植物组织培养培养基及操作技术.ppt

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element),1),大量元素：,指浓度大于,0.5mmol,L,的元素。,N,、,P,、,K,、,Mg,、,S,和,Ca,等,。,2),微量元素：,指小于,0.5mmol,L,的元素。,Fe,，,B,，,Mn,，,Cu,，,Mo,，,Cl,等,。,.,在细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动。,种类：,V,Bl,(,盐酸硫胺素,),、,V,B6,(,盐酸吡哆醇,),、,Vpp(,烟酸,),、,Vc,（抗坏血酸）、,V,H,(,生物素,),、,V,B11,(,叶酸,),、,V,B12,（钴胺素,),等。,使用浓度：,一般用量为,0.11.0mg,L,。,2,、维生素,(vitamin),.,又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。,使用浓度,：一般为,lOOmg,L,，,作用,：适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。,3,、肌醇,培养基及其配制,.,作用,：是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。,种类,：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。,使用浓度,：为,10,200mg,L,。,4,、氨基酸,(amino acid,）,培养基及其配制,.,5,、有机附加物（天然复合物）,10%20%,150-200ml,L,150200g,L,0.01%-0.05%,浓度：,培养基及其配制,.,6,、植物生长调节物质,(hormone),赤霉素（,gibberellic acid,）,细胞分裂素类,(cytokinin),生长素类,(auxin),培养基及其配制,.,*,作用,：,主要被用于诱导愈伤组织形成；促进细胞脱分化；促进细胞伸长；促进生根。,在促进生长方面，根对生长素最敏感。在极低的浓度下，,(10,-5,10,-8,mg,L),就可促进生长，其次是茎和芽。,（,1,）生长素类,培养基及其配制,.,吲哚乙酸：,IAA,（,indo acetic acid,）,萘乙酸：,NAA,（,naphthalene acetic acid,）,吲哚丁酸：,IBA,（,indolebutyric acid,）,2,4-,二氯苯氧乙酸：,2,4D,(2,4-dichlorophenoxybutyric acid),生长素种类：,培养基及其配制,.,生长素作用强弱顺序：,IAA(,吲哚乙酸,),NAA(,萘乙酸,),IBA(,吲哚丁酸,),2,4D(2,4,二氯苯氧乙酸,),强,弱,培养基及其配制,.,种类：,6BA(6,苄基腺嘌呤,),Kt(kinetin,激动素,),Zt(zeatin,玉米素,),（,2,）细胞分裂素类,细胞分裂素作用：,促进细胞分裂与扩大。,诱导芽分化，促进侧芽萌发，使茎增粗，抑制茎伸长。,抑制根的分化,。,培养基及其配制,.,细胞分裂素作用强弱顺序,Kt(,激动素,),6BA(6,苄基腺嘌呤,),Zt(,玉米素,),强,弱,培养基及其配制,.,GA,3,（赤霉酸）：,作用,：促进幼芽伸长生长，促进不定胚发育成小植株。,赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响：当,生长素赤霉素比值高,时有利于,木质部,分化，,比值低,时有利于,韧皮部,分化。,（,3,）赤霉素,培养基及其配制,.,7,、培养材料的支持物,-,琼脂,(agar),固体培养时最好的,固化剂,。,用量：,6,10g,L,。,琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至,40,即凝固为固体状凝胶。,琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与,高压灭菌时的温度、时间、,pH,值,等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。,培养基及其配制,.,固体培养基的特点（与液体培养基相比）,:,优点,:,操作简便，通气问题易解决，便于观察研究。,缺点,:,培养物与培养基的接触,(,即吸收,),面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分充分利用，同时培养物排出的代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。