农产品分析(蛋白质测定)-3-1.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五章 蛋白质的测定,1,蛋白质的测定方法,pro,的测定方法分为两大类：,一类是,利用,pro,的共性,，即含氮量，肽链和折射率测定,pro,含量,;,另一类是利用蛋白质中,特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团,测定,pro,含量。,蛋白质用凯氏法测定，因其中尚有氨基酸、酰氨等非蛋白质氮，故称“粗蛋白质”，若用重金属盐等沉淀分离以后，进行全氮测定，由氮换算成的蛋白质含量，则称为“纯蛋白质”。,2,测定蛋白质最常用的方法为,凯氏定氮法,凯氏定氮法是通过测定出样品中的总氮含量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量。经过人们长期的应用和不断改进，凯氏定氮法已演变成,常量法、微量法、半微量法、改良凯氏法及自动定氮法等。,3,优点：,具有应用范围广、灵敏度高、回收率好及不需昂贵仪器等优点,。,缺点：,操作较费时,(,除自动凯氏定氮法外,),，单消化过程一般就需要,2,3h,，如果遇到高脂肪、高蛋白样品消化需要,5h,以上；在操作过程中会产生大量有害气体。,4,为满足生产单位对工艺过程快速控制分析，减少环境污染和操作简便省时，后来在凯氏定氮法的基础上又陆续出现了,水杨酸比色法、双缩脲法、水合茚三酮法、染料结合法、紫外分光光度法、折光法、旋光法、近红外线光谱法以及测定开氏消煮液中铵的靛酚蓝法和纳氏比色法,。,5,重点介绍,凯氏定氮法、染料结合法、双缩脲法,三种方法。,测定氨基酸主要的方法是,利用氨基酸,自动分析仪、茚三酮法、染料结合法、乙醛酸法、荧光法等。,重点介绍氨基酸自动分析仪法测定全氨基酸、染料结合法测定赖氨酸及乙醛酸法测定色氨酸。,6,粗蛋白质的测定,凯氏定氮法,这种方法是,1883,年丹麦人开道尔,(,JKjeldahl,),发明，当时凯氏只使用,H,2,SO,4,来分解试样，来定量谷物中的,pro,，他只知用,H,2,SO,4,分解试样，而不能阐明,H,2,SO,4,分解有机氮化合物生成氨的反应历程，所以只使用,H,2,SO,4,分解试样，需要较长时间，后来由,Gunning,进行改进，他是在消化时加入,K,2,SO,4,使沸点上升，这样加快分解速度，因为温度由原来硫酸沸点的,330,上升到,400,，所以速度也就加快了，凯氏定氮法至今仍在使用,。,7,优点：具有应用范围广、灵敏度高、回收率好及不需昂贵仪器等优点。缺点：操作较费时,(,除自动凯氏定氮法外,),，单消化过程一般就需要,2,3 h,，如果遇到高脂肪、高蛋白样品消化需要,5 h,以上；在操作过程中会产生大量有害气体。,8,我们在检验农产品中,pro,时，往往只限于测定总氮量，,然后乘以,pro,核算因数，得到蛋白质含量，实际上包括氨基酸、酰氨、核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉和含氮色素等非蛋白质含氮化合物，故称为粗,pro,。,如果蛋白质用,重金属盐等沉淀分离,以后，进行全氮测定，由氮换算而成的蛋白质的含量，则称为“纯蛋白质”。,9,（一）方法原理,氮素是蛋白质中的主要成分。同类植物蛋白质的含氮量基本上是固定的。因此，可将测得含氮值乘以换算因数，即得蛋白质含量。,10,样品与硫酸和催化剂一同加热后消化，使蛋白质分解，其中的碳和氢分别被氧化成二氧化碳和水逸出，而有机氮转化成氨后与硫酸结合生成硫酸铵，然后在碱性条件下蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再用硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即得蛋白质含量。该过程的反应方程式表示如下,：,11,消化,：,2NH,2,(CH,2,),2,COOH+13H,2,SO,4,(NH,4,),2,SO,4,+6CO,2,+12SO,2,+16H,2,O,蒸馏,：,(NH,4,),2,SO,4,+2NaOH,2NH,3,+Na,2,SO,4,+2H,2,O,吸收,：,2NH,3,+4H,3,BO,3,(NH,4,),2,B,4,O,7,+5H,2,O,滴定：,(NH,4,),2,B,4,O,7,+2HCl+5H,2,O,2NH,4,Cl+4H,3,BO,4,12,在消化过程中，为了加速蛋白质的分解，缩短消化时间，常加入,硫酸钾,、,硫酸铜,等物质。