液相色谱分析.ppt

高效液相色谱,概述,HPLC 理论基础,HPLC 主要类型,HPLC 仪器,HPLC 应用,第一节 概述,高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法。,一、HPLC与经典LC区别,二、HPLC与GC差别,三、特点及应用,一、HPLC与经典LC区别,主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段。,1经典LC：仅做为一种,分离手段,。,柱内径,1,3cm,，固定相粒径,100m,且不均匀。,重力加料,输送流动相。,柱效低（,H,，,n,）。,分析周期长。,无法在线检测。,2HPLC：,分离和分析,柱内径,2-6mm,，,固定相粒径,7时，该检测器不够灵敏。,第四节,HPLC流动相和固定相简介,一、流动相,理想的溶剂应有下列特性：,1）避免使用引起柱效损失或保留特性变化的试剂。,2）与检测器相匹配。,3）高纯度：否则基线不稳或产生杂峰。,4）化学稳定性好。,5）适宜的粘度：粘度过高，柱压增加；过低，易产生气泡。,二、固定相载体,由于各种,HPLC,分离方法的流动相均为液体，因此，,HPLC,通常是按照固定相载体或固定液的不同来分类的。,1.按承受压力分：,刚性固体,：,SiO,2,为基质，耐压为,7.010,8,1.010,9,Pa,。可制成直径、形状和孔隙深度不同的颗粒；主要用于,吸附、分配和键合色谱。,硬 胶,：以聚合物为基质(常用苯乙烯与二乙烯苯交联而成)，耐压上限为,3.510,8,Pa,主要用于,离子交换和尺寸排阻色谱。,2.按孔隙深度分：,表面多孔型,：以实心玻璃珠为基体，在基体表面覆盖一层,多孔活性材料,(如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等)。表面多孔型固定相的,颗粒大(易装柱)、多孔层厚度小且孔浅(渗透性好，出峰快),；但交换容量小。适于,常规分离,分析。,全多孔型,：全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成，因,颗粒极细，因而孔径小、传快、柱效高,。特别适于,复杂混合物的分离。,第四节 HPLC主要类型,一、吸附色谱,（adsorption chromatography）,原理,：基于被测组分在固定相表面具有,吸附作用,，且各组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生保留和实现分离。,固定相,：固定相通常是,活性硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺,等,固体吸附剂,，所以吸附色谱也称液固吸附色谱。活性硅胶最常用。,流动相,：,弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物,，如正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等,应用,：吸附色谱用于,结构异构体分离和族分离,仍是最有效的方法，如农药异构体分离、石油中烷、烯、芳烃的分离。缺点是容易产生不对称峰和拖尾现象,二、分配色谱,原理,：根据各待测物在互不相溶的两溶液中的,溶解度不同,，因而具有不同的分配系数。,流动相,:,HPLC,分析中，为防止固定相的流失，流动相与固定液应尽量不互溶，或者说,二者的极性相差越大越好。,根据流动相与固定相极性的差别程度，可将液液色谱分为,正相分配色谱,（流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离）和,反相分配色谱,（流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离）。,固定相,原则上，用于,GC,的固定相也可用于,HPLC,作固定相。但,HPLC,固定液易流失，因此常用的只有几种，按极性由高到低为：,，,-氧二丙腈,(ODPN),、聚乙二醇,(PEM),、十八烷,(C18),、角鲨烷,(SQ)。,根据涂渍方法的不同，可将固定相分为机械涂渍型和化学键合型，后者应用更为广泛。,1）,机械涂渍固定相,：将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型(,0.5-1.5%,涂布量)或全多孔型载体(,5-10%,涂布量)上形成的液液色谱固定相。该种固定相最大的不足,是固定液易流失、分离稳定性及重现性差，不适合梯度淋洗。,为减少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的,前置柱,，该柱涂有与分析柱相同但有更高含量的固定液，使流动相进入分析柱之前，预先被固定液饱和。,2）,化学键合固定相,化学键合固定相是通过化学反应将,有机分子键合在载体表面,所形成的柱填充剂，存在着,双重分离机制,：(键合基团的覆盖率决定分离机理),高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主,；特点如下：,传质快,，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快,寿命长,，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击 耐水、耐光、耐有机溶剂。