分子生物学真核生物的转录.ppt

*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分子生物学真核生物的转录,教学要求,理解真核生物基因转录的特点,掌握聚合酶,I,、聚合酶,和酶,III,作用基因转录的起始,了解真核生物基因转录所参与的转录因子,第,1,节 三种,RNA,聚合的特性和功能,第,2,节 聚合酶,I,基因：核糖体重复,第,3,节,RNA,聚合酶,III,基因：,5s,和,tRNA,转录,第,4,节,RNA,聚合酶,II,基因：启动子和增强子,主要内容,第,5,节 通用转录因子与,RNA,聚合酶,II,的起始,第,1,节,三种,RNA,聚合的特性和功能,一、真核生物,RNA,聚合酶,二、真核生物,RNA,聚合酶的活性,Type,Location,位置,Transcription product,转录产物,a,-amanitin,对,-,鹅膏蕈碱的敏感性,RNA Pol I,Nucleoli,核仁,Most rRNAs,Insensitive,不敏感,RNA Pol II,Nucleo-plasm,核质,hnRNA,snRNA,Very sensitive,非常敏感,RNA Pol III,Nucleo-plasm,核质,tRNAs,5S rRNA,snRNA and other small RNAs,Moderately sensitive,中度敏感,一、真核生物,RNA,聚合酶,mRNA,rRNA,tRNA,snRNA,scRNA,7S RNA,micro RNA,There Are Many Functional Classes of RNA,Molecular Biology,500-700kDa,12+subunits,含有两个大的亚基,最大亚基与大肠杆菌,RNA,聚合酶的,亚基相似，另外一个与,亚基相似。,根据其结构与功能，可分为核心亚基、共同亚基、非必需亚基,RNA polymerase,亚基,Molecular Biology,RNApol,亚基组成：,分子量,500KDa,含两个大亚基和,712,个小亚基,大亚基中有,C,末端结构域,(carboxy terminal domain,，,CTD),CTD,中含一保守氨基酸序列的多个重复,Tyr,Ser,Pro,Thr,Ser,Pro,Ser,C,端重复七肽,不同生物中重复数目不一 样（酶活性）,CTD,中的,Ser,和,Thr,可被高度磷酸化,CTD,中的,Ser,和,Thr,可被高度磷酸化,磷酸化的,RNApol,被称为,A,非磷酸化的,RNApol,称为,B,CTD,参与转录,B,A,使,RNApol,易于离开启动子进入延伸过程（,10,倍）,Similar Structures of Bacterial(left)and Eukaryotic(right)RNA Polymerases,Molecular Biology,二、真核生物,RNA,聚合酶的活性,Section M,Transcription in Eukaryotes,转录机制与大肠杆菌,RNA,聚合酶相似,(,How,?),需要辅助因子才能结合到,DNA,上,Like bacterial RNA polymerases,each of the eukaryotic enzymes catalyzes transcription in a 5 to 3 direction and synthesizes RNA complementary to the antisense template strand.,The reaction requires the precursor nuckeotides ATP,，,GTP,，,CTP and UTP and does not requires a primer for transcription initiation.,The purified eukaryotic RNA polymerases,unlike the purified bacterial enzymes,require the presence of additional initiation proteins before they are able to bind to promoters and initiate transcription.,Eukaryotic RNA polymerase activities,Molecular Biology,第,2,节,RNA,聚合酶,I,基因：核糖体重复,一、,rRNA,基因的结构,二、,RNA,聚合酶,I,启动子和结合因子,三、其他,rRNA,基因,一、,rRNA,基因的结构,1.,核糖体,RNA,基因,一个拷贝的,18S,，,5.8S,和,28SrRNA,基因组成一个的转录单元,前,RNA,转录单元在基因组中成簇排列，中间被非转录的间隔序列分开。,A single transcription unit,Tandem array,一、,rRNA,基因的结构,2.,核仁的作用,rRNA,基因簇排列成环一起组成核仁，即核仁组织区域。,前,rRNA,转录物与,rRNA,基因一起包装成电镜下可见的“圣诞树结构”,rRNA,的生产和修饰区域。,Christmas,Tree Structures,二、,RNA,聚合酶,I,启动子和结合因子,1.RNA Pol I promoters,启动子,即型启动子，由2部分保守序列组成：,核心启动子（core promoter）或核心元件（core element），位于-45到+20，负责转录的起始。