,固体培养,液体培养,培养基及其配制,.,8,、抗生物质,(antibiotic),种类：卡那霉素、头孢霉素、,青霉素、链霉素、庆大霉素等。,浓度：,520mg/L,。,作用：,可,防止菌类污染,。,培养基及其配制,.,9,、活性炭,(active carbon),目的：,是,利用其吸附能力，减少一些有毒物质的影响,；利于生根。,使用浓度：,15g,L,。,它的颗粒大小决定着吸附能力：粒度越小，吸附能力越大；温度低吸附力强，温度高吸附力减弱，甚至不吸附。,培养基及其配制,.,10,、水（,water),作用：,是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。,注意：,用蒸馏水，最好是重蒸馏水；以保持培养基成分的精确性。大规模生产时可用自来水。,培养基及其配制,.,二、培养基的,PH,值,(pH value),1,、多数植物要求,pH5.6-5.8,2,、用,0.1-1N,的,NaOH,和,0.1-1N,的,HCI,调节,.,3,、,注意：,经高压灭菌后，培养基,pH,会下降,0.2-0.8,故调整,pH,值时,应高于,0.5,；,pH,的大小会影响琼脂的凝固能力，当,pH,6.0,时，培养基将会变硬，,pH 5.0,时，琼脂凝固不好。,培养基及其配制,.,种类,最适,pH,值,种类,最适,pH,值,杜鹃,4.0,月季,5.8,越桔,4.5,胡萝卜、石刁柏,6.0,蚕豆,5.5,桃,7.0,番茄,5.7,培养基及其配制,不同植物对培养基最适,pH,值的要求不同,(,见表,),.,培养基,(culture medium),：,是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一,合适的培养基，培养才有可能成功,。,三、培养基的种类、配方及特点,培养基及其配制,.,1,、根据态相不同：固体培养基、液体培养基,2,、根据培养物培养过程：初代培养基、继代培养基,3,、根据作用不同：诱导培养基、增殖培养基、,生根培养基,4,、根据营养水平：基本培养基、完全培养基、,改良培养基。,（一）培养基的种类,培养基及其配制,.,若只含有大量元素与微量元素和碳水化合物的培养基，称为,基本培养基,。,在基本培养基的基础上，添加各种各样的生长调节物质和其他有机附加物的培养基叫,完全培养基。,初代培养基：,指用来第一次接种外植体的培养基。,继代培养基：,指用来接种初代培养之后培养物的培养基。,培养基及其配制,.,1,、,MS,培养基：,它是,1962,年由,Murashige,和,Skoog,为培养烟草细胞而设计的。是目前应用最广泛的培养基。,特点：,是无机盐离子浓度较高，有高含量的,N,、,K,，硝酸盐量大，营养丰富。,（三）常用的培养基及特点,培养基及其配制,.,成分名称,药品 名称,原配方量,(mg)/L,大量元素,NH,4,NO,3,1650,KNO,3,1900,CaCl,2,2H,2,O,440,MgSO,4,7H,2,O,370,KH,2,PO,4,170,微量元素,MnSO,4,H,2,O,22.3,ZnSO,4,7H,2,O,8.6,CoCl,2,6H,2,O,0.025,CuSO,4,5H,2,O,0.02,H,3,BO,3,6.2,Na,2,MoO,4,2H,2,O,0.25,KI,0.83,铁盐,FeSO,4,7H,2,O,28.7,Na,2,-EDTA,37.3,有机物,烟酸,(Vpp),0.5,盐酸吡哆醇,0.5,盐酸硫胺素,0.1,肌醇,100,甘氨酸,2,（二）,MS,培养基配方,.,2,、,White,培养基：,1943,年由,White,为培养番茄根尖而设计的。,特点：,无机盐浓度较低，适于生根培养。,3,、,N6,培养基：,1974,年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。,特点：,成分较简单，,KNO,3,和（,NH,4,）,2,SO,4,含量高，不含钼。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花粉和花药培养。,培养基及其配制,.,(4)B,5,培养基,:,是,1968,年由,Galmborg,等为培养大豆根细胞而设计的。,特点：,是含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。,(5)KM,8P,培养基,:,它是,1974,年为原生质体培养而设计的。