素的一级结构：,A,链由,21,个氨基酸残基组成,;B,链由,30,个氨基酸残基组成,A,链含一个链内二硫键,A,链与,B,链之间有二个二硫键,Ser,Gly,Ile,Val,Glu,Gln,Cys,Cys,Thr,Ile,Cys,Ser,Leu,Tyr,Gln,Leu,Glu,Asn,Tyr,Cys,Asn,Phe,Val,Asn,Gln,His,Leu,Cys,Gly,Ser,His,Leu,Val,Glu,Ala,Leu,Tyr,Leu,Val,Cys,Gly,Gly,Glu,Arg,Phe,Phe,Tyr,Thr,Pro,Lys,Thr,NH,2,1,5,10,15,20,COOH,A,链,NH,2,1,5,10,15,20,25,30,HOOC,B,链,表,中九种,动物之间胰岛素分子一级结构中存在的氨基酸残基,组成的差异不影响胰岛素的生物活性。临床上曾经应用猪和牛的,胰岛素治疗人的糖尿病，取得了显著的疗效。,胰岛素分子中氨基酸残基的差异部分,来 源,氨基酸残基的差异部分,A8 A9 A10 B30,人,Thr,Ser,Ile,Thr,猪,The Ser,Ile,Ala,狗,Thr,Ser,Ile,Ala,兔,Thr,Ser,Ile,Ser,牛,Ala Ser Val Ala,羊,Ala,Gly,Val Ala,马,Thr,Gly,Ile,Ala,抹香鲸,Thr,Ser,Ile,Ala,鲸,Ala Ser,Thr,Ala,（三）一级结构的种属差异与分子进化,不同生物细胞色素,C,的氨基酸差异数（以人为基数）,差异数 差异数,黑猩猩,0,响尾蛇,14,猴子,1,海龟,15,免,9,金枪鱼,21,猪,10,小麦,35,牛,10,酵母,51,狗,11,驴,12,鸡,13,动物体细胞色素,C,一级结构的进化树,图中的数字表示该类动物与其祖先相比细胞色素,C,一级结构氨基酸残基的差异数,（四）一级结构与分子病,例镰刀状红细胞贫血,HbA,肽链,N-Val.his.,leu,.,thr,.pro.,glu,.glu,.C(146),HbS,肽链,N-Val.his.,leu,.,thr,.pro.,val,.,glu,.C(146),这种由蛋白质分子异常引起的疾病，称分子病,二、肌红蛋白和血红蛋白的空间结构与功能的关系,（一）肌红蛋白的空间结构与功能的关系,肌红蛋白（,myoglobin,Mb,）,是由,153,个氨基酸残,基组成的单一多肽链的蛋白质，含,8,个,螺旋（,A,、,B,、,C,、,D,、,E,、,F,、,G,、,H,），,其辅基为血红素。,1,2,2,1,N,C,N,C,血红蛋白的四级结构,成人血红蛋白由,2,条,链,和,2,条,链,组成,各亚基分别含一个血红素,.,血红蛋白空间结构与功能的关系,成人血红蛋白由2个,亚基与2个,亚基组成的,四聚体（,2,2,），,每个亚基含,1,个血红素分子。,血红蛋白每,1,个亚基可结合,1,个氧分子。一分子,血红蛋白,4,个亚基可结合运输,4,个氧分子。,肌红蛋白与血红蛋白的带氧曲线,肌红蛋白的氧饱和曲线为距形双曲线,血氧饱和度为,20%,时仍能带氧,肌肉,缺氧时,(,氧饱和度为,5%),大量释放氧,以供肌肉收缩需要,;,血红蛋白的氧饱和曲线,为,S,形曲线,表明血红蛋白四个亚基对氧的结合具有正协同效应。,血红素与氧结合：,血红素是,4,个吡咯环形成的铁卟啉化合物，,2,价铁离子居于中央。铁离子有,6,个配位键，其中,4,个与,4,个吡咯环的,N,原子相连，,1,个与,F8,（,-,螺旋,F,中第,8,个残基）组氨酸（,93,）相结合，氧分子则与第,6,个配位键相结合，血红素未结合氧时，,Fe,偏离卟啉平面约,0.06nm,，,偏向,-,螺旋,F8,组氨酸侧，当结合氧后，,Fe,被拉入卟啉环中，这样带动,F8,发生位移，进而引发一系列构象改变。,氧分子与血红蛋白的结合具有正协同效应,紧张态（,T,态）：,铁原子偏离卟啉平面约,0.06nm,偏向F8 H,is,侧，,1,21,与,2,2,呈双重对称排布，,对氧的亲和力低。,松弛态（R态）：,铁原子被氧分子拉入卟啉环中，,牵动作用H,b,亚基三维结构发生改变，,亚基间盐键断裂，亚基间结合疏松，,1,21,与,2,2,之间移位15，,对氧的亲和力高。