,上游控制元件（upstream control element,UCE），从-180延伸到-107，可增加核心元件的转录起始的效率。,Core element,-45,+20,-100,UCE,UCE:Upstream control element,RNA Pol I promoters in human cells,二、,RNA,聚合酶,I,启动子和结合因子,2.,Upstream binding factor(UBF),上游结合因子,能结合到,UCE,以及核心元件上游的不同位点，使两个位点之间的,DNA,环化。,essential for high level of transcription,二、,RNA,聚合酶,I,启动子和结合因子,3.,核心结合因子,Selectivity factor 1(SL1),选择因子,1,含有,4,个亚基,TBP(TATA-binding protein):.,一个通用转录因子，使,RNA,聚合酶结合到起始位点起始转录所必需的。,TAF,1,s:,RNA Pol I,转录特有的,TBP-,相关因子,3.,Selectivity factor 1(SL1),选择因子,1,功能,结合并稳定,UBF-DNA,复合物,能与核心元件游离的下游部分相互作用,使,RNA Pol I,结合并起始转录。,二、,RNA,聚合酶,I,启动子和结合因子,UBF,：,A specific DNA-binding protein,called,upstream binding factor,binds to the,UCE,SL1:,An additional factor called,selectivity factor 1,is essential for RNA Pol transcription.SL1 binds to and stabilizes the,UBF-DNA,complex and interacts with free downstream part of the core element.,TBP,：,One of the subunits of,SL1,called,TATA-binding protein,is required for initiation by all three eukaryotic RNA polymerases.,TAF,I,s,（,TBP-associated factors,）,：,as the other subunits of,SL1,and required for RNA poly,transcription called,TAF,s,。,Upstream binding factor,Schematic model for rRNA transcription initiation,Molecular Biology,The initiation complex,UBF,UBF,RNA,Pol I,TBP,TAF,I,s,TAF,I,s,TAF,I,s,RNA,聚合酶,I,的转录起始复合物装配,两个,UBF,分别特异性地结合到上游控制元件,(UCE,）和核心启动子上，通过,UBF,蛋白质的相互作用，使,UCE,与核心启动子之间的,DNA,形成环状结构,SL-1,结合到,UBF-DNA,复合物上,RNA,聚合酶,I,就结合到核心启动子上，形成开放性起始复合物,。,三、其他,rRNA,基因,在简单的真核生物中,rRNA,基因 只有一个控制元件，位于转录起始位点上游的,12-72 bp,处。,Simple initiation:,TIF,(homolog of SL-1)binds to the promoter,RNA Pol I bind,TIF remains bound and the RNA Pol I is released for elongation.,第,3,节,RNA,聚合酶,III,基因：,5s,和,tRNA,转录,一、,RNA polymerase III,二、,tRNA genes,三、,5S rRNA genes,一、,RNA polymerase III,至少含有,16,个亚基,位于核质,合成前体,5S rRNA,、,tRNA,和其他小分子核及胞质,RNAs,一、,RNA polymerase III,RNA polymerase III,启动子,分为二类，每种识别方式不同,内部启动子：由起始位点下游的两个序列组成，,A,框和,B,框,(C,框,),上游启动子：,由起始位点上游的序列组成,(DSE,PSE,TATA).,。,The purified eukaryotic RNA polymerases,unlike the purified bacterial enzymes,require the presence of additional initiation proteins before they are able to bind to promoters and initiate transcription.,TFIIJ,TFIIH binding,所有 RNApol的转录起始都需要TBP：,核心结合因子 Selectivity factor 1(SL1)选择因子1,保守序列：G(A/T)CG,Pol II,snRNA and other small RNAs,二、RNA聚合酶I启动子和结合因子,TFIIE、TFIIJ和TFIIH进入复合物，使之转变为有活性的转录起始复合物,一、RNA