转基因动植物.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,转基因,(,transgenic,),动植物,就是用基因工程的方法将人们需要的外源目的基因导入动、植物体内，整合到动、植物的染色体上，与内源基因在一起，随细胞的分裂而复制，在生物体内得到表达，并能稳定地遗传。,整合到动植物基因组上的外来结构基因称为,转基因,(transgene,),，由转基因的蛋白质称为,转基因产物,，通过转基因产物影响动物性状。,第七章 转基因动植物,1,转基因将涉及到人类的基因治疗、转基因食品、,体细胞克隆、以及农业、畜牧业和药物、食品工,业的微生物育种和生物制药的发生器等。其目的,无非是治疗遗传病，改良动植物品种，提高食品,的营养价值和生产更好更廉价的药物，提高人类,的生活质量。,2,用基因工程技术来产生四类转基因生物,:,科学家们用,P,因子,转化果蝇，来研究胚胎发育；,通过转染和,生物射弹,（,biolistics,）,对植物进行,DNA,转染；,制备人类疾病的动物模型；,产生,转基因家畜,。,其他两种转基因模型生物是,线虫,（,C.elegans,）,和小型热带鱼类,斑马鱼,(,Danio rerio,),。,3,第一节,果蝇发育的分子生物学,分子克隆技术一开始一些遗传学者就制备了一系,列果蝇的突变品系，他们利用这些突变体在果蝇,基因组中对特定基因进行物理定位。先用,RNA,印,迹,来研究基因表达，并用原位分子杂交来进行定,位。直到将克隆,DNA,插入到果蝇的生殖细胞中人,们才能开始了解发育过程是怎样控制的。,4,一、,P,因子介导的转化,转座因子含有两个功能区：,（,1,）转座因子两端的,DNA,重复序列，此是整合和切离所需要的；,（,2,）编码转座酶的,DNA,序列，此是转座所需要的。,A.Spradling,和,G.Rubin,根据在其他系统中转座因子的研究，论述了克隆的,P,因子序列可用于构建果蝇的表达载体，诱导克隆的,DNA,的“终末”转座到果蝇的生殖细胞中。他们使用的技术是用鉴别转座基因的标记基因和待测定的实验基因取代克隆,P,因子,中的转座酶编码序列。,5,基,因,调,节,区,转座酶,雌蝇,雄蝇,收集受精卵,将质粒,DNA,直接微注射入卵中,10,天,(a),P,因子转座是用纯化的质粒,DNA,共注射果蝇的胚胎，使其整合到生殖系,DNA,中的方法。,P,因子转化质粒上的标记基因是一种编码眼色素的序列。它可通过玫瑰红眼,(,ry+,),用来鉴别转基因，相反，未转化的果蝇是白色眼,(,ry-,),。,G,0,G,1,CAAT,SP1,AP1,6,G,4,(a),在这个例子中，调节区插在表达的发育基因（,ry+,）,5,端,lac Z,报导基因的上游。带有玫瑰红（,ry+,）眼的第二代雌蝇,(,G1,),中每个细胞都含有,P,因子,，并可用来控制,lacZ,报导基因在早期胚中的表达。鉴别带有单个,P,因子,插入的果蝇，与,G1,果蝇回交产生纯合的同基因品系。正如例中所示，在早期胚中，内源靶基因的蛋白质表达模式和,lacZ,报导基因相同，表明克隆的靶基因调节区是完全有功能的。,7,在转入,lacZ,基因的雌蝇和缺陷型雄蝇,(,不能产生早期胚发育所需的转录因子,),之间进行杂交，能用来测定转录因子控制的靶基因的特异性表达,8,二、,P,因子增强子,阱,载体,增强子阱,(,enhancer trap,),是将某报导基因与一个最小化的启动子相偶连，组成一,增强子,阱,重组体,，即该启动子能够与转录因子结合但活性很低，而需由被插入的增强子帮助才可正常转录。,如果增强子捕获重组体整合进增强子的作用区域，那么启动子的活性就会激增，使报导基因得到充分表达，则可推知插入位点附近有增强子存在，即以该,增强子阱重组体,来探测增强子是否的目的。,9,10,品系,1,品系,2,产生独立的,Gal4,增强子捕获品系,弱,启,动,子,区,转座酶,11,品系,1,品系,2,Gal4,结合位点,Gal4,待测品系,翅特异增强子阱,腹部特异增强子阱,12,Gal4,增强子阱方法是用通过筛选转基因果蝇来,鉴别细胞特异增强子，这些果蝇表现出,Gal4,控,制的,IacZ,基因的有限表达,。在此例中，,品系,1,在翅膀特异基因附近插入了,Gal 4,增强子阱；,品系,2,在腹部体节基因中插入了一个转录的调节区。鉴别细胞特异增强子阱果蝇品系对于研,究靶基因表达调节异常是有用的方法。