,血红蛋白,T,态与,R,态,血红蛋白,4,个亚基的排布是,1,/,1,和,2,2,呈双重对称排布。紧张态（,T,态）,Hb,对氧,的亲和力低。当血红蛋白结合氧时，由于铁离子的位移带动,-,螺旋,F,做相应的移,动，进而引发亚基间的盐键断裂，使亚基间的结合松弛，,1,/,1,和,2,2,之间移位,15,；松弛态（,R,态）,的,Hb,亚基对氧的亲和力高，容易与氧结合。,15,1,1,2,2,2,1,1,2,+O,2,O,2,T,态,R,态,正常朊病毒蛋白结构,（显示,-,螺旋,）,朊病毒结构,（显示,-,片层结构,）,朊病毒蛋白,（,prion,protein,PrP,）,存在于人体神经原、神经胶质细胞等多种细胞的细胞膜上的糖蛋白。朊病毒是正常朊病毒蛋白空间构象由,螺旋变成,折叠所致。,朊病毒本身不能自我复制，但可以攻击大脑的正常朊病毒蛋白，使之构象改变并与其结合，形成朊病毒二聚体、四聚体。周而复始，脑组织中朊病毒不断积蓄，造成脑组织发生退行性病变。,第 四 节,蛋白质的理化性质及其提取、纯化原理,（一）蛋白质的两性电离,NH,+,3,NH,+,3,NH,3,P P P,COOH,COO,-,COO,-,蛋白质的阳离子 蛋白质的兼性离子 蛋白质的阴离子,（等电点）,+OH,-,+H,+,+OH,-,+H,+,蛋白质胶体的性质,：,（,1,）粘度大,（,2,）扩散速率慢,（,3,）不能透过半透膜,水化膜,:,带电物质在水中存在时形成的界限膜,有固定作用,使物质具有不能自由通透性,使蛋白不易沉淀,蛋白质的沉淀、变性、凝固,稳定蛋白质亲水胶体性质的两个因素：,水化膜,颗粒表面电荷,Denaturation,(,变性,),定义,:,蛋白质的特定空间构象被破坏,从而导致其理化性质改变和生物活性丧失,称蛋白质变性,.,变性蛋白质理化性质,：,（,1,）溶解度降低,（,2,）粘度增加，结晶能力消失,（,3,）生物活性丧失,（,4,）容易被蛋白酶水解,牛 胰 核 糖 核 酸 酶 分 子 的 变 性 与 复 性,变性：蛋白质在一些理化因素的作用下，其正常的空间构象遭到破坏，主要是次级键或二硫键发生破坏，导致蛋白质的理化性质的改变（如溶解度下降、粘度增加）和生物学活性的丧失。蛋白质的变性不影响其一级结构。,变性,物理因素：加热、紫外线照射、超声、剧烈震荡等,化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等,沉淀,改变,pH,至,pI,破坏水溶液中蛋白质,的水化膜和中和电荷,（变性蛋白质）,（,蛋白质未变性,）,凝固,加热,（,变性，不再溶解,）,变性不一定沉淀,沉淀不一定变性,凝固均变性并不溶解,加热,酚试剂呈色反应（,Lowry test,）：,除蛋白质分子,中肽键与碱性,Cu2+,发生二缩脲反应外，蛋,白质分子中的色氨酸与酪氨酸残基还将试,剂中的磷钨酸和磷钼酸盐还原生成蓝色化,合物（钼蓝）,蛋白质的理化性质与常用的纯化方法,理化性质 相应的分离纯化方法,分子大小和形态,差速离心、超滤、分子筛、透析,溶解度,盐析、萃取、分配层析、结晶,电荷差异,电泳、等电聚焦电泳、离子交换层析,生物功能专一性,亲和层析,A,：,根据蛋白质分子大小分离纯化蛋白质,透 析,超,滤,（,ultrafiltration,）,:,在一定的压力下，使蛋白质溶液在通过一定孔径的,超滤膜时，小分子量物质滤过，而大分子量的蛋白质被,截留，从而达到分离纯化的目的。这种方法既可以纯化,蛋白质，又可达到浓缩蛋白质溶液的目的。,磁力搅拌器,待超滤的,蛋白质溶液,加压的氮气,超滤膜,盐析：,高浓度中性盐使蛋白质从溶液中析出,有机溶剂沉淀：,降低溶液的介电常数，使蛋白质分子间,相互吸引而沉淀；,有机溶剂与水作用，不,断压缩大分子表面水层，使相互凝结析出,B,：,改变蛋白质溶解度分离蛋白质,有机溶剂沉淀：,降低溶液的介电常数，使蛋白质分子间,相互吸引而沉淀；,有机溶剂与水作用，不,断压缩大分子表面水层，使相互凝结析出,根据各种蛋白质在一定的,pH,环境下所带电荷种类,与数量不同的特点，将不同蛋白质予以分离。