polymerase III,核心元件 起始子（initiator，Inr）,Once TFIID has bound to the DNA，TFIIB binds to TFIID.,一、RNA polymerase III,转录因子 转录复合体,六、由TFIIH介导的CTD 磷酸化,五、RNA聚合酶结合后的其他转录因子,转录控制区位于转录起始点的转录单位内,二、,tRNA genes,1.transcription control regions,转录调控区域,位于转录单元内的转录起始位点之后,含量有两个高度保守的调控序列：,A box and B box,A box:,5-TGGCNNAGTGG,B box:,5-GGTTCGANNCC,编码,tRNA,分子中的,D-,环和,T,-,环,二、,tRNA genes,2.,两个复杂的,DNA-,结合因子,TF,C,：,能与,A,框和,B,框结合，是定位,TF,B,的包装因子,TF,B,:,能结合,A,框,50bp,的上游序列；由,TBP,、,BRF,和,B,三个亚基组成。可使,RNA,聚合酶,III,结合进来并起始转录。,3.tRNA,基因转录起始复合物的装配,TFIIIC,结合到,A,框和,B,框上,TFIIIB,结合于,A,框上游约,50bp,的位置，并只与,TFIIIC,相互作用，而与,DNA,序列无关,RNA,聚合酶结合于,TFIIIB-TFIIIC-DNA,复合物，随后，,TFIIIC,从该复合物释放出来。,三、,5S rRNA genes,1.,唯一单独被转录的,rRNA,亚基，并也是串联排列在基因簇中。,2.Transcription control regions(promoter),A box:+50 to+65,C box:+81 to+99,三、,5S rRNA genes,3.,转录因子,TFIIIA:,C,框的特异性,DNA,结合蛋白，作为装配因子使,TFIIIC,与,5S rRNA,启动子结合,TFIIIC:,能与,C,框、,A,框及起始位点附近的,DNA,结合,TFIIIB,：,能与以上结合的复合物相互作用，并促使,Pol III,结合而起始转录。,5SrRNA,基因转录起始复合物的装配,TFIIIA,结合于,C,框,TFIIIC,结合到,TFIIIA,上,TFIIIB,与,TFIIIC,接触，并结合到上游,DNA,序列上,RNA,聚合酶,III,依赖,TFIIIB,，结合到,5SrRNA,基因的转录起始位点，形成转录起始复合物。,Nucleo-plasm,SL1 binds to and stabilizes the UBF-DNA complex and interacts with free downstream part of the core element.,二、tRNA genes,前rRNA转录物与rRNA基因一起包装成电镜下可见的“圣诞树结构”,1 型内部启动子 2 型内部启动子,二、Promoters,TFIIB识别元件,前RNA转录单元在基因组中成簇排列，中间被非转录的间隔序列分开。,控制转录效率,SL1:An additional factor called selectivity factor 1,is essential for RNA Pol transcription.,Molecular Biology,第5节 通用转录因子与RNA聚合酶II的起始,1,型内部启动子,2,型内部启动子,转录起始点 转录起始点,boxA boxC boxA boxB,TFIIIA,TFIII B TFIII C TFIII B,Plo III,Pol III,TFIII C TFIII C,第,4,节,RNA,聚合酶,II,基因：启动子和增强子,一、,RNA polymerase II,二、,Promoters,一、,RNA polymerase II,位于核质中,用于所有蛋白质编码基因,mRNA,前体的合成,前体,mRNA,需经过加冒、加尾及剪接等加工过程。,二、,Promoters,TATA,框,核心元件 起始子（,initiator,，,Inr,）,TFIIB,识别元件,下游启动子元件,CAAT box,、,类启动子 上游元件组成,GC box,Oct,增强子（,enhomcer,）,远端调控区 减弱子（,dehancer,）,静息子（,sisencer,）,上游激活序列（,upstream activating,seguences UASs,）,1.,起始子,起始点一般没有同源序列,mRNA,的第一个碱基倾向,A,，另一侧翼由,Py,组成称为起始子（,initiator),。（在原核,CAT,起始序列也有这种情况）。,一般由,P,Y2,AN(T/A)P,Y5,构成,位于,-3,+5,提供,RNA pol,识别。,无论,TATA,是否存在，,Inr,对启动子的强度和起始位点的选择都是重要的。,现已纯化了,Inr,结合蛋白。,2.TATA,box,TATA,box,TATA,框,位于起始位点上游的,25-35bp,处,a 7 bp consensus sequence,一个,7bp,的保守序列,5-,TATA,(A/T),A,(A/T)-3.,TATA,box TATA,框,选择正确的转录起始位点，保证精确起始，故也称为选择子,影响转录的速率。