DB43∕T 1203-2016 饲料中雌二醇、炔雌醇、乙烯雌酚的测定 高效液相色谱法.pdf

湖南省地方标准DB43饲料中雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚的测定高效液相色谱法Determination of Estradiol and Ethinylestradiol and Diethylstilbestrol in feedsHigh performance liquid chromatographic methodDB43/T 12032016 湖南省质量技术监督局发 布2017-02-13实施2016-12-13 发布ICS 65.120B 46DB43/T 12032016 I 目 次 前言 1 范围12 规范性引用文件13 原理14 试剂与材料15 仪器与设备26 采样与试样的制备27 测定步骤28 结果计算39 灵敏度、准确度和精密度3附录 A（资料性附录） 雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚高效液相色谱图4 DB43/T 12032016 II 前 言 本标准按 GB/T 1.12009 给出的规则起草。 请注意本标准某些内容可能涉及专利，本标准发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由湖南省畜牧水产局提出并归口。 本标准起草单位：湖南省兽药饲料监察所。 本标准主要起草人：隆雪明、欧阳龙、陈福华、杨彦宁、周灿、易建希、李裕、陈启友、谭美英、黄勇、肖安东。 DB43/T 12032016 1 饲料中雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚的测定 高效液相色谱法 1 范围 本 标 准 规 定 了 饲 料 中 雌 二 醇 （ Estradiol ） 、 炔 雌 醇 （ Ethinylestradiol ） 、 己 烯 雌 酚（Diethylstilbestrol）的高效液相色谱测定方法。 本标准适用于我省配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料中雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料 采样 GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 3 原理 采用甲醇提取试样中的雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚，固相萃取柱净化，收集流出液，高效液相色谱法测定，外标法定量。 4 试剂与材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682 一级水的规定。 4.1 甲醇，色谱纯。 4.2 乙腈，色谱纯。 4.3 甲醇。 4.4 雌二醇标准品，纯度96.0%。 4.5 炔雌醇标准品，纯度99.0%。 4.6 己烯雌酚标准品，纯度99.0%。 4.7 标准储备液：分别准确称取雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚标准品 25mg（精确到 0.01mg）于 25mL 容量瓶中，用色谱纯甲醇溶解并定容至刻度，即为 1.00mg/mL 标准储备液。-18以下避光保存，有效期1 年。 4.8 标准工作液：移取适量标准储备液，用色谱纯甲醇稀释成浓度为(0.5 50)g/mL 的标准工作液，现配现用。 4.9 中性氧化铝固相萃取柱：500mg，3mL，或相当者。 4.10 微孔滤膜：0.22m，有机膜。 DB43/T 12032016 25 仪器与设备 5.1 高效液相色谱仪：配有紫外或二极管阵列检测器。 5.2 分析天平：感量 0.00001g 和 0.001g。 5.3 离心机：转速10 000r/min，带有 50mL 离心管。 5.4 超声波清洗机。 6 采样与试样的制备 6.1 采样按 GB/T 14699.1 的规定执行。 6.2 试样制备按 GB/T 20195 的规定执行。 7 测定步骤 7.1 提取 称取试样 2g（精确到 0.001g）, 置于 50mL 离心管中, 准确加入 20mL 甲醇，涡旋振摇 1min, 室温下超声提取 5min，涡旋 30 秒后静置分层，于 50mL 离心管中 10 000r/min 离心 5min，取上清液供固相萃取柱净化。 7.2 净化 将固相萃取柱用 3mL 甲醇活化，移取适量上清液过柱，弃除前 4mL 流出液，收集 1mL 流出液，涡旋混匀，微孔滤膜过滤后，供高效液相色谱分析。 7.3 测定 7.3.1 高效液相色谱参数 色谱柱：C18 柱（250mm4.6mm，5m） ，或相当者。 流动相：乙腈+水（V+V=50+50） 。 流速：1.0mL/min。 进样量：20L。 检测波长：205nm。 7.3.2 试样测定 取试样溶液和相应的标准工作液进样， 以组分的保留时间定性， 以色谱峰面积积分值做单点或多点校准，外标法定量。标准工作液和试样溶液中雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚的响应值均应在仪器检测的线性范围内。雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚高效液相色谱图参见附录 A，雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚标准工作液色谱图参见附录 A 中图 A1，饲料中添加雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚标准物质色谱图参见附录 A 中图 A2。 7.3.3 空白试验 除不加试料外，采用上述相同步骤操作。 DB43/T 12032016 3 8 结果计算 试样中雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚的含量由色谱数据处理软件或按下式计算获得： SSCA VXAm= X试样中雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚的含量，单位为毫克每千克（mg/kg） ； A试样中雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚的峰面积； Cs标准工作液中雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚的浓度，单位为微克每毫升（g/mL） ； As标准工作液中雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚的峰面积； V提取用溶液的总体积，单位为毫升（mL） ； m试样质量，单位为克（g） ； 计算结果需扣除空白试样值， 测定结果用两次平行测定的算术平均值表示。 测定结果保留三位有效数字。 9 灵敏度、准确度和精密度 9.1 灵敏度 雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚在饲料中的定量限为 5mg/kg。 9.2 准确度 本方法雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚在 5mg/kg、10mg/kg、50mg/kg 添加浓度水平上的回收率范围为（70120）%。 9.3 精密度 本方法的批内变异系数10%，批间变异系数15%。 DB43/T 12032016 4 附录 A (资料性附录） 雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚高效液相色谱图 0.02.55.07.510.012.515.017.5min0102030405060mV检测器 A Ch1:205nm 图 A1 雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚标准工作液色谱图（5g/mL） 0.02.55.07.510.012.515.017.5min01020304050607080mV检测器 A Ch1:205nm 图 A2 饲料中添加雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚标准物质的色谱图（50mg/kg）