,特点：,是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素。,培养基及其配制,.,2,、,White,培养基,1943,年由,White,为培养番茄根尖而设计,1963,年作了改良，提高,MgSO,4,的浓度和增加硼元素,无机盐浓度较低,使用广泛,在生根培养、胚胎培养中有良好的效果,大量元素,含量,(mg/L,）,微量元素,含量,铁盐,含量,有机物,含量,(mg/L,其他,含量,KNO,3,80,H,3,BO,3,1.5,Fe,2,(SO,4,),3,2.5,肌醇,100,蔗糖,30000,Ca(NO,3,),2,4H,2,O,300,MnSO,4,4H,2,O,7.0,烟酸,0.3,琼脂,8000,MgSO,4,7H,2,O,720,ZnSO,4,7H,2,O,3.0,盐酸硫胺素,0.1,NaH,2,PO,4,4H,2,O,16.5,MoO,3,0.0001,盐酸吡哆醇,0.1,KCl,65,CuSO,4,5H,2,O,0.001,甘氨酸,3,Na,2,SO4,200,.,3,、,B5,培养基,1968,年由,Gamborg,等为培养大豆根细胞而设计,含有较低的铵盐,较高的硝酸盐和盐酸硫胺素,组成成分,数量,(mg/l,）,组成成分,数量,(mg/l),KNO,3,2500,FeSO,4,7H,2,O,27.8,CaCl,2,2H2O,150,CuSO,4,5H,2,O,0.025,MgSO,4,7H2O,250,蔗糖,40,(NH,4,),2,SO4,134,pH,5.5,KI,0.75,肌醇,100,H,3,BO,4,3.0,烟酸,1.0,MnSO,4,4H,2,O,10,盐酸吡哆醇,1.0,ZnSO,4,7H,2,O,2.0,激动素,0.1,Na,2,MoO,4,2H,2,O,0.25,2,4,D,0.1,1.0,CoCl,2,6H,2,O,0.025,盐酸硫铵素,10,Na,2,-EDTA,37.3,B5,培养基的组成和配方,.,4,、,N6,培养基,1974,年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养设计,KH,2,PO,4,和（,NH4,）,SO4,含量高，不含钼,组成成分,数量,(mg/l),组成成分,(mg/l),KNO,3,2.3,Na,2,EDTA,37.3,CaCl,2,2H,2,O,166,FeSO,4,7H,2,O,27.8,MgSO,4,7H,2,O,185,蔗糖,50,KH,2,PO,4,400,pH,5.8,(NH,4,),2,SO,4,463,烟酸,0.5,KI,0.8,盐酸吡哆醇,0.5,H,3,BO,3,1.6,甘氨酸,2.0,MnSO,4,4H,2,O,4.4,盐酸硫铵,1.0,ZnSO,4,7H,2,O,1.5,N6,培养基组成及配方,.,第二节,培养基的,配制,.,一、培养基的配制,（一）、母液,(stock solution),的配制和保存,所谓,母液,是欲配制液的,浓缩液,。,意义,:,保证各物质成分的准确性,配制时的快速移取,便于低温保藏。,一般母液配成比所需浓度高,10-100,倍。,母液配制时可分别配成,大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等,。,培养基及其配制,.,单配法：,将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。一般用,mg/ml,或,mg/L,表示。,混配法：,将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后再混合成母液。,配制生长素类：,可先用少量,0.1N,的,NaOH,或,95%,酒精助溶,。浓度为：,1-5mg,ml,。,配制细胞分裂素类：,一般先用少量,0.5-1N,盐酸加热溶解,。浓度为：,1-5mg,ml,。,培养基及其配制,母液的配制方法：,.,培养基母液的配制,母液名称,药品 