基因定点突变技术教育课件.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,基因定点突变技术,定点突变,定点突变是指通过聚合酶链式反应（,PCR,）等方法向目的,DNA,片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高,DNA,所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。,定点突变的目的,基因定点的突变是指按照设计的要求，使基因的特定序列发生插入、删除、置换和重排等变异。,体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间关系的有力工具。,蛋白质的结构决定其功能，对某个已知基因的特定碱基进行定点改变，缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构和功能，改造酶的不同活性或者动力学特性。,寡核苷酸介导的基因突变,指用含有突变碱基的寡聚核苷酸片断作为引物，在聚合酶的作用下启动,DNA,分子进行复制。,盒式突变,是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。,PCR,介导的基因突变,定点突破的方法,寡核苷酸介导的定点突变,寡聚核苷酸定点诱变技术是由加拿大的生物化学家,(michael smith),发明的,.,寡核苷酸定点突变基本原理,合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物，使其与带有目的基因完全互补。,合成的寡核苷酸引物除短的错配区外，与目的基因完全互补。,然后用,DNA,聚合酶使寡核苷酸引物延伸，完成单链,DNA,的复制。,由此产生的双链,DNA,，一条链为野生型亲代链，另一条为突变型子代链。,将获得的双联分子通过转导入宿主细胞，并筛选出突变体其中基因已被定向修改,盒式突变,1985,年,Wells,提出的一种基因修饰技术,盒式突变,。,盒式突变：用一段人工合成具有突变序列的,DNA,片段，取代野生型基因中的相应序列。,然而，并非所有变异区附近都能找到合适的限制位点，如果不存在限制位点，就要用寡核苷酸指导的定位诱变引入限制位点。,PCR,介导的定点突变,在最初所建立的,PCR,方法中就可看出只要引物带有错配碱基便可使,PCR,产物的末端引入突变。但是诱变部分并不总在,DNA,的中间部分进行诱变。,目前采用重组,PCR,进行定位诱变，可以在,DNA,片段的任意部位产生定位突变,。,重叠延伸的介导的突变,大引物诱导法,定位突变用途,定点突变法的应用不仅广泛用于基因工程技术领域，还可用于农业培育抗虫、抗病的良种，用于医学矫正遗传病、治疗癌症等病。,定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者,DNA,作用元件，引入新的酶切位点，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。,应用前景,不同于定点突变的是基于,PCR,的随机突变，通过改变,PCR,条件提高,PCR,过程中的随机出错，这种方法适用于未知的蛋白质，作全局性分析，所以有人称为饱和突变（,saturation mutagenesis,）。不过这种方法由于没有目的性，分析操作相当繁琐，并且不会出现一个位点,2,个以上碱基突变，因而应用上有局限性。定点突变适用于蛋白结构已有初步了解的基因，比,PCR,随机突变更有目的性，也更为精确，简单，同时改造基因更加,“,随心所欲,”,。由于定点突变技术在蛋白质组学中有这非常广泛的应用前景，相信这个技术在不远的将来还会有更大的改进和发展，也必将为更多人熟悉应用。,在分子生物学和基因工程中的应用,探明未知序列的结构和功能的关系，如启动子诱变筛选，真 核的,TATA,盒保守序列确定。,载体构建：调控元件，强启动子，多接头。,研究基因调控序列，如,AUG,前加入,ACC,序列最佳。,在蛋白质工程中的应用,降低毒性，如,TNF,改变亚型和种的特异性，如,IFN,的,23,位,AAG,（赖氨酸），,AGG,（精氨酸），使,IFN2a,变成,IFN2b,。,123,位,Try,（酪）变甘,/,丝，使,IFN,种属特异性明显改变，对人抗病毒活性小于牛。,提高活性和稳定性，如,IFN-,ser17,（,cys,变,ser,）,提高蛋白质作用的专一性，如,IFN,的,9-56,位被,IFNa,的,7-54,位取代后，活性提高,40,倍。,