,Gal 4,增强子捕获的插入通过破坏基因能,导致表型突变，通过重新获得,Gal4,基因邻近的,基因组序列提供了一种鉴别发育基因的方法。,13,三、可介导转化的其他真核转座因子,（一）、,水手因子,(mariner element),水手因子是由,H.M.Robertson,于,1993,年从果蝇中鉴别出的转座因子，并发现存在于多种昆虫中。,水手因子末端为,28 bp,的反向重复序列。中间是编码含有,345aa,的,转座酶,。,14,（二）、,睡美人,（,Sleeping Beauty,，,SB,）,SB,是,水手转座因子,超家族中的一员，长,1.6kb,两侧是,231bp,的,IR,。中央区编码一个转座酶和,DNA,识别区。它能够将自己插入到基因或基因之间，活化或关闭一个基因的正常功能。实验证明，,SB,能将外源基因插入到脊椎动物培养细胞中，包括小鼠的胚胎干细胞及人类细胞。,转座因子,睡美人,的结构特点,15,（三）、,PB(,piggy back,),因子,PB,因子,(,PB,element,),属于真核生物的第二类转座子，“,PB,”,是“,piggy back,(,卡车拖车,)”,的缩写。其来源于粉纹夜蛾,(,Trichoplusia,),，是一个自主因子，长,2.5,kb,，两端有长为,13 bp,短的反向重复序列（,IR,），另外还存在不对称地分布的内部反向重复序列,(,19bp,),，中央区有一个长,2.1kb,可读框，编码转座酶。,16,2005,年,Tian Xu,（,许田,）等成功改造了来源于飞蛾的,PB,因子并将其应用于哺乳动物。,PB,可在人和小鼠细胞株中高效导入基因并稳定表达，为体细胞遗传学研究和基因表达提供了一个高效、便捷的新系统。,17,Dr.Xu is also professor and vice chairman of genetics at Yale School of Medicine,director of the Mouse Functional Genome Project,and adjunct professor and director of the Fudan-Yale Biomedical Research Center at Fudan University.,Tian Xu,PhD,18,19,20,第二节,构建转基因的农作物,提高农作物质量和产量的有两方法。一是杂交育种，但不可能将所有的优良性状组合到一种植物中。二是用杀虫剂和除草剂。长期使用化学药物会导致环境的破坏。而用转基因的方法能克服以上的问题。达到增加产量，改进质量并可抗病虫害以及抗干旱、盐碱等。有两种产生转基因农作物的常用方法：,（,1,）通过根癌农杆菌的,Ti,质粒,转化,双子叶植物,；,（,2,）用,基因抢,等装置发出高速粒子轰击,单子叶植物,等,。,21,植物细胞转染方法,(,吸收裸露的,DNA),聚乙二醇,(PEG),原生质体融合或在,Ca,2+,离子和聚乙二醇存在的情况下直接吸收,DNA,。在植物中，需要从原生质球,/,原生质体中重新产生细胞，虽有效，但费力。,脂质体转染法,DNA,与阳离子脂质体形成复合物，被内吞吸收。是植物原生质球,/,原生质体的高效方法。,电穿孔,通过高电压短暂冲击产生瞬时小孔吸收裸露的,DNA,。是转染酵母、植物和动物细胞非常有效的方法。,22,微弹,(,生物弹,),以钨或金的颗粒包被,DNA,，用,基因枪,(,gene gun,),高速打入细胞,(,原先是改进的短枪，但近来发展了用空气或放电的高压冲击波更精制的装置,),。不需要去除细胞壁，能对植物细胞有效转染。也能用于转染整个植物组织。,接合方法,(,DNA,通过细菌接合转移到真核细胞中,),Ti,载体,用根癌农杆菌的,Ti,质粒,切得的,T-DNA,转化培养的活体植物和植物细胞。重组的,T-DNA,是高效的基因转移载体，尽管只有双子叶植物能被转化。,23,一、根癌农杆菌介导的基因转移,根农癌杆菌可在植物的创伤处产生,冠瘿瘤,（,crown,gall tumors,）,，通过此可鉴别根农癌杆菌的感染。,根农癌杆菌最好的品系是,A,.,tumefaciens,，通过转移,机制它可以传输,25kb,左右的,DNA,，进入到植物细,胞中。此短片段,DNA,称为,转移,DNA,（,transfer DNA,T-DNA,）,，即,Ti,质粒,中可转入植物基因组的,DNA,片段。