核酸检测实验室规范化管理.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,核酸检测实验室的规范化管理,一、规范化设置及管理,(一)临床基因扩增检验实验室区域设置原则,1临床基因扩增检验实验室原则上分为四个分隔开的工作区域：,试剂贮存和准备区；标本制备区；,扩增反应混合物配制和扩增区；扩增产物分析区。,（如使用全自动分析仪，区域可适当合并）,2各工作区域必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。,3进入各工作区域必须严格按照单一方向进行，即：,试剂贮存和准备区 标本制备区 扩增反应混合物配制和扩增区 扩增产物分析区。,4不同工作区域使用不同的工作服(例如不同的颜色)。工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。,（二）工作区域仪器设备配置标准,1试剂贮存和准备区,2-8和-15冰箱；混匀器；微量加样器(覆盖1-1000,l)；,移动紫外灯(近工作台面)；消耗品,：,一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤芯)；,专用工作服和工作鞋；专用办公用品。,2标本制备区,1-8冰箱、-20或-80冰箱；高速台式冷冻离心机；,混匀器；水浴箱或加热模块；微量加样器(覆盖1-1000,l)；,可移动紫外灯(近工作台面)；超净工作台；消耗品;,一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤芯)；专用工作服和工作鞋；专用办公用品；,如需处理大分子,DNA，,应备有超声波水浴仪。,3.扩增反应混合物配制和扩增区,核酸扩增仪；微量加样器(覆盖1-1000,l)；,可移动紫外灯(近工作台面)；消耗品（一次性手套、一次性吸水纸、,耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤芯)；,专用工作服和工作鞋；专用办公用品.,4.扩增产物分析区,基本仪器设备如下：,微量加样器(覆盖1-1000,l)；,可移动紫外灯；消耗品；,专用工作服和工作鞋；专用办公用品,。,（三）各区操作注意事项,下述操作在该区进行：,储存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。,在本区的实验操作过程中，必须戴手套并经常更换。,操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施。,严禁用嘴吸取液体，加样器和吸头等必须经高压处理。,工作结束后必须立即对工作区进行清洁。,实验室及其设备的使用必须有日常记录。,1.试剂贮存和准备区,2.,标本制备区,下述操作在该区进行：,标本保存、核酸（,RNA、DNA）,提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定,RNA,时,cDNA,的合成。,为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。,对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。,样本处理对核酸扩增有很大影响，必须使用有效的核酸提取方法。,3.扩增,区,下述操作在该区进行：,DNA,或,RNA,扩增。,在巢式,PCR,测定中，通常第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢式扩增由较高的危险性，第二次加样必须在本区内进行。,不能从本区再进入任何“上游”区域，可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。,为避免气溶胶所致的污染，尽量减少在本区的走动。,4.扩增产物分析区,下述操作在本区内进行：扩增片段的测定。,本区是最主要的扩增产物污染来源，因此必须注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。,本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、丙稀酰胺、甲醛或同位素等，应注意实验人员的安全防护。,本区如采用负压或减压情况下可减少扩增产物从本区扩散至前面区域的可能性,二、质量保证,临床基因扩增检验实验室质量保证涉及到整个基因扩增检验所有阶段，即测定分析前的标本采集处理、测定中的核酸提取，扩增和产物分析以及测定后的结果报告等。