加入,硫酸钾,可以提高溶液的沸点而加快有机物分解，因为它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度。但其加入量不能太大，否则消化温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解放出氨而造成损失。,13,（二）操作步骤,1,、蛋白质的沉淀,2,、蛋白质的消煮,3,、氮的测定,14,样品,（,0.5mm,）,沸,水,取下放置,30,分钟,1,、蛋白质的沉淀,沸 腾,5min,CuSO4,溶液,NaOH,溶液,？,放置半至,1,小时,倾泻法过滤,沉淀,沸水洗涤,烘干,60,15,2,、蛋白质的消煮,沉淀,浓,H2SO4,放置,2,小时或过夜,110,的,CuSO4K2SO4,小火加热,加大火力,至无色透明,冷却,后煮,30min,电炉,消煮液,呈棕色,16,3,、氮的测定,蒸馏法：,吸取定容后的澄清待测液（常量法可吸取,25-50,毫升，含氮约,10-20,毫克；半微量法吸取,1-5,毫升，含氮约,0.5-1,毫克），用常量法或半微量法测氮，同时做空白试验。,17,(,三,),各种试剂的作用,:,浓,H,2,SO4,：,A,：脱水使有机物炭化，然后有机物炭化生成碳，碳将,H,2,SO,4,还原为,SO,2,，本身则变为,CO,2,B,：氧化,C,：,pro,与浓,H,2,SO,4,生成,NH,3,，,CO,2,，,SO,2,，,H,2,O,D,：,NH,3,与,H,2,SO,4,生成硫酸铵,18,CuSO,4,的作用（催化剂）,起催化作用外，还可作消化终点和下一步蒸馏时碱性反应的指示剂。,Cu,2,SO,4,为红色沉淀，当,C,完全消化后，反应停止，红色消失，变为兰色，即为消化达到完全，兰色为,CuSO,4,的颜色。,19,3,、硒粉和过氧化氢、氧化汞都为催化剂，,但考虑到效果、价格及其环境污染等，通常采用硫酸铜,。,4.,NaOH,的作用,碱性条件下蒸馏使氨游离,。,20,5,、,K,2,SO,4,的作用,（提高沸点）,沸点由,330,提高到,400,加速了反应过程，加速有机物的分解。,21,（四）适用范围,凯氏定氮法适用于各类农产品中的蛋白质测定，最低检出量为,0.05mg,氮，相当于,0.3mg,蛋白质,，本法测出的结果为粗蛋白质含量,22,（五）注意事项,蛋白质沉淀剂通常采用碱性硫酸铜，,它有迅速得到澄清溶液的优点。,牧草、块根块茎作物：碱性醋酸铅为沉淀剂。,谷物及油料作物：由于碱性醋酸铅在沉淀蛋白质,时产生不易沉淀的浑浊物，因此不易正确,决定沉淀完全的终点，故少采用。,下一页,23,（五）注意事项,1,、,样品应均匀，若是,固体样品,应事先研细，,液体样品,要,混合均匀,。,2,、,样品放入凯氏烧瓶时，,不要黏附瓶颈上,，万一黏附可用少量水缓慢冲下，以免被检样消化不完全，使结果偏低。,24,3,、,消化过程中应注意,不时转动凯氏烧瓶,，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全。,4,、消化时，如不容易呈透明溶液，可将凯氏烧瓶放冷后，加入,30%,过氧化氢催化剂,2-3ml,，促使氧化。,25,5,、,在整个消化过程中，不要用强火，,保持和缓的沸腾,，使火力集中在凯氏烧瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失,。,6,、,如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这时会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此,当硫酸过少，底物被消耗掉或样品中脂肪含量过高时，要添加硫酸量,。,26,7,、,混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色,，如果没有溴甲酚绿，可单独使用,0.1%,甲醛红乙醇溶液。