,这类似于细菌的,接合,（,conjugation,），植物组织创伤区域释放的植物激素的刺激导致了接合的产生。,24,Ti,质粒有四个保守区,Ti,质粒,（,Ti-plasmid,）为长,200kb,左右的单拷贝,A,.,tumefaciens,质粒，有,4,个主要的功能域：,（,1,）,T-DNA,：携带植物激素基因和章鱼碱基因；,（,2,）,vir,区域,：侵入性基因（,virulence genes,）,（,3,）,接合基因,：和质粒转移有关,（,4,）,冠缨碱利用,。,25,T-DNA,冠,瘿,碱,合成基因,vir,致瘤,ori,Ti,质粒,冠,瘿,碱,代谢基,因,细胞分裂,素基因,生长激,素基因,RH,LH,200kb,Ti,(tumour-induced),质粒，根据不同株系，其大小变化在,5-450kbp,之间。有两类,Ti,质粒，分别诱导产生不同的,冠缨碱,，,章鱼碱,(,octapines),或,胭脂碱,(nopalines),。,Ti,质粒一般都有四个保守区域,：,（,1,）,T-DNA,，,携带植物激素基因和章鱼碱基因；,（,2,）是,毒性基因,vir,(virulence),区域,。,（,3,）携带,接合基因,，,与细菌间质粒的转移有关。,（,4,）编码功能与,冠缨碱利用有关,。,26,天然的,Ti,质粒,不能使用。,（,1,）可产生肿瘤。,可采用破坏或删除肿瘤基因来解决。,（,2,）太大，不便操作。,可用两种策略来解决：,a.,将,T-DNA,克隆到中间载体上操作后再 导入根 癌农杆菌中，与内源性,Ti,质粒,重组。,b.,将,T-DNA,和,vir,基因,分别克隆在两个小质粒上。,27,冠瘿瘤,28,中间载体,消除的,Ti,质粒,Ti,质粒,消除的,Ti,质粒,共合体质粒,转基因植物的染色体,(a),重组,消除,转化,29,烟草植物细胞,转基因细胞,细胞培养,移植,转转基因植物,转转,基因,植物,细胞,转基因细胞,(a),为了产生转基因植物，中间载体的大小以易于克隆插入片段为宜。中间载体与消除的,Ti,质粒重组而产生的共合体结构，此质粒在边界间插入了一个可选择的卡那霉素抗性标记。,(b),通过,T-DNA,转化细胞的生长产生转基因植物。,30,vir,区,控制,T-DNA,转移的过程。,vir,区,有,virA,和,virG,两个基因。,virG,编码对受伤植物释放的酚类化合物作出应答的调节因子。,virA,编码受配基刺激自身磷酸化的受体，并将磷酸基转移给,VirG,。,VirG,是,vir,基因座上的转录因子，可诱导,vir,下游基因,virD1,virD2,和,virE2,基因转录。,virD1,virD2,合成内切酶。,T-DNA,序列的两侧有两个,25bp,长的短重复序列元件，称为,T-DNA,的,右边界,（,right border,，,RB,）,序列和,左边界,（,left border,，,LB,）,序列。,31,在,T-DNA,转移的过程中，,VirD1,VirD2,蛋白,能识别,RB,和,LB,序列。,超驱动序列,(overdrive),是邻近右手边界的序列，它通过与,VirC,蛋白,特异的相互作用，指导内切酶到达边界序列，促进,T-DNA,边界序列的缺口剪切，从而增强,T-DNA,的转移。,32,在,T-DNA,转移的过程中，,VirD1,VirD2,蛋白能识别,RB,和,LB,序列。,超驱动序列,(overdrive),是邻近右手边界序,列，它通过与,VirC,蛋白,的特异相互作,用，指导内切酶到达边界序列，促进,T-DNA,边界序列的缺口剪切，从而增强,T-DNA,的转移。,33,T-DNA,Ti,质粒,DNA,VirD1/2,内切酶,vir,tra,VirE2,与,DNA,结合,(,核定位信号,),植物,DNA,植物细胞核,RH,LH,精密的,RH,边界,可变的,LH,边界,VirG,P,P,VirA,酚类化合物,RH,LH,VirD1/2,VirE2,34,重组体,T-DNA,质粒载体除了,LB,和,RB,以外，还含有一些功能单位：,宿主的复制区,ori,；,可供在细菌中选择的抗性标记，如,卡那霉素抗性基因,(,kan,r,),等；,在,LB,和,RB,之间的多克隆位点,(,MCS,),，供外源基因插入；,带有植物显性选择标记基因的启动子，供选择再生植物之用。