,The spacing between the box and start site is important,TATA box,Transcription,Transcriptional,start site,DNA,Coding-strand sequences:,TATAAAA,GC+CAAT boxes,100,50,25,+1,Py,2,CAPy,5,Promoters,TATA box:,Many eukaryotic promoters contain a sequence called the TATA box around 25-35 bp upstream from the start site of transcription.It has the 7 bp consensus sequence 5-TATA,（,A/T,）,A,（,A/T,）,-3 although it is now known that the protein which binds to the TATA box,TBP,binds to an 8 bp sequence that includes an additional downstream base pair,whose identity is not important.,Initiator element:,The initiator element is located around the transcription strt site.Many initiator elements have a C at-1 and A at+1.,Molecular Biology,3.TFIIB,识别元件,保守序列：,(G/C)(G/C)(G/A)CGCC,能促进,TFIIB,与,DNA,结合的元件,4.,下游启动子元件,(DPE),位于起点下游约,30bp,处,保守序列：,G(A/T)CG,能与通用转录因子,TFIID,结合,补偿因,TATA,框缺失造成的转录抑制。,6.,上游调控元件,CAAT box(,CCAAT),SP1 box,GCbox(GGGCGG,),Function,：,控制转录效率,.,上游启动子元件（,UPE,）,表,12-4,哺乳动物,RNA Pol,上游转录因子结合的元,元件 保守序列结合,DNA,的长度 蛋白质因子,TATAboxTATAAAA,10bp TBP,CAAT boxGGCCAATCT,22bp CTF/NF1,GC boxGGGCGG,20bp SP1,OctamerATTTGCAT,20bp Oct-1,OctamerATTTGCAT 23bp Oct-2,KB GGGACTTTCC,10bp NFKB,ATF GTGACGT,20bp ATF,B.Lewin:GENES.1997,Table 28.2,真核启动子含有不同的组件,SV40,早期启动子,胸苷激酶,组蛋白,H2B,-140 -120 -100 -80 -60 -40 -20 +1,Oct CAAT GC TATA,7.Enhancers,增强子,能从启动子的上游或下游数千个碱基处激活转录的序列元件,General characteristics of Enhancers,增强子的基本特性,赋予其相连基因从正确的起始位点的强转录活性,不管位于其连接的基因的上游或下游均可激活转录,可在远离起始位点处发挥作用,优先激活两个串联的启动子中距离最近的一个。,1,晚期区,SV40,无,核小体区,早期区,T3 T2 T1,72bp,72bp,21 21 22 Ori,250,107 103,47,TAT,A,0/5245,GGTGTGGAAAG CCGCCC,图,12,-,SV40,复制起始中的增强子,增强子作用机理：,真核生物启动子示意图,第,5,节,通用转录因子与,RNA,聚合酶,II,的起始,一、,RNA,聚合酶,II,基本转录因子,二、,TFIID(TBP),三、,TFIIA,四、,TFIIB,和,RNA Pol,的结合,五、,RNA,聚合酶结合后的其他转录因子,六、由,TFIIH,介导的,CTD,磷酸化,一、,RNA,聚合酶,II,基本转录因子,广泛存在于各类细胞中,DNA,结合蛋白，,RNA,聚合酶,II,催化基因转录所必需的蛋白质因子。,需要多种,TF,参与：,TFA-J,二、,TFIID:,多蛋白复合体，由,TBP,和,TAF,II,s,组成,TBP,是唯一一种能与,TATA box,相结合的蛋白质。,TBP,的作用,TBPTATA box-binding protein,TATA,框结合蛋白，高度保守，分子量,38kD,。,所有,RNApol,的转录起始都需要,TBP,：,在,RNApol,的转录起始过程中,TBP,是选择因子,SL1,的组分，起定位,RNApol,的作用,RNApol,的转录起始由,TBP,识别,TATA,框,在,RNApol,的转录起始过程中,TBP,起定位,RNApol,的作用,TBP,起定位作用,所以又称定位因子（,positioning factor,）,Pol III,启 动 子,Pol I,启 动 子,Pol II,启 动 子,TBP,TF III B,TF III C,RNA Pol III,TBP,RNA Pol II,TF II D,转录起始点,TATA,TBP,SL1,RNA Pol I,UBF1,TBP,DNA,TBP:,Has a saddle structure(,鞍马形结构,)with an overall dyad symmetry(,完全二元对称的结构,).,Outer surface(with?),Inner surface(with?),TBP causes DNA bending,TBP,45,o,Kink(,纽结,),TBP-DNA,复合物空间构象变化的意义：,使转录因子与,RNA,聚合酶,II,更紧密地与,DNA,位点结合,由于,TATA,框序列的变形弯曲，相当于双螺旋的局部解链，有助于,DNA,形成开放型起始复合物。