,选择性好,，可键合不同官能团，提高选择性,有利于梯度洗脱。,Si-O-R,：,对热不稳定、遇水、乙醇等强极性会水解，使酯链断裂，因此只适于以不含水或醇的流动相。,Si-R(或Si-N),：,不水解，热稳定性比硅酸脂好。使用水溶液作流动相时，其,pH,应在,4-8,之间。,Si-O-Si-R,：不水解，热稳定性好，在,pH2-8,范围内对水稳定。,应用,：液液色谱是基于化合物中,取代基的数目或性质不同,，或化合物的相对分子量不同达到分离的。能分析各种,不同性质的样品，无论极性化合物还是非极性化合物,可见：反相键合色谱中，,键合相碳链越长（极性越小），分离效果越好,三、离子交换色谱,1,原理,：利用,不同待测离子对固定相的亲和能力（或离子交换能力）的差别,来实现分离的。,应用,：适用,无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离,，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广。,2,固定相,：作为固定相的离子交换剂，其基质大致有三大类：,合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶,。而离子交换剂又有阳离子和阴离子之分。再根据官能基的离解度大小还有强弱之分。,常用的离子交换剂固定相大致可分以下几种：,多孔型离子交换树脂,：它主要是,聚苯乙烯和二乙烯苯基,的交联聚合物，直径约为520m，有微孔型和大孔型之分,薄膜型离子交换树脂,：它是在直径约对30m的固体,惰性核,上，凝聚12m厚的,树脂层。,表面多孔型离子交换树脂：,它是在固体,惰性核,上，覆盖一层,微球硅胶,，再在上面涂一层很薄的,离子交换树脂。,离子交换键合固定相,：它是用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面,它也分为两种类型。一种是,键合薄壳型,，其载体是,薄壳玻珠,。另一种是,键合微粒载体,型，它的载体是,多孔微粒硅胶,。后者是一种优良的离子交换固定相，它的优点是,机械性能稳定，可使用小粒度固定相和高柱压,来实现,快速分离,3 流动相,pH,值,：影响,酸或碱的离解平衡,，控制组分离子形式所占的分数。当组分以分子形式存在时，则不被保留；,离子分数越高，保留值越大,。常用的有柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水等。,离子强度,I,：,对保留值的影响比,pH,更大。组分保留值受流动相中盐类总浓度控制。,增加外加阴或阳离子将降低,样品离子的竞争吸附能力,，使组分保留值减小,。通过加入不同种类的盐，可影响柱的选择性，因为不同物质对交换剂的亲和能力不同。,有机溶剂,：,外加有机溶剂通常减小组分的保留值。其极性越小，保留值越小,。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环已烷等。,配离子,L,：当大量L、组分X随流动相进入柱后，发生配位剂交换：,RM-L+X,RM-X+L，,该法用于,分离各种氨基酸或碱类。,四、离子色谱,离子色谱(,IC,)是,70,年代发展的新方法。其分离原理与,离子交换色谱原理,一样，只是流出的各种离子用,电导检测器,检测。但由于流动相都是强电解质，其电导率比待测离子约高,2,个数量级，这种强背景电导会完全掩盖待测离子信号。,为解决此问题，,1975,年,Small,提出，在离子交换柱之后，再串结一根,抑制柱,。该柱装填与分离柱电荷完全相反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有,高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相,，从而可用电导检测器检测各种离子的含量。,例如：分析阳离子时，以无机酸为流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换树脂，则发生下列反应：,R,+,OH+HCl,(流动相),R+Cl,-,+,H,2,O,R,+,OH+MCl,(待测物),R,+,Cl+,M,+,OH,-,由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量酸转变为电导很小的水，消除了,流动相本底电导,的影响。同时，又将样品阳离子M,+,转变成相应的碱，由于OH,-,离子的淌度为Cl,-,离子的2.6倍，,提高了所测阳离子电导的检测灵敏度,。对于阴离子样品也有相似的作用机理,该法的,不足之处在,于：,抑制柱要定期再生,、谱峰在经过抑制柱后会展宽，,降低分离度,。