,35,通过电穿孔,T-DNA,载体进入农杆菌中并选择,tet,r,农杆菌转染损伤的植物细胞,T-DNA,载体,根癌农杆菌,Ti,质粒,36,T-DNA,整合到宿主,植物细胞的基因组中,Ti,质粒,基因产物,诱导植物再生并选择,Kan,r,细胞生长,37,二、用基因抢制备转基因水稻和玉米,大多数粮食作物都是单子叶植物，如水稻、小麦、玉米等。除少数之外，单子叶植物是,抗,根癌农杆菌转化的，由于在双子叶植物和单子叶植物之间对于,创伤的应答反应,和,产生的激素存在着差异,。因此，对于单子叶植物的,DNA,转染方法最初是用,DNA,微注射和电穿孔来处理,原生质体,（,protoplasts,）。由于原生质体的再生能力弱，严重地影响了转化效率。为了解决这个问题，,John Sanford,建立了一种名为,“,基因枪法,”,的单子叶植物转基因的方法。,38,生物射弹,（,biolistics,）或称,基因枪,(,gene gun,),法,这些用爆发力转染染方法其效率是不受细胞类,型的限制。这种,DNA,转染法是用金属钨包被,DNA,片段，制备成微弹通过,22 mm,口径的枪直接发射,来轰击完整植物的分生组织区。,39,40,香港中文大学生物系,辛世文,教授与研究人员員利用基因枪进行转基因实验,41,42,图表示两种,生物射弹装置,。,(a),表示,生物射弹装置,系统。,样本仓,直接放置待转,基因的植物秧苗，微弹由,金属钨,或金制成，内包,有靶基因,DNA,，微弹射入样本仓中的隔筛时，这,种粒子从微载体中释放出。气体基因枪以压缩气,体（氦或氮）转换成的气体冲击波为动力。,生物射弹装置系统有一个产生冲击波的特殊结,构，让微弹穿越，射入在轰击室底部的靶细胞中。,(b),是,手提式基因枪,，通过调整,He,脉冲将包被,DNA,或,RNA,的金粉“子弹”从小塑料管的内壁直接,推进到靶细胞中。,43,用基因枪将,带有报告基,GUS,(,细菌中的,葡糖醛酸酶,基因,),的外源,DNA,射入胡萝卜组织中,(,兰色部分,),。,44,第三节转基因小鼠,一、用受精卵细胞制备转基因小鼠,两种转基因方法，建立小鼠模型来研究人类疾病。,第一种转基因的方法是将,外源,DNA,微注射到单个的胚,细胞中,，产生含有一到多个随机插入表达载体的转基,因小鼠。,第二种方法是在小鼠的基因组特定基因座上,通过同源,重组取代,某些特定的,DNA,序列。,这两种方法建立于,1900,年代，,Abbie Lathrop,发现这,种方法对于繁育宠物鼠是有利的。,45,显微注射,DNA,的方法可分两步进行。首先是使雌鼠,在预先确定的时间,超数排卵,，通过和种雄鼠交配，,产生大量的刚刚受精的单细胞胚胎。第二步是用手,术,收集单细胞胚胎,，经短暂的离心处理后，在显微,操作仪下，用一种显微操作针将,1,皮升含有,500,600,拷贝线性化,DNA,的分子缓冲溶液注入到受精卵的,雄,原核,（,male pronuclei,）中,，然后将此卵移植到假孕,的雌性小鼠子宫内，三周后生下幼鼠，剪断幼鼠的,尾巴，从尾巴中分离,DNA,供,PCR,分析,以确定是否存,在转入的,DNA,序列。,46,负压,正压,DNA,微注射针,DNA,显微操作仪,卵显微操作仪,卵固,定管,倒置显微镜,皮克注射控制器,注射器,用显微操作仪和,DNA,微注射针将纯化的外源,DNA,直接注入到小鼠受精卵的雄原核中。,(a),胚胎注射的三种基本的仪器是放大率为,400,倍的导置显微镜，装有带负压持卵针的显微操作仪（左）和装有,DNA,微注射针的显微操作仪。,47,负压,极体,雌原核,细胞膜,DNA,注入到雄原核中,核仁,透明带,(b),用微注射针将皮克量纯化的,DNA(1g/ml),注入固定在固定管上的受精卵的雄原核中。,48,转基因“建立者”小鼠和同窝中的非转基因小鼠回交通过,PCR,阳性来鉴别出第一代阳性小鼠。,(a),将经注射激素，超数排卵的雌鼠和种雄鼠交配，然后分离受精卵，将,DNA,显微注射入受精卵细胞中。,显微注射,20,30,个受精卵，然后移植入假孕雌鼠的子宫中，,19,天后生产,5,8,个左右的幼鼠。,3,周后从同窝的转基因小鼠的尾巴中采样，通过,PCR,分析鉴别阳性小鼠。,49,转基因,DNA,PCR,产物,通过琼脂糖凝胶电泳分析,PCR,的产物,用,EB,染色凝胶,种雄鼠,超数排卵雌鼠,分离受精卵,将转基因,DNA,显微注射入卵中,19,天,G,0,幼鼠,3,周,从尾巴中分离,DNA,供,PCR,分析用,对照组,PCR,产物,将经显微注射的卵植入假孕雌鼠的子宫中,50,回交,M4,小鼠的生殖细胞中不含转基因,DNA,M2,小鼠是建立者动物,通过琼脂糖凝胶电泳分析,PCR,的产物,G,1,幼鼠,(b),通过,PCR,分析鉴别出的阳性小鼠与非转基因鼠回交来鉴别含有生殖系,DNA,整合建立者动物。