脂肪酸检测原理及方法.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,脂肪酸的检测原理及方法,脂肪酸（,fatty acid,）,由碳、氢、氧三种元素组成的一类有机物，一端含有一个羧基的长的脂肪族碳氢链，通式是,C,(n),H,(2n+1),COOH,。低级的脂肪酸是无色液体，有刺激气味，高级的脂肪酸是蜡状固体。,脂肪酸是最简单的一种脂，它也是许多更复杂的脂的成分。在有充足氧供给的情况下，可氧化分解为,CO,2,和,H,2,O,，释放大量能量，因此脂肪酸是机体主要能量来源之一。,脂肪酸的分类,自然界约有,40,多种不同的脂肪酸，它们是脂类的关键成分。许多脂类的物理特性取决于脂肪酸的饱和程度和碳链的长度，其中能为人体吸收、利用的只有偶数碳原子的脂肪酸。,按碳链长度不同分类,短 链,：,(,含,4,6,个碳原子,),脂肪酸，,如丁酸,(C40),、己酸,(C60),；,中 链,：,(,含,8,14,个碳原子,),脂肪酸，,如辛酸,(C80),、葵酸,(C100),；,长 链,：,(,含,16,18,个碳原子,),脂肪酸，,如棕榈酸,(C160),、硬脂酸,(C180),和,油酸,(C181),；,超长链,：,(,含,20,个或更多碳原子,),脂肪酸；,人体内主要含有长链脂肪酸组成的脂类。,按饱和度分类,饱和脂肪酸,（,saturated fatty acid,）：不含有,C=C,双键的脂肪酸。,不饱和脂肪酸,（,unsaturated fatty acid,）,单不饱和脂肪酸：在分子结构中仅有一个双键,C=C,。,多不饱和脂肪酸：在分子结构中含两个或两个以上双键。,近几年随着营养科学的发展，对不饱和脂肪酸双键所在的位置进行分类。双键的位置可从脂肪酸分子结构的羧基端第一个碳原子开始编号。并以其第一个双键出现的位置的不同分别称为,3,族、,6,族、,9,族等不饱和脂肪酸,这一种分类方法在营养学上更有实用意义。,脂肪酸的检测方法,气相色谱法,（,GC,）,1952,年,James,和,Martin,发明了气相色谱法，同年获得诺贝尔化学奖。气相色谱法又称,气相层析法,，是一种采用冲洗法的色谱分离技术,特别适用于生化产品的分离纯化。,原理：气相色谱以气体作为流动相，用固体吸附剂或液体作固定相，它利用试样中各组分在色谱柱中的气相和固定液液相间的分配系数不同，当气化后的试样被载气带入色谱柱中运行时，组分就在其中的两相间进行反复多次的分配,(,吸附,-,解吸附或溶解,-,放出,),，由于固定相对各组分的吸附或溶解能力不同，因此各组分在色谱柱中的运行速度就不同，经过一定的柱长后，试样中被分离的各组分即能达到完全分离。目前单纯的气相色谱应用相对要少些，一般是与其他技术联用。（,Agilent 7890A,）,单纯用气象色谱法检测时因其不能对所检测物质定性检测所以检测时样品要加入内标，或用外标矫正。,脂肪酸的检测方法,气相色谱法,-,质谱联用法,（,GC-MS,）,对于复杂多组分混合物分析，单种方法是难以解决的，往往需要两种或两种以上分析方法才能有效解决。其中气相色谱、质谱灵敏度高，最小检测量接近，这种技术发展较快，可对未知混合组分定量、定性鉴定。,样品经,GC,分离为单一组分，各组分依次与载气同时流出色谱柱，再经接口进入质谱仪，样品分子在离子源内电离，产生各种各样的离子，这些离子经过质量分析器按其质荷比分离，分离后的离子依次被检测器检测，并形成一个按离子质荷比排列的质谱图，计算机自动检索并迅速识别样品。,试验样品的前处理,甲酯化,由于脂肪酸类成分多是以甘油脂肪酸酯的形式存在，因此样品多经过甲酯化处理以提高样品的挥发性，还可以改善色谱峰形状。甲酯化的条件较为温和，可以避免脂肪酸的氧化。,试验样品的前处理,目前样品前处理过程中常用的甲酯化方法有以下几种,：,氢氧化钾甲醇法该方法多采用有机试剂,氢氧化钠甲醇法,硫酸甲醇法,F,3,B,甲醇法,甲酯化,收集全部细胞后，用,PBS,洗涤,3,次（,4000rpm,，,5min,），加入,2 ml,的,2.5%,（,V/V,）的硫酸,/,甲醇溶液，,80,恒温过夜；冷却至室温后，加入,1 mL 1mg/mL,的内标（,C19:0,），再加入,2 mL,饱和,KCl,溶液，然后正己烷抽提脂肪酸甲酯，抽提两次每次,2 mL,，将脂肪酸甲酯萃取到有机相。分别将两次获得的脂肪酸甲酯的正己烷溶液转入新的,10 mL,离心管中，经氮气吹干后重新加入,500L,正己烷重新溶解，,-20,保存。,注意事项,固定相的选择,固定相的选择是影响气相色谱分离效果最重要的因素之一。一般通过考察固定相的稳定性，极性，黏度，选择性等来选择适宜的固定相。脂肪酸油的化学成分复杂，极性范围较宽，要达到较理想的分离度，一般采取改变柱子极性的方法来提高柱子的选择性。,注意事项,载气的选择,适宜的载气，对分离效果也有一定的影响。载气的选择主要载气分子量，流速、柱压降和检测器灵敏度的影响四个方面考虑。当载气流速较低时，分子扩散占主导地位，为提高柱效，宜用分子量较大的载气,N,2,。相反，当载气流速高时，传质抗阻占主导地位，宜用分子量低的载气,He,，有利于提高线速，实现快速分离。,