名称,原配方量,(mg)/L,扩大倍数,称取量,(mg),母液体积,(ml),移取量,(ml)/L,大量元素母液,NH,4,NO,3,1650,10,16500,1000,100,KNO,3,1900,10,19000,CaCl,2,2H,2,O,440,10,4400,MgSO,4,7H,2,O,370,10,3700,KH,2,PO,4,170,10,1700,微量元素母液,MnSO,4,H,2,O,22.3,100,2230,1000,10,ZnSO,4,7H,2,O,8.6,100,860,CoCl,2,6H,2,O,0.025,100,2.5,CuSO,4,5H,2,O,0.02,100,25,H,3,BO,3,6.2,100,620,Na,2,MoO,4,2H,2,O,0.25,100,25,KI,0.83,100,83,铁盐母液,FeSO,4,7H,2,O,28.7,100,2870,1000,10,Na,2,-EDTA,37.3,100,3730,有机物母液,烟酸,(Vpp),0.5,50,25,500,10,盐酸吡哆醇,0.5,50,25,盐酸硫胺素,0.1,50,5,肌醇,100,50,5000,甘氨酸,2,50,100,培养基及其配制,.,配制方法：,1,）、将母液按,顺序,摆放,2,）、取适量的蒸馏水,(,所需培养基量的,2/3),入容器,3,）、按需要量依次取母液及生长调节物质,4,）、加入蔗糖,(30g/L),溶解,5,）、加琼脂,(6-10g/L),，煮沸，,2-3min,5,）、,定容,6),、调,PH,值,(pH=5.8),7),、,分装培养瓶，封口,8),、高压灭菌,培养基及其配制,.,.,第三节,组培技术（,灭菌、接种、培养、移栽驯化,）,.,消毒,:,是指杀死、消除或充分,抑制,部分微生物，使之不再发生危害作用。,灭菌,:,是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的,一切微生物或生物体,，即把所有生命的物质全部杀死。,培养基及其配制,一、培养基的灭菌,.,常用的灭菌方法,物理方法,化学方法,干热灭菌,(,烘烧和灼烧,),湿热灭菌,(,常压或高压蒸煮,),射线处理,(,紫外线、超声波、微波,),过滤除菌,大量无菌水冲洗,升汞,(,氯化汞,),甲醛,(,福尔马林,),过氧化氢,高锰酸钾,来苏儿,漂白粉,次氯酸钠,酒精,培养基及其配制,.,培养基的灭菌湿热灭菌法,培养基在制备后的,24h,内完成灭菌。,高压灭菌的原理,：,在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在,108kPa,的压力,下，锅内,温度达,121,。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。,培养基及其配制,.,将锅内,空气,完全排除后，关闭放气阀。,当压力表上升达,108kPa,时，锅内温度达,121,（在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢），维持,15-30min,。,培养基及其配制,灭菌方法：,.,.,灭菌锅有很多种，实验室中常用手提式高压蒸汽灭菌锅，使用时要注意一下几点：,1,、锅中应放足量的水，以免造成空烧或干烧；,2,、装锅时不要过度倾斜，可保持内部有一定的空,间，利于蒸汽流动；,3,、增压前高压锅内的空气必须排净，否则易影响,灭菌效果；,.,4,、灭菌过程中，应尽量保持压力恒定，严格遵守灭菌时间；,5,、排气降压时应缓慢进行；,6,、只有待高压锅内压力表指针恢复到零后，才能开启压力锅；,7,、高压锅工作时，应有专人看守。,.,高压灭菌的原理,在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在,0.1MPa,的压力下，锅内温度达,121,。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。,.,注意事项,完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到,0.05MPa,时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到,0.1MPa,时,开始计时，维持压力,0.1,0.15MPa 20,分钟。,.,在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，,其原因有三,：一是湿热中细菌菌体吸收水分，,蛋白质较易凝固,，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是,湿热的穿透力比干热大,；三是,湿热的蒸汽有潜热,存在，每,1,克水在,100,时，由气态变为液态时可放出,2,26kJ,（千焦）的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。,在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，,灭菌锅内冷空气的排除,是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。