,51,在转基因小鼠中，细胞特异启动子能在特异类型组,织中表达外源基因。图中的实验表示前列腺特异启,动子能被用来产生前列腺癌的转基因鼠模型。由于,DNA,整合到小鼠的基因组中的特定区域，影响转基,因启动子特异表达。经,RNA,印迹,分析可鉴别带有预,期转基因表达模式,(PO2),的,“,建立者,”,小鼠。研究了,“,建,立者,”,子代小鼠的经前列腺组织可以确定那些是人类,前列腺癌的转基因模型鼠。,52,显微注射,受精卵,通过回交和,PCR,分,析鉴别建立者小鼠,从“建立者”鼠的肝、肾和前列腺,中分离,RNA,并通过,RNA,印迹分析,PO3,PO1,PO4,PO2,53,癌基因转录本,肌动蛋白,PO2“,建立者”品系具有特异的前列腺癌基因表达,PO2,雌鼠没有卵巢肿瘤,PO2,雄鼠在青春期前没有前列腺肿瘤,PO2,成年雄鼠具有有大的前列腺肿瘤,54,二、通过干细胞的同源重组进行,基因敲除,在“,敲除,(,knockout,，,KO,),”,小鼠产生之前有两种方法,取得了突破，这两种关键的发明是：,（,1,）培养多潜能性小鼠,胚胎干细胞,(embryonic,stem,，,ES,),，它能和非转基因鼠的囊胚组合；,（,2,）建立了,DNA,克隆载体,和筛选细胞系的方法，,使被转染的细胞和外源,DNA,经历了同源重组。,55,细胞,被转染,新霉素,类似物,GCV 9-,鸟嘌呤,药物前导,物培养基,56,定向突变,(targeted mutation),或,敲除,。,(1),在体外将,neo,r,基因插入到克隆基因蛋白质编码区中，使其,失去活性，构建成寻靶载体。,(2),将带有双标记的载体导入到从小鼠胚分离出的细胞中。,(3),结果会发生三种情况,:,(a),一是载体上的插入了,neo,r,标记的外源基因与细胞内正,常的同源基因发生同源重组，使染色体上带有了定向插,入基因，同时也插入了,neo,r,标记基因，而,tk,基因仍然留,在载体上，未能插入到染色体上（上）；,(b),整个的载体随机地整合到染色体上，未发生同源重组，,但将双标记都带到了染色体上（中）。,57,(c),载体未能插入到染色体上，更不会产生同源重组，双标记都留在载体上（下）；,（,4,）,筛选分离带有定向突变的细胞,。,将各种细胞都铺在含有选择剂新霉素类似物,(G418),和,GCV,(9-1,3-,二羟,-2-,丙氧甲基,鸟嘌呤,),的培养基上。,G418,可使细胞致死，但含有,neo,r,基因的细胞具有抗,G418,的功能。因此可以排除未被靶基因取代的细胞。而,GCV,是有毒的物质，当单纯性疱疹病毒的,tk,基因存在时，,胸苷激酶,可催化,GCV,作为底物参与,DNA,的合成，使细胞致死。因此用它可以排除随机整合载体的细胞。结果只有定向插入外源,DNA,的细胞才能在培养基上存活，增殖。,58,棕褐色,雄性种鼠,超数排卵,棕褐色雌鼠,三天后,从子宫里,分离囊胚,在滋养细胞,上培养囊胚,滋养细胞层,内细胞团,(ICM),亚克隆,ICM,细胞,干细胞,上皮细胞,展平,ES,细胞,用电穿孔对,ES,细胞进行转化,DNA,线性化转基因,DNA,59,用,G418,选择生长的,neo,r,细胞系,鉴别含有破坏基因的,ES,细胞,用转基因引物进行,PCR,分析,用转基因探针进行,DNA,印迹,60,剔除,（,knockout,）,（,1,）,首先是将想要剔除的小鼠基因插到载体上进行克隆。再将,新霉素抗性,(,neo,r,),标记插入这个基因，使这个基因受到破坏，这段,DNA,称为,定向插入,DNA,。在此基因外侧再导入一个,胸苷激酶,（,tk,）基因，作为选择标记。,（,2,）从棕色小鼠的胚中分离，收集,胚胎干细胞,（,embryonic sterm,ES,），,将重组载体转染,ES,；,61,(3),转染后会产生三种不同的结果,：,载体上定向插入,DNA,和染色体上的靶基 因进行同源重组，使染色体上带有了定向插入,DNA(,即被破坏了的基因,),和,neo,r,，但不带有外侧的,tk,；,重组载体随机插入到染色体中，未进行同,源重组；,重组载体未能插入到染色体中；受体染色体未发生改变。