,因此有人提出了使用电导率很低的溶液(如苯甲酸盐稀溶液)作流动相称为,非抑制型离子色谱或单柱离子色谱,五、离子对色谱,离子对色谱,主要用来分离,强极性有机酸和有机碱,原理:,离子对色谱法是将一种（或数种）与溶质离子电荷相反的离子（称,对离子或反离子,）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成,离子对,，从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法,例如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，于流动相中加入与待测离子A,-,有相反电荷的离子B,+,：,由于离子对AB具有疏水性，因而被非极性固定相提取。其它待测离子A1，A2，A3.因与B离子间的成对能力不同，而形成不同疏水性的离子对，使得各待测物在柱内的保留值不同，从而达到分离的目的,阴离子分离,：常采用,烷基铵类,，如,氢氧化四丁基铵,或,氢氧化十六烷基三甲铵,作为对离子。,阳离子分离,：常采用,烷基磺酸,类，如己烷磺酸钠作为对离子。,反相离子对色谱,：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y,+,的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y,+,X,-,后；在两相间分配。,六、,尺寸排阻色谱法,尺寸排阻色谱法又称,凝胶色谱,法，主要用于,较大分子,的分离。与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离子交换作用机理，而是,基于试样分子的尺寸和形状,不同来实现分离的。,分离原理,：固定相为化学惰性的,多孔凝胶,，它类似于分子筛，但孔径更大。凝胶内有一定大小的空穴，分子体积大的待测物不能渗入孔穴中而被排阻，较早地被淋洗出来，中等的部分渗透，小分子则完全渗透，最后流出色谱柱。即待测物分子按分子大小(分子量大小)先后从柱中流出。,尺寸排阻色谱的特点：,（1）保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供,分子结构,的某些信息,（2）保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用,灵敏度较低的检测器,（3）固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子不能很强保留分子，因此,柱寿命长,（4）不能分辨分子大小相近的化合物，,相对分子质量差别必须大于10才能得以分离,排阻色谱固定相,排阻色谱流动相,必须能,溶解样品,，并必须与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶。当采用软性凝胶时，溶剂也必须能溶胀凝胶,另外，,溶剂的粘度要小,，因为高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分离效果。这对于具有低扩散系数的大分子物质分离，尤需注意,必须,与检定器相匹配,。常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等,七、亲合色谱,应用,：主要用于,生物大分子与固定相之间的特异亲合力,进行选择性分离及纯化的方法。,分离原理,：于载体表面先键合具有一般反应性能的,环氧或联氨（称为间隔臂,），然后再连接上,配基,，如酶、抗原或激素，当含有复杂混合试样的流动相流经这种经固定化的配基时，其中具有,亲合力特性的生物大分子,与配基相互作用而被保留，无此作用的则被洗出；随后，改变流动相pH或组成，再将被保留的大分子组分以纯品的形式洗脱出来。,特点,：选择性过滤、纯化效果好。,第五节 HPLC的应用,食品检验,环境监测,生命科学,药物分析,合成化学,石油化学,临床化学,法学检验,一.在食品分析中的应用,1食品,营养成分,分析：蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、有机酸（邻苯二甲酸、柠檬酸、苹果酸等）、有机胺、矿物质等；,2食品,添加剂,分析：甜味剂、防腐剂、着色剂（合成色素如柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、亮蓝等）、抗氧化剂等；,食品污染物分析：霉菌毒素（黄曲霉毒素、黄杆菌毒素、大肠杆菌毒素等）、微量元素、多环芳烃等。,二.在环境分析中的应用,多环芳烃（特别是稠环芳烃）、农药（如氨基甲酸脂类，反相色谱）残留等,三.在生命科学中的应用,HPLC技术在生化领域的应用主要集中于两个方面：,1.低分子量物质，如氨基酸、有机酸、有机胺、类固醇、卟啉、糖类、维生素等的分离和测定。,2.高分子量物质，如多肽、核糖核酸、蛋白质和酶（各种胰岛素、激素、细胞色素、干扰素等）的纯化、分离和测定。,四.在医学检验中的应用,体液中代谢物测定；药代动力学研究；临床药物监测：,1.合成药物：抗生素、抗忧郁药物（冬眠灵、氯丙咪嗪、安定、利眠宁、苯巴比妥等）、黄胺类药等。,2.天然药物生物碱（吲哚碱、颠茄碱、鸦片碱、强心甙）等。,