,8,、氨是否完全蒸馏出来，,pH,试纸检查,馏出液是否为碱性。,27,9,、,向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀,。这时由于分解促进剂与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀，有时,Cu,离子与氨作用生成深蓝色的络合物。,10,、所有的试剂溶液应用,不含氮的蒸馏水配制,。,28,11,、,消化剂变绿色后继续消化,30,分钟即可,。但对于特别难以氨化的氮化合物样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。,有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁较多时，呈较深绿色,。,29,12,、,样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在,开始消化时必须先低温消化，并时时摇动,；或者加入少量辛醇、液体石蜡或硅油,消泡剂,，并同时注意控制热源强度。,30,13,、,若取样量较大，如干试样超过,5g,，可按每克试样,15ml,的比例增加硫酸用量。,14,、,蒸馏时,加入氢氧化钠溶液必须小心轻加,，而且蒸馏装置不能漏气。,15,、,加碱要足量（反应室液体呈深蓝色或褐色）,并且碱液不能污染冷凝管及接收瓶。,31,16,、,硼酸吸收液的,温度不应超过,40,，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置于冷水浴中使用。另外，冷凝管下端不能插入硼酸液面太深，一般约为,0.5cm,，这样万一发生倒吸现象时，硼酸液不致吸入反应室内。,17,、,蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，,再蒸,lmin,后关掉热源,，否则可能导致吸收液倒吸。,32,18,、,一般样品中尚含其他含氮物质，测出的蛋白质为粗蛋白。,若要测定样品的“纯蛋白质”，则需向样品中加入蛋白质沉淀剂,如氢氧化铜、碱性醋酸铅、,20-25,单宁、,10-12,三氯乙酸溶液等，将蛋白质从水溶液中沉淀出来，再测定此沉淀的全氮量，乘以蛋白质的换算系数即可得“纯蛋白质”量。,33,19,、,在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，,蒸馏过程中不得停火断汽,，否则将发生倒吸。,20,、,称样量的大小取决于样品的含氮量,。若含氮为,1.0,5.0,，称样量为,0.30g,，可根据含氮量的水平适当增减称样量。,称样量不宜少于,0.1g,，如果样品含氮量高，可将消煮好的溶液定容，取一部分用于蒸馏、滴定。,34,21,、,废液排除及洗涤。,22,、氮换算为蛋白质的系数。蛋白质中的氮含量一般为,15,17.6,，,按,16,计算乘以,6.25,即为蛋白质量,。不同食物中蛋白质换算系数不同。,35,36,核对试验,将已知量的,NH,4,+,-N,标准溶液,(,如,100mg/LNH,4,+,-N,标准溶液,10ml,，其中含,N1mg),放入半微量定氮蒸馏装置中，按样品测定同样操作步骤进行蒸馏、滴定，用以检验蒸馏过程中的误差大小。,指示剂的加入量仍为,2,（,v/v,）,37,硼酸的浓度,可根据样品中氮的含量来调节,2,-5,。,测定两种蛋白质的平行结果为,15,以下，相对误差不得大于,3,，,15,30,时为,2,，,30,以上为,1,。,其他参见土壤全氮的测定，如,催化剂仍用,1.85g,较合适。,38,二、同类种子中蛋白质的测定,(,染料结合,DBC,法,),(,一,),方法原理,蛋白质中的碱性氨基酸,(,赖氨酸、精氨酸和组氨酸,),的,NH2,、咪唑基和胍基（赖氨酸的,-NH,3,+,、组氨酸的咪唑基、精氨酸的胍基）以及蛋白质末端自由氨基在,pH=2,3,的酸性缓冲液体系中呈阳离子状态存在，可以和偶氮磺酸染料类物质如橘黄,G,、酸性橙,12#,等的阴离子结合，形成不溶于水的蛋白质染料络合物而沉淀下来。