,常用的方法有：,电泳,离子交换层析,等电聚焦,C,：,根据蛋白质电荷性质的分离方法,电 泳：带电物质在外加电场作用下,向相反电极移动的现象,原点,带,负电荷蛋白质的泳动方向,滤纸、醋酸纤维素,薄膜或其他支持物,阳极,阴极,电极缓冲液,电极缓冲液,电泳示意图,电泳（,electrophoresis,）,：,等电,聚焦（,isoelectric,focusing,IEF,）,:,在具有,pH,梯度的电场中进行的电泳。每种蛋白质均有其特定的等电点，在,pH,呈梯度的电场中，按其等电点不同，带有不同的电荷，于是向与其带电相反的电极方向泳动。这样，在电泳时某一蛋白质迁移到电场中某一处的,pH,等于其等电点时，该蛋白质便因不带电荷而停止泳动。这样，各种蛋白质按其等电点不同得以分离,。,+,(H,2,SO,4,),(,NaOH,),pH3,pH10,+,(H,2,SO,4,),(,NaOH,),pI,4.5 5.1 6.0 7.9 8.1,pH3,pH10,将,第一相胶条,加到第二相电,泳中，走向与,第一相垂直,等电聚焦,(IEF),pH3.0,pH10.0,第一相,IEF,按,pI,进行分离,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳,（,SDS-PAGE,）,电泳走向,第二相,SDS-PAGE,按分子大小分离,pH3.0,pH10.0,+,+,双向电泳（,two dimensional electrophoresis,）：,离子交换层析,(ion exchange chromatography),：,低盐,浓度,洗脱液,高盐,浓度,洗脱液,各,试管进行连续收集,混合蛋白质,离子交换层析柱,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,离子交换层析分离蛋白质示意图,试管走行方向,离子交换层析,(ion exchange chromatography),：,凝胶,过滤（,gel filtration,）：,凝胶过滤,又称分子筛层析，在层析柱内填充惰性的,微孔胶粒（如交联葡聚糖），将蛋白质溶液加入柱上部,后，小分子物质通过胶粒的微孔进入胶粒，向下流动的,路径加长，移动缓慢；大分子物质不能或很难进入胶粒,内部，通过胶粒间的空隙向下流动，其流动的路径短，,移动速度较快，从而达到按不同分子量将溶液中各组分,分开的目的,（,二）根据蛋白质分子大小不同的分离方法,离心,(centrifugation),：,利用机械的快速旋转所产生的离心力，将不同密,度的物质进行分离,根据转速分类：,常用离心机,50 000 rpm,相对离心力（,g,）,=1.119,10,5,（,rpm,）,2,r,根据应用分类：,分析型离心机,制备型离心机,g:gravity,rpm:revolution per,minut,r:,离心半径,几种蛋白质的分子量与沉降系数的关系,在,单位力场下，溶质分子的沉降速度与离心角速度、离心半径呈正比，其比例常数为沉降系数，用,S,表示，单位为秒。,=s,2,一般蛋白质的沉降系数为,10,13,10,12,秒，故人们以,Svedberg(S,),单位来表示沉降,系数，即,1S=10,13,秒。沉降系数的大小与蛋白质的密度和形状相关。,（,二）多肽链的氨基酸序列分析,测序前的准备,N,端分析以确定蛋白质的多肽链数目,断裂二硫键,分离单一多肽链,测定多肽链的氨基酸组成,多肽链氨基末端与羧基末端分析,二硝基氟苯（,1-fluoro-2,4-dinitrobenzene,）,法,丹酰氯,(,dansyl,chloride),法,多肽链的氨基酸序列测定和重叠组合,对多肽链进行限制性水解成小片段,Edman,降解法进行小片段肽段的序列分析,对各片段序列进行比较叠加，拼出完整的多肽序列,相对荧光值,0 4 8 