分子系统学与分子鉴定经典课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分子系统学与分子鉴定,内容,什么是分子系统学,什么是系统发育树,建树方法,如何建树,分类学与系统学,分类学通常被分为,分类学(,taxonomy)和,分类学(,taxonomy)等不同阶段。,分类学:对于多样性的生物进行分类、描述，按照各类群生物的国际统一命名法规进行不同等级和类群的命名,分类学:通常也被称之为系统学，即将生物的分类群或分类单位按照生物演化顺序排列成一定的系统,系统学是研究各等级、各类群之间的演化关系，按照生物演化顺序将它们排列成一定的“系统”(英文system，拉丁文systema)。,系统发育树,A tree is a mathematical structure which represents a model of an actual evolutionary history of a group of sequences or organisms,In other words,it is an,evolutionary hypothesis,Phylogenetic,trees,Topology of A Tree,A tree consists of nodes connected by branches,One unique internal node is the root of the tree:the ancestor of all the sequences,Internal nodes represent hypothetical ancestors,Terminal nodes represent sequences or organisms for which we have data.Each is typically called a“Operational Taxonomical Unit”or OTU.,Related Terms,The,ingroup,is the group actually studied by the investigator.That is,it is the group of interest.,A,sister group,is the taxon that is genealogically most closely related to the ingroup.The ancestor of the group cannot be its sister because the ancestor is a member of the group.,Related Terms,An,outgroup,is any group used in an analysis that is not included in the taxon under study.,It is used for comparative purposes,usually in arguments concerning the relative polarity of a pair(or series)of homologous characters.,The most important outgroup is the sister group,and considerable phylogenetic research may be needed to find the sister group.Usually more than one outgroup is needed in an analysis.,Related Terms,目前用蛋白质和核酸序列进行系统发育关系分析的方法有：,距离法（Distance Methods）,其中邻接法（Neighbor Joining,NJ）最受欢迎,最大简约法（Maximum Parsimony,MP）,最大似然法（Maximum Likelihood,ML）,Bayesian法,Methods for Constructing Phylogenies,用最大简约原则（Maximum Parsimony,MP）来推断最好的系统树,理论依据：解释一个过程的最好假说应是假设条件最少的假说。因此，对于分子数据（DNA序列数据），该方法计算在最少的碱基替换条件下能够解释整个进化过程的拓扑结构（系统进化树）。,简约原则在逻辑上的要求是在多种解释中选取最简单的。