,62,(4),收集转染细胞，在培养基中加入,G418,和,GCV,(,9-1,3-,二羟,-2-,丙氧甲基鸟苷,),，,neo,r,可将具有定向插入,DNA,的细胞选择出来；,GCV,可杀死所有带有,tk,的细胞，这样可将随机插入和未重组的细胞都杀死。最后培养基上仅留下带有定向插入的细胞。,(5),将带有定向插入的细胞（,A,/,A,；,M,/,m,）注入黑色,雌鼠,(,a/a,；,M,/,M,),的囊胚腔中,使胚胎成为嵌合体。,(6),将嵌合胚植入作为代理母亲的黑色雌鼠子宫,里，嵌合体发育成嵌合小鼠（带有黑色斑纹的棕,色小鼠）。,63,(7),嵌合小鼠发育成熟后，选择,雄性小鼠,（,a,/,a,M,/,M,;,A,/,A,M,/,m,）和,黑色雌鼠,(,a/a,；,M,/,M,),杂交，生育的子代中有：,黑色鼠,（,a/a,；,M,/,M,）,；,棕色鼠,（,A,/,a,M,/,m,）,；,棕色鼠,（,A,/,a,M,/,M,）。,(8),再将,棕色鼠,（,A,/,a,M,/,m,）互交，将产生,4,种不同基因型的后代：,A,/-,M,/-,(,棕色,),；,A,/-,m,/,m,(,棕色,),，是我们要得到的纯合的剔除基因小鼠。,a,/,a,M,/-,（,黑色,）。,64,定点突变,棕色鼠,正常的,染色体,a,/,a,：,M,/,M,黑色母鼠,从棕色鼠,分离出胚,胎干细胞,囊胚阶,段的胚,代理母亲,生育的嵌合雄鼠,(,带有两种小鼠的,细胞系,),胚胎,A,/,A,：,M,/,M,a,/,a,：,M,/,M,+,A,/,A,：,M,/,m,嵌合的的胚,65,66,寻靶载体,(targeting vectors),有两种基本的基因,寻靶方法。,(1),最简单的方法是依赖,一个基因插入,的过程，,此需要寻靶载体的末端和基因组之间的交换。,通过插入产生的结果是靶序列和具有选择标,记（如,neo,r,）的插入序列重复。,(2),第二种是用,基因置换,的方法。,基因置换载,体含有两个选择标记，提供了一个鉴别,ES,细,胞,是否在靶基因发生了双交换的方便方法。,67,通过插入来敲除基因,基因组,用,G418,来选择,neo,r,基因,neo,r,amp,r,68,通过置换来敲除基因,用,G418,来选择,neo,r,基因用,9-,鸟嘌呤选择,HSVtk,缺失,69,三、人类疾病的转基因小鼠模型,小鼠转基因的一个目的是用分子遗传学的方法产生人类疾病的模型，来了解遗传缺陷。,1996,年,哈佛医学院,C.Tabin,实验室提出发现,IHh,控制骨头的发育；,1999,年,哈佛的,A.McMahan,发现剔除小鼠,IHh,基因后有许多异常，包括骨头缩短。,2001,贺林,等将,A-1,型短指（趾）症,的致病基因定位于,2,号染色体长臂的,35,36,区，并发现,IHH,（,India hedgehog,）基因的,3,个不同突变位点均能导致短指（趾）症的发生。,70,用培养的胚胎干细胞敲除,Hoxc-8,基因,。,(a),Hoxc-8,突变小鼠的胸椎和腰椎。野生型小鼠的第一腰椎是没有肋骨的。,(b),纯合的敲除,Hoxc-8,基因,小鼠（右）的趾紧握。野生型（左）小鼠的趾正常,71,第四节 转基因家畜,基因动物用于生产具有药用价值的重组蛋白的,生物反应器,（,bioreactors,）。,用转基因制备药物的这项工作发展缓慢，其原因是：,（,1,）大型家畜的转基因传代时间长，后代少。另外由于卵细胞的显微注射导致,DNA,的随机整合，结果使基因表达出现遗传变异，产生不可预知的后果。,（,2,）公众关心来自转基因动物的食品，如人源化的牛奶可能不被消费者广泛接受。,（,3,）动物保护主义者质疑转基因是否会减少生物的多样性，大规模生产的程序是否影响到动物的安全。,72,一用转基因动物制备药物,1992,年，英国爱丁堡大学的研究人员生产出,6,头,转基因绵羊。这些绵羊可以在奶中生产抗胰蛋白,酶（一种治疗肺胞纤维化病变的多肽药物），产,量最低的是,1g/L,，产量高的可达,35g/L,。这篇研,究报告立即在科学界和企业界引起轰动，许多正,在进行相关领域研究的科学家纷纷将目标移向建,立,乳房反应器,系统来合成作为药物的重要蛋白。,73,74,75,用,DNA,共转染的分子遗传学和核移植技术是能产生,产药动物。此图表示罗斯林研究所的科学家们用脂,质体介导基因转移到从无角多塞特白面母绵羊分离,出的二倍体胚细胞中，,所用的载体是带含有人类,IX,因子,cDNA,的,乳腺特异表达载体,(,pMIX1,),。