12,谷,天冬,羧甲半胱,天胺,丝,谷胺,组,甘,苏,精,丙,氨基丁酸,酪,蛋,缬,苯丙,异亮,亮,赖,氨基酸的高效液相色谱分析,分析多肽链的氨基酸组成,丹酰氯法,检测多肽链,N-,端示意图,常用的多肽链水解方法及其作用点,多肽片段的层析与电泳双向分离,原点,层析方向,电泳方向,不同长度和不同,带电状态的肽片段,多肽,片段的分离,N,H,2,N,C,H,R,1,C,N,O,H,C,H,R,2,C,N,O,H,C,H,R,3,C,N,O,H,C,H,R,1,C,N,O,H,C,H,R,2,C,N,O,H,C,H,R,3,C,N,O,H,H,N,C,S,N,H,C,N,H,C,N,C,S,O,R,1,H,H,2,N,C,H,R,2,C,N,O,H,C,H,R,3,C,N,O,H,多,肽,(,氨,基,酸,=,n,),异,硫,氰,酸,苯,酯,苯,氨,基,硫,甲,酰,多,肽,苯,乙,内,酰,硫,脲,衍,生,物,6,m,o,l,/,L,H,C,l,多,肽,(,氨,基,酸,=,n,-,1,),重,复,下,一,轮,反,应,C,S,Edman,降解法,荧,光,时间,氨基酸的组成分析：,2,苯、,6,丙、,3,蛋、,4,甘、,2,精、,1,赖、,3,亮、,1,酪、,2,丝、,1,苏、,1,天、,1,缬、,1,异、,1,组,多肽链的,N,端和,C,端的确定：,H-,甘，天,-OH,多肽的,水解和肽段的测序：,胰蛋白酶水解：,甘,-,丙,-,丙,-,苏,-,蛋,-,组,-,酪,-,苯,-,精,甘,-,丙,-,丝,-,蛋,-,丙,-,亮,-,异,-,赖,苯,-,甘,-,亮,-,蛋,-,丙,-,缬,-,丝,-,精,亮,-,甘,-,丙,-,天,溴化氰,水解：,甘,-,丙,-,丙,-,苏,-,蛋,组,-,酪,-,苯,-,精,-,甘,-,丙,-,丝,-,蛋,丙,-,亮,-,异,-,赖,-,苯,-,甘,-,亮,-,蛋,丙,-,缬,-,丝,-,精,-,亮,-,甘,-,丙,-,天,多肽段的,组合叠加：,甘,-,丙,-,丙,-,苏,-,蛋,-,组,-,酪,-,苯,-,精,甘,-,丙,-,丙,-,苏,-,蛋,组,-,酪,-,苯,-,精,-,甘,-,丙,-,丝,-,蛋,甘,-,丙,-,丝,-,蛋,-,丙,-,亮,-,异,-,赖,丙,-,亮,-,异,-,赖,-,苯,-,甘,-,亮,-,蛋,苯-甘-亮-蛋-丙-缬-丝-精,丙-缬-丝-精-亮-甘-丙-天,亮-甘-丙-天,H-甘-丙-丙-苏-蛋-组-酪-苯-精-甘-丙-丝-蛋-丙-亮-异-赖-苯-甘-亮-蛋-丙-缬-丝-精-亮-甘-丙-天-OH,两种水解作用所得肽链的测序与组合,肌红蛋白结晶的,X,线衍射图,X,线衍射图中包含了,25 000,个衍射光点。衍射图谱中光点的强度和光点分布类型提供蛋白质结构的足够信息。根据衍射光点的密度与分布，计算机分析，绘出其三维电子密度分布图，进而得出空间结构图形。,肌红蛋白结晶的衍射结果,（,四）蛋白质空间结构的确定,X,线晶体分析（,X-ray crystallography,）,核磁共振光谱分析,(nuclear magnetic resonance spectroscopy),蛋白质组：,一个组织或一个细胞中基因组所表达的全部,蛋白质，或在特定条件下，一个细胞内所存,在的所有蛋白质,蛋白质组与基因组的差别：,基因组：,代表一个生物细胞内的全部基因和染色体的核,苷酸组成。同一个体的所有体细胞均具有均一,的基因组，不受机体状态的影响,。,蛋白质组：,不能从基因组简单推出一个细胞蛋白质组组成，因细胞不是对所有基因同时表达；表达的基因因表达的,mRNA,不同，可翻译出不同蛋白质；同一蛋白质前体经不同剪接表现出不同的蛋白质；同一种蛋白质在不同的代谢调节条件下可表现出不同的构象和不同的修饰。,同一个体的不同发育期中因基因的开关，同一组织或细胞中的,蛋白质组组成不同；同一生长时期的不同组织器官的细胞中基因表,达不同，产生不同的蛋白质组；不同的生理状况（饱食、禁食、,应激等）不同的基因表达出不同的蛋白质组组成；不同的病理（肿,瘤、炎症等）条件下不同基因开放而表达出不同的蛋白质组；环,境因素（药物等）均可影响细胞内蛋白质组的组成。,所以，,组织器官的蛋白质组具有多样性、多变性和可调节性，,具有不同时、空的差异和深受机体内、外条件的影响。,蛋白质组学,研究和阐述在不同条件下，蛋白质组中全部蛋白质的,结构、性质与功能，影响因素及其相互联系。,某种生理功能的蛋白质组学（,functional proteomics,）,结构蛋白质组学,(structural proteomics),亚细胞结构的蛋白质组学,(,subcellular,proteomics),各种,疾病的蛋白质组学（,disease proteomics,）,等等,