在分析系统发育关系时，最简约的树是对数据集进化途径最短的解释（即从祖先分类单元到现生单元性状变化的数目最少）,Methods for Constructing Phylogenies,The steps involved in creating a phylogenetic tree from molecular data are:,Identify a protein or DNA sequence of interest,Identify other sequences that are related to the sequence of interest and obtain electronic files of those sequences,Align the sequences,Using the results of alignment,generate a phylogenetic tree,Print(and perhaps publish)the results,How to Create a Tree?,获取相关基因序列数据,Download from GenBank,Sequenced by investigator,输入www.ncbi.nlm.nih.gov/网址,Eurytomidae 28S ribosomal RNA gene,自行扩增后获得的新序列,从研究的样本直接提取DNA，扩增测序，得到序列文件,用Sequencher（版本3.1.1）、SeqScape或BioEdit软件对测得的序列进行校对和编辑，确保序列的准确性,保存成FASTA或纯文本格式。,获取相关基因序列数据,创建输入文件,由GenBank下载的序列创建,运行MacClade软件，在“File”菜单中选择“New File”命令,在“Taxa”下拉菜单“Improt Sequences”选择子菜单“FASTA File”,打开下载的序列文件batchseq.cgi,将输入的矩阵保存成NBRF格式（File下拉菜单中的子菜单“Export File”中的“NBRF”选项）,创建输入文件,由自行扩增的序列创建,运行MacClade软件，在“Taxa”下拉菜单“Import Sequences”选择“File with Only Sequence”命令；然后逐条地输入目的序列；,将输入的矩阵保存成NBRF格式（File下拉菜单中的子菜单“Export File”中的“NBRF”选项）。,创建输入文件,Positional homolog(点同源),序列数据首先必需进行比对,以便能够对同源位点（比较的单位）进行比较和分析,目前应用得最多的关于序列排序的软件是Clustal X 1.81,序列的比对（,Alignment）,利用Clustal X软件进行序列比对,用Clustal X软件打开以上保存的NBRF格式的文件，进行多序列的比对（Multiple alignment）。,在“Alignment”菜单的下拉菜单“Alingment Parameters”中选择“Multiple Alignment Parameter”进行多序列比对的参数设置。,参数设置是Gap Opening=10，Gap Extension=0.2,利用Clustal X软件进行序列比对,在“Alignment”下拉菜单“Output Format Options”中选中“NEXUS format”选项；然后做“Do Complete Alignment”,比对后，用MacClade 4.0软件打开排序后产生的“.nxs”文件。手工校对排序的结果，并删除那些难以比对的高变区（hypervariable regions）,Swofford等(1996)认为排除这些区域，可以提高系统发育关系结果的可靠性。,利用Clustal X软件进行序列比对,系统发育关系分析,调用目的文件,：运行PAUP软件；在“File”下拉菜单中选择“Open”命令，找到从Clustal X排序后产生的“.nxs”文件；点击“Execute”命令,排除非信息位点,：选中“Data”下拉菜单中的“Include-Exclude Characters”选项，排除“uninf”位点,选择分析原则及搜索最佳树的参数设置,：在“Analysis”菜单中选中“Parsimony”；然后进行“Heuristic”搜索；其参数设置是：,General Search Options=Best trees only,Starting trees for branch-swapping=Get by stepwise,Stepwise-Additon Options=random,#reps=1000,Swapping algorithm=TBR,系统发育关系分析,合意树,：在“Trees”菜单中，点击“Compute Consensus”，选中“Strict”，点击“OK”，获取严格的合意树。,系统发育关系分析,系统发育关系分析,赋根,：在“Options”的下拉菜单中选中“Rooting”，为树赋根；,有两种方案，是Outgroup rooting；是Midpoint rooting,系统发育关系分析,输出树,：在“Trees”下拉菜单中选择“Print trees”以打印树。,参数设置如下：,Plot type=Rectangular Cladogram,Line width=1.5,Font=Helvetica,Size=14,Styles=,Bold,&,Italic,。,评价结果的可靠性,在得到树（或树集）后，必需做的是评价结果的可靠性。主要有Bootstrapping方法。,Bootstrapping（Felsenstein，1985）用于评价系统树各节点的支持率，通常支持率在90以上是最可信的。,在测试中共重复1000次。