在,IX,因子,编码序列的上游是绵羊的,-,乳球蛋白,(,BLG,),启动子,。,使异源基因在绵羊的乳腺中能高水平的表达。以这,种共转染的方法，另一个质粒含有来自磷酸甘油酸,激酶启动子,(,pPGKneo,),的,neo,r,基因，提供了一个用,G418,来选择的稳定转染的选择标记莫莉和波莉是首,批两只转基因产药动物。这两只羊含有有产药价值,的人类基因。,76,二、动物的体细胞克隆,英国爱丁堡苏格兰罗斯林研究所,和,英国,PPL,医,疗公司,的,Ian Wilmut,和,Keith Campbell,等从一,头,岁芬兰多塞特,白面母绵羊,的乳腺中取出,乳腺细胞，将其放入低血清的培养液中，细,胞逐渐停止分裂，进入,G,0,期，以便和受体的,细胞周期同步。,77,此细胞作为,“,供体细胞,”,。再从一头苏格兰,黑面母绵羊,的卵巢中取出未受精的卵细胞，并通过显微操作仪将细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，作为,“,受体细胞,”,。用电穿孔使供体细胞和受体细胞融合。融合细胞经,6,天的培养，细胞分裂、分化，一共产生,29,个多细胞的,“,胚胎,”,；最后将这些,“,胚胎,”,转移到,13,头苏格兰,黑面母绵羊,的子宫内，经过,148,天的发育分化，最后产下了一头成活的小绵羊，罗斯林研究所的科学家们以他们最喜欢的乡村歌手,Dolly Parton,的名字来命名这头小羊。,78,苏格兰黑面母绵羊,芬兰多塞特白面母绵羊,从乳腺中分离二倍体体细胞,从卵巢中分离卵细胞,用显微操作,除去单倍体核,用低血清培养使细胞处于,G,0,期,79,通过电穿孔使细胞融合,培养,6,天,将囊胚移植到作为代理母亲的黑面羊子宫里,150,天后生下小羊,多莉,80,歌手,Dolly Parton,Nature,385(1997),封面,81,动物体细胞克隆中存在的问题。,体细胞克隆时，如何恢复雌性供体中失活的,X,染色体的活性,？,例如,2001,年美国得克萨斯农业和机械大学,M.Westhusin,等成功地克隆出了小猫,“,科比,”。,科比,的供体是三色猫，其遗传结构应和供体相同，但毛色和供体却有一定差异。,如果克隆动物的,X,染色体上带有突变基因，那么，也可能因缺乏相应的野生型等位基因而致病。,82,(a),克隆猫“,科比,”的供体,(b),克隆猫“,科比,”和其代理母亲,(c),克隆猫“,科比,”,2001,年第一只克隆猫“,科比,”诞生。,其供体是一只三色猫（,a,）其代理母亲是一只灰色带黑色条纹的猫（,b,）而“,科比,”,的花色模式和其供体相同，但仅有黑和白两种毛色。表明其来自单克隆细胞。,83,如何恢复端粒的长度？,当多莉两岁半时，人们测定其端粒的长,度与核供体的年龄一致，而不与其本身,实际年龄不一致。,因近年来研究表明，端粒长度的缩短与,哺乳动物的疾病和衰老密切相关。核移,植后，端粒长度变化的机理如何？对动,物寿命的影响如何都需要进一步研究。,84,如何实现正常的亲本印记,（,parental imprinting,）？,这些表观遗传标记建立于生殖细胞，而在所有体,细胞中得到维持。实验表明仅含有母源基因组,(,孤雌生殖,),或者仅包含父源基因组,(,雄核发育,),的,胚胎都在发育过程中常常表现异常。,体细胞克隆动物未经过受精，也是来源单个亲,本，只能维持亲本的遗传印记，如有遗传缺陷后,代就难以避免。所以就有必要利用靶向修饰（甲,基化或去甲基化）改变这种情况。,85,转基因产药动物,1997,年,12,月罗斯林研究所又诞生了两只转基因羊羔，叫“,莫莉（,Molly,）,”和“,波莉（,Polly,）,”是首批两只转基因产药动物。,这些转基因产药动物是用哺乳动物含有,人类凝血因子,IX cDNA,的乳腺特异表达载体,(,pMIX1,),稳定转染供体细胞而产生的，而供体细胞是来自动物胚胎细胞。,莫莉,和,波莉,不仅彼此遗传性相同，带有相同的绵羊基因，而且将来在每一个羊羔的乳汁中又可产生大量的,人类血凝因子,IX,。,86,pMIX1,pPGKneo,脂质体介导共转染,苏格兰黑面母绵羊,无角多塞特白面母绵羊,用显微操作,除去单倍体核,分离二倍体,胚胎,细胞,用,G418-,选择并分离克隆鉴定的,DNA,pPGKneo,pMIX1,只有,pPGKneo,-,乳球蛋白启动子,87,通过电穿孔使细胞融合,培养,6,天,将囊胚移植到作为代理母亲的黑面羊子宫里,150,天后生下小羊,波莉,莫莉,产药动物,88,乳房反应器系统的优点是：,（,1,）利用高等哺乳动物,乳腺的特异基因启动子,可直,接表达人类可溶性转基因蛋白。