,如果压力未降到,0,时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，,使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口,，造成棉塞沾染培养基而发生污染，需逐渐减压。,.,过滤灭,(,除,),菌（不耐热的物质）,一些生长调节剂,(,赤霉素、玉米素,),、某些维生素是不耐热的，常用,过滤灭菌,-,细菌过滤器,方法。,防细菌滤膜网孔的直径为,0.45m,以下，可阻止细菌细胞和真菌的孢子通过。,培养基及其配制,.,空间及物体表面灭菌,培养基及其配制,熏蒸剂,:,甲醛,和,高锰酸钾，,1,周后通风,1,天,。,(1),紫外线灭菌,(2),熏蒸灭菌,10-20,分钟,.,灭菌后的培养基经冷却和凝固后即可使用，检验灭菌效果。,检验方法：,将培养基置于培养室中,3,天，若没有污染现象，说明灭菌可靠，可以使用。,保存在低温条件下。常温下保存时要进行防尘和避光处理。,保存时间不可过长。,培养基的保存,.,二、外植体的选择和灭菌,1,、外植体的选择,2,、外植体的灭菌方法,3,、污染原因和预防措施,.,1,、外植体的选择,植物组织培养的主要过程大致包括：培养基的制备、,外植体的选择,、器具的消毒、无菌操作和环境条件的调控。,1,）、选择优良的种质,无论是离体培养繁殖种苗，或者是进行生物技术研究，,选取性状优良的种质，,或,特殊的基因型,。对材料的选择要有明确的目的，具有一定的代表性，提高成功机率，增加其实用价值。,.,2,）、选择健壮的植株,组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫的植株上，,选取发育正常的器官或组织,。因为这些器官或组织代谢旺盛，再生能力强，比较容易培养成功。,3,）、选择最适的时期,组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节、植物的生长发育阶段。如快速繁殖时应在植株生长的最适时期取材，这样不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高,。,.,4,）、选取适宜的大小,培养无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难于成活。一般选取培养材料的大小，在,0.5cm-1.0cm,。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。,.,三、外植体的灭菌方法,1,、常用灭菌药剂的使用和效果,2,、外植体的灭菌方法,.,1,、常用灭菌药剂的使用和效果,灭菌剂,使用浓度（,%,）,清除的难易,消毒时间,效 果,次氯酸钙,910,易,530,很好,次氯酸钠,2,易,530,很好,漂 白 粉,饱和浓度,易,530,很好,氯 化 汞,0.11,较难,210,最好,酒 精,7075,易,0.22,好,过氧化氢,1012,最易,515,好,溴 水,12,易,210,很好,硝 酸 银,1,较难,530,好,抗 菌 素,450mg/L,中,3060,较好,.,2,、外植体的灭菌方法,外植体在接种前先要灭菌，在灭菌前，又先要进行,预处理,。植物材料一般采取的预处理方法是：,先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很多,细菌,和,真菌,，因此还需进一步灭菌。,.,常规的表面灭菌处理方法,把材料放进,70%,的酒精中约,30s,。,用,0.1%,的升汞（,HgCl,2,）浸泡,5,10min,。,或用,10%,的,次氯酸钠溶液,浸,泡,10,15min,。,无菌蒸馏水冲洗,3,5,次。,灭菌时进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好,的接触。,在灭菌剂里滴入数滴,0.1%,的,Tween20,（吐温）,或,Tween80,湿润剂，则灭菌效果更好。,.,四、污染原因和预防措施,1,、污染的原因,污染,是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。,污染的原因：,从病原菌方面来分析主要有细菌及真菌两大类；从污染的途径而言，主要是由于外植体带菌、培养基及器皿灭菌不彻底、操作人员未遵守操作规程等引起的。,.,细菌污染的特点,：,在外植体附近的培养基中出现,浑浊,和,云雾状,痕迹。,一般在接种后,1,2,天即可发现。,原因：材料带菌；,培养基灭菌不彻底；,操作人员未遵守操作规程。