,选中Bootstrap；Number of replicates=1000,Type of search,=Full heuristic,Consensus tree options=Retain groups with frequency 50%,评价结果的可靠性,评价结果的可靠性,点击Continue；在Heuristic Search的Stepwise-Addition Options中的random的#reps的值改为1000；点击Search,运算结束后，点击Trees下拉菜单中的Print Bootstrap Consensus以打印结果,Parsimony Tree based on ITS sequence,T.songshanense,T.songshanense,T.taiyuanense,T.songshanense,Softwares,红火蚁（,Solenopsis invicta,）分子检测技术研究,中国检验检疫科学研究院,研究背景,研究目的,材料和方法,结果,分析与讨论,研究背景,分类地位,膜翅目（,Hymenoptera,）蚁科（,Formicidae,）,家蚁亚科（,Myrmicinae,）火蚁属（,Solenopsis,）,研究背景,分布,国外：巴西、阿根廷、安提瓜和巴布达、特立尼和多巴哥、波多黎各、巴哈马群岛、特克斯和凯科斯群岛、英属维尔京群岛、美属维京群岛、美国、澳大利亚、新西兰、马来西亚,国内：中国台湾省、香港、澳门和广东省吴川等,预测分布图,中国预测分布图,研究背景,形态方面,单家蚁属（,Monomorium,）、大头家蚁属（,Pheidole,）、拟大头家蚁属（,Pheidologeton,）,、热带火蚁（,Solenopsis invicta,）,黑火蚁,S.richteri,相似。尤其是幼虫和卵更难区分。,分子方面,红火蚁,Solenopsis invicta,，黑火蚁,S.richteri,，热带火蚁,S.geminata,和,S.quinquecuspis,四个种,研究背景,危害,经济,危害农作物，电力设备等,社会,人类健康,生态环境,降低生物多样性,研究目的,红火蚁的分子检测技术研究,筛选引物与探针，建立红火蚁不同虫态卵、幼虫、成虫快速、准确的实时荧光,PCR,分子检测体系，为口岸快速查验和大通关提供有力的技术支持。,材料与方法,确定红火蚁主要分布的地区及要采样的地点；,获取红火蚁不同地理种群标本；,筛选并优化红火蚁分子检测探针。,技术 路 线,国内标本,收集标本,国外标本,序列比对,基因测序,DNA提取扩增,构建红火蚁分子检测技术体系,筛选分子检测引物与探针,GenBank,材料与方法,样品,总共选取红火蚁5个种群和热带火蚁1个种群为研究对象。只选取采自同一地点，至少有两个个体(卵、幼虫、成虫)的同种标本提取基因组DNA。其中一头标本用于分子生物学实验，其余的作为形态鉴定参考(voucher species),。,标本号,种 类,采集地,1,Solenopsis invicta,深圳公明广记花场,2,Solenopsis invicta,深圳光明农场,3,Solenopsis invicta,珠海斗门白蕉镇,4,Solenopsis invicta,珠海回归公园,5,Solenopsis geminata,广西北海,6,Solenopsis invicta,广东吴川,材料与方法,提取基因组DNA,采用Wizard方法（Promega）提取基因组DNA，可成功提取卵、幼虫、成虫单个个体的基因组DNA。标本最初保存在浓度为100的酒精中；随后转至70的酒精中长期保存。,材料与方法,设计引物与探针,GenBank发表火蚁属（,Solenopsis,）的COI基因序列有102条，分别属于,Solenopsis invicta,S.richteri,，,S.geminata,和,S.quinquecuspis,四种，标本来源分别为阿根廷、巴西和美国。用Clustal X软件对COI基因序列进行比对后，分析保守区与高变区，针对红火蚁的特异序列，手工设计了引物与探针。,材料与方法,序列的比对（alignment）与分析,比对（Clustal X,Thompson,et al.,1997),Neighbor-Joining Tree Thinking,结 果,PCR,产物电泳检测结果（成虫）,PCR,产物电泳检测结果（幼虫）,Fam荧光曲线（成虫）,Fam荧光曲线（幼虫）,Fam荧光曲线（卵）,分析与讨论,引物可成功扩增所有样品，红火蚁特异探针只检测出红火蚁样品，而热带火蚁样品没有被检出。因此，此实时荧光PCR检测方法，通过1对通用引物和1条特异探针可将红火蚁和热带火蚁分开；而且对红火蚁不同虫态的分子检测都有效。,分析与讨论,由于红火蚁、黑火蚁和,S.quinquecuspis,在COI基因上碱基差异很小，理论上，利用本实验的引物可以检测到上述3种火蚁。由于样品的限制，目前无法在实验中进一步验证。但这为进一步确定黑火蚁和,S.quinquecuspis,的检疫地位提供了重要参考。,分析与讨论,从COI基因比对结果来看，红火蚁种群间碱基变异也很大，以COI基因为分子标记设计检测红火蚁种级特异探针比较困难。本实验的样品都能扩增，但随着样品量的增加，存在目标样品检不出的可能。在下一步的工作中，我们将选取其它标记基因（如线粒体16S或12S rDNA或核内18S rDNA），优化检测的引物和探针，更好地标准化红火蚁分子检测工作。,谢谢大家！,