,三、,TFIIA,与,TFIID,结合,稳定,TFIID-DNA,复合物,去除阻遏蛋白的作用,至少有,3,个亚基,四、,TFIIB&RNA Pol binding,binds,to TFIID,Binds,to RNA Pol with TFIIF,TFIIB,起到桥梁的作用。,决定转录起始位置,TFIIF,：,RNA,聚合酶,II,结合蛋白，作用类似于,亚基，具有解旋酶的活性,TFIIE binding,Necessary for transcription,与,RNA,聚合酶作用促进转录,五、,Factors binding after RNA Pol.,TFIIE,TFIIJ,TFIIH binding,Necessary for transcription,5.Factors binding after RNA Pol.,TFIIJ,、,TFIIH,6.,phosphorylation of the polymerase CTD,by,TFIIH,Formation of a processive RNA polymerase complex and allows the RNA Pol to leave the promoter region.RNA,聚合酶复合体的形成,TFIIH,在转录延伸的调控上具有非常重要的作用。,参与了细胞周期的,RNA,聚合酶转录和,DNA,修复的调控作用过程。,CTD phosphorylation by TFIIH,TFIIH,是大分子多亚基复合蛋白，具有激酶和解旋酶活性，能使,RNA,聚合酶的,CTD,磷酸化。这种磷酸化能使,RNA,聚合酶离开启动子，进入延伸阶段。因此,TFIIH,能调节转录的延伸。,Molecular Biology,74,表,7-5,人类,型启动子的转录因子,因子,分子量,KD,功 能,RNA,Pol,10,依赖模板合成,RNA,TFA,12,19,35,稳定,TFD,和,DNA,的结合，激活,TBP,亚基,TFB,33,结合模板链,(-10,+10),起始,Pol,结合，和,TFE/F,相互作用,TFD,(TBP,30),TBP,亚基识别,TATA,将聚合酶组入复合体中,TAF,s,识别特殊启动子,TFE,34(),57(,结合在,Pol,的前部，使复合体的保护区延伸到下游,75,续表,因子,分子量,KD,功能,TFF,38,74,大亚基具解旋酶活性（,RAP74,）,小亚基和,Pol,结合，介导其加入复合体,TFH,62,89,具激酶活性，可以磷酸化,PolC,端的,CTD,，使,Pol,逸出，延伸,TFI,120,识别,Inr,，起始,TFF/D,结合,TFJ,在,TFF,后加入复合体，不改变,DNA,的结合方式,TFS,RNA,合成延伸,转录起始复合物的组装,在,TFIIA,协助下，,TFIID,上,TBP,首先结合到启动子核心元件,TATA,框上，形成动态的瞬时复合物,TFIIB,进一步结合到动态的瞬时复合物上,TFIIF,和,RNA,聚合酶,II,预先结合后，再结合到复合物上,TFIIE,、,TFIIJ,和,TFIIH,进入复合物，使之转变为有活性的转录起始复合物,TFIIH,的,DNA,解旋酶活性利用,ATP,，使起始位点解开更多的,DNA,双链，,TFIIH,使,RNA,聚合酶,IICTD,磷酸化，使,RNA,聚合酶,II,离开启动子，进入延伸阶段。,转录因子 转录复合体,TBP,TAFs,TFIIA,TFIIB TFIIF,Pol II,TFIIE,RNA pol,的转录起始,TFIID,TFIID,TFIIB,TFIID,TFIIF,TATA box,TFIIB binds to TFIID,.,TFIIB acts as a bridge to bind to,RNA polymerase II/TFIIF.,TFIIE and TFIIH bind,to RNA polymerase II.,RNA polymerase,TFIIB,TFIIA,TFIIA,TFIIA,binds to TFIID and enhances TFIID binding to TATA box.,Once TFIID has bound to the DNA,，,TFIIB,binds to,TFIID.,Molecular Biology,After RNA polymerase binding,three other transcription factors,TFIIE,TFIIH,and TFIIJ,rapidly asociate with the compex,Activation of TFIIH results in phophorylation of the carboxyl-terminal domain(CTD)of the RNA polymerase.This phosphorylation results on formation of a processive RNA polymerase complex and allows the RNA polymerase to leave the promoter region.,Transcription factors,Molecular Biology,