,（一）标本的采集,（二）标本的稳定化处理,（三）标本的运送,（四）标本的贮存,（五）标本的处理(核酸提取),（六）靶核酸的逆转录,CFIT),和扩增,（七）污染,（八）扩增产物的分析,（九）质量控制,（一）标本的采集,常用于基因扩增检测的临床标本包括,EDTA,或构橼酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。采血液等样本时，应使用一次性密闭容器，如真空采血管。当使用非密闭采样系统时，如尿、分泌物和骨髓的采样，必须注意防止来自采样者的皮屑或分泌物的污染。采样时必须戴一次性手套。,玻璃器皿在使用前应高压处理。,临床用于,RNA（,如,HCV RNA）,扩增检测的血标本建议进行抗凝处理，并尽快（3小时以内）分离血浆，以避免,RNA,的降解。如未作抗凝处理，则抽血后，必须在1小时内分离血清。,（二）标本的稳定化处理,用于,DNA,扩增检测的标本，应及时送至实验室。,用于,RNA,测定的标本应进行稳定化处理，异硫氰酸胍盐(,Guanidine,thiocyanate,，CITC),可使,DNA,酶和,RNA,酶立即失活，因此在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆按1：4的比例加至含有5,molL GITC,的试管中，从而使血清(浆)中的,RNA,酶不可逆失活。,（,三）标本的运送,标本采集后必须尽快送至实验室。,经过稳定化处理的标本可在常温下邮寄运送。,用于,RNA,检测的标本，如果未经稳定化处理，须速冻后，放在干冰中运送。,（四）标本的贮存,临床体液标本如血清血浆等可于-70下长时间贮存。,用于,DNA,测定的已纯化核酸样本可在10,mmol,L,Tris,1mmolL EDTA,缓冲液(,pH7.58.0),中4保存。,用于,RNA,测定的已纯化核酸样本应在缓冲液中-80或液氮中贮存。,用乙醇沉淀的核酸样本贮存在-20即可。,用,GITC,处理的,RNA,标本在室温可保存7天。,（五）标本的处理(核酸提取),标本处理即核酸提取纯化是决定扩增检测成败的关键性步骤，在使用商品核酸提取试剂提取临床标本中的核酸模板前，应对其进行充分评价以验证其提取的有效性。,当靶核酸为,RNA,时，逆转录,PCR,测定失败的常见原因是标本在运送前未经充分的稳定化处理及核酸提取试剂的,RNA,酶的污染。故建议使用高质量的商品核酸提取试剂。,（六）靶核酸的逆转录(,RT),和扩增,1靶,RNA,的逆转录,下述因素通常影响,cDNA,合成的效率：(1)逆转录效率的降低或完全缺乏。其可能的原因有逆转录酶质量不高、试剂降解变质或加样错误等；(2)用于逆转录的标本中存在逆转录或,Taq,酶的抑制物(如酚、氯仿、血红素等)；(3),RNA,酶的存在导致,RNA,的降解。,2核酸的扩增,有多种因素可引起核酸扩增检测的假阳性或假阴性结果，如扩增靶核酸中抑制剂存在、,Taq,酶失活、退火温度不对、,Mg,2+,浓度不佳、患者标本或试剂受污染等。扩增仪孔中热传导的均一性极为重要，必须定期对扩增仪的温度控制和加热模块中热传导的一致性进行检查，以避免假阴性结果。,（,七）污 染,在实际工作中，常见有以下几种污染类型：扩增片段的污染（产物污染）、天然基因组,DNA,的污染、试剂污染（储存液或工作液）以及标本间交叉污染（如气溶胶从一个阳性标本扩散到原本阴性的标本）。临床基因扩增检验实验室中污染的最主要来源是扩增产物的污染。,1测定分析前的污染源,2测定分析阶段的污染源,3污染的避免,工作区的严格划分的目的即是为了预防污染。为避免以,前测定中所产生的扩增产物的污染，可设法将其破坏掉。如在扩增,反应中用,dUTP,取代部分,dTTP,，,持续的长波紫外灯照射，不能用其来,替代严格的实验室设置和管理，尤其是这些方法不能防止外来非扩,增的天然,DNA,的污染。,4去除污染的措施:次氯酸钠、紫外线照射、高压消毒,（,八）扩增产物的分析,扩增产物的测定有各种方法，如电泳、限制性酶切、斑点印迹、探针杂交、测序、分光光度法定量等，但临床,PCR,检验项目基本上都使用探针杂交方法。,杂交检测时应严格遵守商品试剂盒确定的杂交程序盒杂交条件。,（,九）质量控制,必须对,DNA,和,RNA,分析的各步进行质量控制，以避免假阳性和假阴性，保证测定结果的准确性和重复性。由于核酸扩增测定的高敏感性，所以标本制备、逆转录、扩增本身和产物分析中的每一步都要求有质控措施。,目前的商品试剂盒大部分没采用内标方法质控。因此，在测定血清/血浆病原体核酸如,HBV DNA、HCV RNA,等时，应使用已知的弱阳性血清/血浆作为质控样本，与待测临床标本等同处理提取核酸及扩增，以判断逆转录及扩增检测的效果。,每一个,PCR,实验中都必须设有外加阴性质控（污染监测质控），为判断扩增过程中污染出现的阶段，阴性质控可包括如下几种：即在样品制备的整个过程中所带的空白管、仅有扩增反应液但不含扩增模板的反应管、阴性标本等。阴性标本可以评估,PCR,试验的综合质量。,谢 谢,