,39,通过测定一定量样品与一定量体积的已知浓度染料溶液反应前后溶液中染料浓度的变化，可计算出样品的染料结合量，即每克样品所结合的染料的毫克数。,染料结合量的大小反映出样品中碱性氨基酸的多少。,40,赖氨酸（,-NH,2,）,组氨酸（咪唑基）,精氨酸（胍基）,41,在小麦、大麦、水稻、大豆、花生等种子中蛋白质的含量与碱性氨基酸的含量之间有很好的相关性。因此，可以用染料结合量来评比同种作物种子大量原始材料之间蛋白质含量的高低。,42,如果要从染料结合量来计算样品的粗蛋白质的含量，则需用开氏法测定同类种子的一批样品的粗蛋白质的质量分数，同时也用染料结合法测定其染料结合量，,然后求出粗蛋白质含量,(,),对染料结合量的回归方程或绘出回归曲线。,这样，测定未知样品的染料结合量，就可以从回归方程计算或查回归线得到粗蛋白质,(,),含量。,43,该法是间接测定种子中蛋白质的方法。,方法简单、快速，与开氏法的相关性较好，但准确性较差，适用于大批样品的筛选工作。美国谷物化学协会将该法列为分析小麦蛋白质含量的正式方法,(AACC11-2,72),。,44,（二）注意事项,1,该法对随意混合物的样品不适用。,2.,样品称样量按蛋白质含量的高低而定。水稻、小麦、大麦等可称取,500mg,，玉米称取,700mg,，大豆称取,200mg,，花生及鱼粉等可少一些。,3,染料结合反应的条件，如染料的,pH,、样品的粒度、振荡反应时间和温度等影响到测定的结果，故应力求每次测定的反应条件一致，特别是测定样品与测定回归方程的样品时的反应条件一致。,45,三、同类种子中蛋白质的测定,(,双缩脲法,),（一）原理：,蛋白质的肽键结构,(,类似于双缩脲的反应基团,),，在碱性条件下能与,Cu,2+,生成紫红色可溶解性络合物，蛋白质含肽键多时反应呈紫色，反之肽键少时，反应呈红色。这种颜色反应称为双缩脲反应,(,或称缩二脲反应,),。,实验证明，蛋白质溶液浓度在,1,15mg,之间，其呈色溶液的吸收值与蛋白质含量成正比。,46,47,本法须用开氏法作标准回归方程。经试验其与开氏法的相关性较好,.,优点：此法简单，快速,适于快速分析，使用仪器设备简单，尤适用于大批品种选择用。适用样品广泛，如小麦、大麦、水稻、玉米和高粱等蛋白质的测定，皆能获得良好的效果。,缺点：灵敏度不高，样品用量大，比较麻烦（事先要用凯氏法测蛋白质含量，绘制出标准曲线或计算回归方程）。,48,（二）说明及注意事项,1.,蛋白质的种类不同，对发色程度的影响不大。,2.,标准曲线做完整之后，无需每次再做标准曲线。,3.,含脂肪高的样品应预先用醚抽出弃去。,4.,样品中有不溶性成分存在时，会给比色测定带来困难此时可预先将蛋白质抽出后再进行测定,。,49,5.,当肽链中含有脯氨酸时，若有多量糖类共存，则显色不好，会使测定值偏低。,6.,该法为美国谷物化学协会,(AACC),测定谷物蛋白质的正式方法，且已有据此法原理为基础的快速测定蛋白质的自动分析仪。,7.,一般的生化分析中采用的双缩脲试剂是碱性硫酸铜水溶液，不适用于种子蛋白质的分析，因为它不稳定，而且会浸出有色物质、脂肪及一些淀粉物质，干扰比色测定。,50,8.,而异丙醇双缩脲试剂，可以减少这些物质的溶解，排除干扰。,9.,对一些颜色较深的种子测定，则应先以四氯化碳处理已称好的样品，并用,10g/LH,2,0,2,降解有色物质，然后再加入双缩脲试剂，以消除对测定结果的影响。,10.,本法对温度及时间的要求严格，否则再现性不高。采用室温,20,25,，须于,120-190min,内比色；,40,为,15,70min,显色稳定；而在,60,连续振荡条件下显色，则反应时间缩短为,5min,。,11.,离心须用,6000r/min,，,l0min,可得澄清液，小于,4000 r/min,的效果不佳,.,。,51,思考题,1.,总氮测定时，消化至关重要，样品消化时注意事项有哪些？,2.,样品脂肪较多，应如何处理？,3.,消化过程中内容物颜色发生什么变化？为什么？,4.,样品经消化进行蒸馏前，为什么要加入氢氧化钠？这时溶液发生什么变化？为什么？如果没有变化，说明什么问题？须采用什么措施？,52,5.,硫酸铜及硫酸钾在测定中起了什么作用？,6.,结果计算中为什么要乘上蛋白质系数？,7.,凯氏定氮法的基本原理是什么？说明它在测定植物总蛋白质中有什么问题，应如何克服,?,53,