,因此接种人员的手应经常用,70%,酒精擦洗，镊子、剪刀、接种针在使用前必须在火焰上烧红。,.,真菌污染的特点,：,培养瓶内往往会出现白、黑或绿等不同颜色,菌丝,块。,在接种后,3,10,天才能发现。,原因：周围环境不清洁；,超净工作台的过滤装置失效；,培养瓶等器皿的口径过大。,为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作环节注意防止污染的发生。,.,2,、污染的预防措施,发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环境污染。,对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为严格的灭菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。,要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先,集中进行高压灭菌,，再清除污染物，然后洗净备用。,.,1,）,防止材料带菌的措施,（,1,）用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对,枝条先进行,预培养,。,枝条,水洗净,插入无糖的营养液或自来水,抽枝 以这种新抽的嫩枝条作为外植体,接种。这样便可大大减少材料的污染。,在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养，待,抽出的黄化枝条时采枝，经灭菌后接种也可明,显减少污染。,.,（,2,）选择合适的时间去田间采取外植体,避免,阴雨天,去田间采取外植体。,在晴天采取外植体时，下午采取的外植体要比早晨采的污染少，因材料经过日晒后可杀死部分细菌或真菌,。,.,但目前对材料内部污染还没有令人满意的灭菌方法,。在菌类长入组织内部时，不但要除去上年生的鳞片，甚至要除去韧皮组织，只接种内部的分生组织，以收到一定的防污染效果。,.,2,）外植体的灭菌,（,1,）多次灭菌法：,首先除去主脉（因主脉与支脉交界处常有真菌休眠孢子存在）；,其次，将切好的外植体放入,1.3%,的次氯酸盐溶液中，灭菌,30min,；,第三，在无菌蒸馏水中冲洗,3-5,次；,第四，将材料封闭在无菌的培养皿中过夜，保持一定温度；,第五，次日将叶片用,2.6%,次氯酸钠灭菌,30min,，然后用蒸馏水洗,3-5,次。,.,（,2,）多种药液交替浸泡法,对容易污染而难灭菌的材料：,首先取茎尖、芽或器官外植体，用自来水及肥皂充分洗净，表面不可附着污垢、灰尘，用剪刀修剪掉外植体上无用的部分，剥去芽上鳞片；,第,2,，将材料放入,70%,酒精,中灭菌数秒钟；,第,3,，在,1,：,500,Roccal,B,（一种商品灭菌剂名）稀释液中浸,5min,；,第,4,，放入,5%,10%,次氯酸钠,溶液中并滴入,“,吐温,80,”,数滴，灭菌,15,30min,，或浸入,0.1%,0.2%,升汞,溶液中并加入,“,吐温,80,”,数滴，灭菌,5,10min,；,第,5,，用无菌水冲洗,5,次。也可从次氯酸钠溶液中取出后，再放入无菌的,0.1M,盐酸,中浸片刻，再用无菌水冲洗数次。,.,3,）玻璃器皿的灭菌,湿热灭菌法,即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭菌锅中进行高温高压灭菌，灭菌时间可延长达,25min,30min,。,干热灭菌法,即将玻璃器皿置入电热烘箱中进行灭菌。,煮沸灭菌,即将玻璃器皿放入水中煮沸进行灭菌。,.,4,）金属器械的灭菌,火焰灭菌法：,即把金属器械放在,95%,的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃烧灭菌。这一步骤应当在无菌操作过程中反复进行。,干热灭菌法：,即将擦洗干净或烘干的金属器械用纸包好，盛在金属盒内，放在烘箱中灭菌。,.,湿热灭菌法：,工作服、口罩、帽子等布质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的的布质品，放入高压锅中，,121,C,的温度，灭菌,20 min,30min,。,5,）布质制品的灭菌,.,6,）无菌操作室的灭菌,无菌操作室的地面、墙壁和工作台的灭菌可用,2%,的新洁尔灭或,70%,的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约,20-30min,。使用前用,70%,的酒精喷雾，使空间灰尘落下。一年中要定期一、二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。