,（,2,）动物乳腺细胞可以使任何基因正确表达和加工。生产出来的蛋白质与天然产品在结构和功能相同；,（,3,）由于乳汁蛋白不会输送到转基因动物的血流和,淋巴流中，因此不会对转基因动物产生对有害的副作用。,（,4,）乳中的蛋白质种类较少，转基因在奶中表达的外,源蛋白产量高，易于提纯。,89,檀香山技术,(Honolulu technique),夏威夷大学的,Wakayama,等报导了另一项突破。表示他们建立的称为“,檀香山技术,”产生了一只名叫“,卡姆莉,(,Cumulina),”,。,檀香山技术和罗斯林研究所的方法之间的差别是：,（,1,）使用,卵丘细胞,，处于,自然休眠期,(,Go),，不需“,饥饿培养,”；,（,2,）将核直接注入去核的卵中，方法简便。,（,3,）重构的卵母细胞的激活采用化学法,-,锶离子（电脉冲）；,（,4,）提高了成活率至,2.35%,，比多莉羊高,5-6,倍,(,Dolly,1/277),。,90,檀香山核转移技术利用微注射产生二倍体卵细胞来克隆动物。通过将经微注射的卵放在含有锶的无血清培养基中在体外激活卵母细胞，,在激活卵母细胞中含有的细胞松弛素,B,能阻止极体形成，这是由于使其丢失了染色体。,91,除去原核的单倍体卵细胞,从二倍体体细胞中取出核,将二倍体核注入卵细胞中,92,在体外激活卵母细胞并进行胚胎培养,将胚植入假孕母鼠的子宫里,93,在,1997,年克隆羊“多莉”诞生之后，夏威夷的一个小组培育出了第一批克隆鼠,“Cumulina”,和她的姐妹们。,94,第五节 实践,7,：敲除转基因鼠产生特异基因,一、研究目的,一个研究生设计了一项实验来验证在脑中,豆极基因,(,bean,pole,，,bpl,）产物,Bpl,蛋白,对正常的进食行为是需要的。这,个小鼠的,bpl,基因隐性突变被定位克隆，它和极度的营养不,良有关，纯合的突变体,(,bpl,-,),小鼠进食行为减少了,80,。,另一些实验室报导,bpl,敲除小鼠是胚胎致死的，这位研究生,就打算用,Cre-loxP,重组系统在小鼠脑的海马区,定向缺失,一个,bpl,的,外显子,。,预计，如能避免胚胎致死，在杂合子和纯合的,Cre/flox-bpl,小鼠中脑特异缺失,bpl,基因的功能会导致程度不同的减低进食行为。,95,二可利用的信息和试剂,(1),Cre,重组酶转基因鼠，在其前脑可特,异表达,Cre,，此是依赖钙钙调蛋白的,蛋,白激酶（,CaMK II,）,启动子连接在,Cre,表达盒,(,expression cassette,),上的结果。,但这个小鼠品系的海马区中引入,loxP,，,使其侧翼靶基因可发生缺失。,96,(2),构建了一个含有,neo,r,和,HSV,(,单纯性疱疹病毒,),tk,基因的,bpl,寻靶载体,。这个置换型载体在内含子,1,的下游和外显子,3,的下游各含有一个,lox,P,基因座，以供,Cre,剪切而重组。在,bpl,基因座上含有,ES,细胞,中的同源序列。将转基因鼠产生的,lox,-,bpl,杂合后代将和,CaMK II-Cre,小鼠杂交,（,bpl,-,/bpl,-,）,。,(3),人们建立了一测验,24,小时内小鼠的食量、进食频率和饮水量。称为“,肥,”,商,（,Blimpie,Quotient,，,BQ,）。,97,三基本策略,如果敲除某个基因而导致了转基因动物死亡，那么就不能进行研究。,Brian Sauer,建立了一种方法，用重组的,P1,噬菌体,DNA,来促进哺乳动物细胞中的基因组片段产生,位点特异缺失,。用,Cre-loxP,系统,进行定向,DNA,删除仅需要两个功能单位：,（,1,）常用细胞特异启动子或调节启动子来表达,PI,噬菌体的,Cre,重组基因；,98,(2),一段称为,loxP,的整合,DNA,片段，位于,P1,DNA,序列侧翼，长,34bp,的正向重复序列；此侧翼重复序列也就是,loxP,的寻靶,DNA,。,Cre-loxP,系统的用途是在转基因鼠中作为定点,特异删除基因的工具。,图表明,bpl-loxP,定向载体如何能用于产生纯合,的,转基因,lox-bpl,小鼠，此小鼠能与,CaMKII-,Cre,小鼠杂交产生带有,bpl,基因的后代，而,bpl,基因在,CA1,海