,.,7,）操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进行,.,在接种前要,剪除指甲,，并用肥皂或洗衣粉溶液洗手，,最好在新洁尔灭溶液中浸泡,10min,，后用,75%,的酒精擦手，并用,75%,的酒精擦拭接种,瓶表面,进行消毒，以防把微生物带进超净工作台。,工作人员在接种时，,最好不要感冒咳嗽和说话,。操作人员操作动作要熟练、动作快、规范，这样可以缩短操作时间，减少污染,。,如脱毒培养的茎尖很小，操作时间长了就会使茎尖失水变干，或不慎感染杂菌。,.,小 结,1,、外植体的选择：优良种质、健壮植株、最适的时期、适宜的大小。,2,、外植体的灭菌方法：,9,种常用灭菌药剂的使用及其效果、外植体的灭菌方法。,3,、污染原因和预防措施：污染的原因、污染的预防措施（防止材料带菌、外植体的灭菌、器皿与金属器械的灭菌、布质制品的灭菌、无菌操作室的灭菌、操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进行）。,.,四、外植体的接种和培养,1,、外植体的接种,2,、培养条件,.,1,、外植体的接种,外植体的接种,是把经过表面灭菌后的植物材料在无菌环境中切割或分离出器官、组织、细胞并转入到无菌培养基上的全部操作过程。,操作过程中引起的污染，主要由空气中的杂菌和工作人员本身引起的。因此除接种室空气消毒外，应特别注意防止工作人员本身引起的污染。,整个接种过程均须,无菌操作：,.,酒精擦拭手,外植体消毒,浸泡,5min,器械消毒,酒精灯灼烧,接种的具体操作,.,旋转灼烧,取外植体,接种,盖好瓶塞,.,1,操作人员需穿着经消毒的白色工作服，戴口罩、帽子、鞋套。进入接种室前，双手必须进行消毒，用肥皂和水洗涤能达到良好的效果,进行操作前再用,75%,的酒精擦洗双手。,2,操作期间经常用,75%,的酒精擦拭双手和台面。特别注意防止“双重传递”的污染，例如器械被手污染后又污染培养基等,。,.,3,在打开培养瓶、三角瓶或试管时，最大的污染危险是,管口边沿,沾染,的微生物,落入管内，解决这个问题，可在打开前用火焰烧瓶口。如果培养液接触了瓶口，则瓶口要烧到足够的热度，以杀死存在的细菌。为避免灰尘污染瓶口，可用,纸,包扎瓶口和塞子，以遮盖瓶子颈部和试管口，相对地减少污染机会。,.,4,工具用后及时消毒，避免交叉污染。,5,工作人员的呼吸也是污染的主要途径。通常在平静呼吸时细菌是很少的，但是谈话或咳嗽时细菌便增多，因此操作过程应,禁止不必要的谈话,并戴上口罩。,.,6,由于空气中有灰尘，因此在操作时，仍要注意避免灰尘的落入。尽量把盖子盖好，当打开瓶子或试管时，,应拿成斜角，,以免灰尘落入瓶中。刀、剪、镊等用具，一般在使用前浸泡在,95%,酒精中，用时在火焰上消毒，待,冷却后,使用。每次使用前均需进行用具消毒。,.,外植体的培养条件,接种后的外植体应送到培养室去培养。组织培养的优点之一就是在人工控制的环境条件下，使培养物生长发育，研究植物的生命活动。培养室的培养条件要,根据植物对环境条件的不同需求进行调控,。其中最主要的是光照、温度、湿度、氧气和培养基的,pH,值等。,.,1,、,光照,对离体培养物的生长发育，光照条件有重要的作用。,通常对愈伤组织的诱导，在黑暗条件下有利，,在有光条件下培养的愈伤组织质地和颜色也有不同。,但分化器官需要光照，,并随着芽苗的生长需要加强光照。加强光照，可以使小苗生长健壮，促进,“,异养,”,向,“,自养,”,转化，提高移植的成活率。普通培养室要求每日光照,12h-16h,，光照强度,1000lx-5000lx,。如果培养材料要求在黑暗中生长，可用铝箔或者适合的黑色材料包裹在容器的周围，或置于暗室中培养。,.,2,温度,离体培养中对温度的调控要比光照显得更为突出。不同的植物有不同的最适生长温度，大多数植物最适温度在,23,C-32,C,之间。,培养室一般所用的温度是,25,C2,C,。,低于,15,C,或高于,35,C,，对生长都是不利的。,.,3,湿度,组织培养中的湿度影响主要有两个方面，一是培养容器内的湿度，它的湿度条件常可保证,100%,。二是培养室的湿度，它的湿度变化随季节和天气而有很大变动。湿度过高过低都是不利的，过低会造成培养基失水而干枯，或渗透压升高，影响培养物的生长和分化；湿度过高会造成杂菌滋长，导致大量污染。因此，要求室内保持,70%-80%,的相对湿度。,.,4,氧气,植物组织培养中，外植体的呼吸需要氧气。在液体培养中，振荡培养是解决通气的良好办法。,.,低,CTK/IAA,外植体,愈伤组织,芽,根,脱分化,再分化,低,CTK/IAA,根,完 整 植 株,生长调