第二章核酸化学(中职生物化学).ppt

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Miescher,（弗雷德里希、米歇尔）,从脓细胞中提,取,“核素”,1944,年,Avery（埃弗里）等人,证实DNA是遗传物质,1953年,Watson,和,Crick,发现DNA的双螺旋结构,1968年,Nirenberg,发现,遗传密码,1975年,Temin,和,Baltimore,发,现,逆转录酶,1981年,Gilbert,和,Sanger,建,立,DNA测序方法,1985年 Mullis发明,PCR技术,1990年 美国启动,人类基因组计划(,HGP,),1994年 中国人类基因组计划启动,2001年 美、英等国,完成人类基因组计划基本框架,Friedrich Miescher(1844-1895),Friedrich Miescher worked at the Physiological Laboratory of the University of Basel and in Tbingen and is most well known for his discovery of the nucleic acids.(,DNA Pioneers and Their Legacy by Ulf Lagerkvist,1998,Yale University Press,ISBN 0-300-07184-1,).,To read excerpts from this book,click,DNA Pioneers,.,米歇尔Friedrich Miescher（18441895）,米歇尔，瑞士生物学家，生前工作于巴塞尔大学的生理学研究室。以发现核酸而闻名世界。,米歇尔小时候有严重的听力障碍，因此在童年时代，尽管他非常聪明，但总是害羞并很内向。他酷爱音乐，与其父亲一样是一个天才歌手，在学校的学习成绩很好。1865年米歇尔成为一名医学生，1868年获医学博士学位。但听力问题是他成为临床医生的障碍。,1868年，米歇尔感兴趣研究白细胞。为了得到足够的白细胞，他从医院的外科绷带中洗脱脓液的白细胞，分离细胞核，得到一些粘稠的物质，并经实验证明含有磷和氮，称为,核素,。随后的研究证明这一物质具有酸性，故称为核酸。这是,米歇尔首次发现了重要的生命物质之一 核酸。,1879,年Kossel,(科塞尔),经过10年的努力,搞清楚核素中有四种不同的组成部分:A,T,C,和,G。,1889,年Altman,（阿特曼）,建议将,核素,改名为,“,核酸,”,并且已经认识到,“,核素,”,乃,“,核酸,”,与蛋白质的复合体。,1909,年Levene,（莱文）,发现酵母的核酸含有核糖。,1930,年Levene发现动物细胞的核酸含有一种特殊的核糖即脱氧核糖,得出了一个错误概念:植物核酸含核糖,动物核酸含脱氧核糖。这个错误概念一直延续到1938年，这时方清楚RNA和DNA的区别。Levene还提出了核酸的“磷酸-核糖(碱基)-磷酸”的骨架结构,解决了DNA分子的线性问题,还在1935年提出“,四核苷酸,”学说,认为这四种核苷酸的聚合体是构成核酸的基本单位。,Reichard,P.J.Biol.Chem.2002;277:13355-13362,Oswald T.Avery(1877-1955).,埃弗里，O.T.Oswald Theodore Avery,(18771955),美国细菌学家。1877年10月21日生于加拿大新斯科舍哈利法克斯。1904年毕业于哥伦比亚大学医学院，后到布鲁克林的霍格兰实验室研究并讲授细菌学和免疫学。1913年转到纽约的洛克菲勒研究所附属医院工作，直到1948年退休。,他和C.麦克劳德、M.麦卡锡于1944年重做1928年Griffith,（格里菲斯）,的细菌转化实验共同发现不同型的肺炎双球菌的转化因子是 DNA,。这项实验第一次证明了遗传物质是DNA而不是蛋白质。虽然这一发现，曾引起争论和怀疑，但的确推动了DNA的研究，直至1953年DNA双螺旋结构的发现。他还通过对肺炎双球菌的免疫性研究，提出肺炎双球菌可根据其免疫的专一性来进行分类，而这种免疫专一性是由于不同菌型的荚膜中所含的多糖引起的。由此他建立起对不同型肺炎双球菌的灵敏检验法。1955年2月20日卒于美国田纳西州纳什维尔。,1928年,Griffith,的细菌转化实验,1944,年Avery,等,重做1928年,Griffith,（格里菲斯）,的细菌转化实验,，证明DNA是遗传物质。但人们对此持怀疑态度，理由是：,（1）因认为蛋白,质,相对分子质量大，结构复杂，二十种氨基酸的排列组合将是个天文数字，可作为一种遗传信息。而DNA相对分子质量小，只含4种不同的碱基，人们一度认为不同种的有机体的核酸只有微小的差异。,（2）认为转化实验中DNA并未能提得很纯，还附有其它物质。,（3）即使转化因子确实是DNA，但也可能DNA只是对荚膜形成起着直接的化学效应，而不是充当遗传信息的载体。,1952,年Hershey,&,Chase,（赫希和蔡斯）,的,T2,噬菌体感染实验进一步证明DNA是遗传物质。,1952年Hershey and Chase的,T2噬菌体感染,实验,二、核酸的分类及分布,90%,以上分布于细胞核，其余分布于核外,如线粒体，叶绿体，质粒等。,分布于,细胞质中,。,(deoxyribonucleic acid,DNA),(ribonucleic acid,RNA),脱氧核糖核酸,核糖核酸,携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型(genotype)。,参与细胞内DNA遗传信息的表达。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体。,核酸,第一节,核酸,分子,的化学组成,The Chemical Component,of Nucleic Acid,1.元素组成,C、H、O、N、P（910%）,2.分子组成,一、核酸的化学组成,戊 糖,（构成RNA）,1,2,3,4,5,核糖(ribose),（构成DNA,）,脱氧核糖(deoxyribose),-D-核糖,-D-2-脱氧核糖,嘌呤(purine),腺嘌呤(adenine,A),鸟嘌呤(guanine,G),碱 基,嘧啶(pyrimidine),胞嘧啶(cytosine,C),尿嘧啶(uracil,U),胸腺嘧啶(thymine,T),（,构成RNA）,（构成DNA,）,核苷：,AR,GR,UR,CR,脱氧核苷：,dAR,dGR,dTR,dCR,1.核苷(ribonucleoside)的形成,碱基和核糖（脱氧核糖）通过,糖苷键,连接形成核苷（脱氧核苷）。,1,1,二、核酸的基本,组成,单位核苷酸,核苷酸：,AMP,GMP,UMP,CMP,脱氧核苷酸：,dAMP,dGMP,dTMP,dCMP,2.核苷酸(ribonucleotide),核苷（脱氧核苷）和磷酸以,磷酸酯键,连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。,1,2,3,4,5,核酸,戊糖,碱基,核苷,核苷酸,RNA,D核糖,A（腺嘌呤）,G（鸟嘌呤）,C（胞嘧啶）,U（尿嘧啶）,A,R,(腺苷）,G,R,(鸟苷）,C,R(,胞苷）,U,R(,尿苷）,AMP,GMP,CMP,UMP,DNA,D2脱氧核糖,A（腺嘌呤）,G（鸟嘌呤）,C（胞嘧啶）,T（胸腺嘧啶）,dA,R,(脱氧腺苷）,dG,R,(脱氧鸟苷）,dC,R,(脱氧胞苷）dT,R,(脱氧胸苷）,dAMP,dGMP,dCMP,dTMP,DNA与RNA基本组成成分比较,3.体内重要的游离核苷酸及其衍生物,含核苷酸的生物活性物质：,NAD,+,（辅酶,）,、NADP,+,（辅酶,）,、CoA-SH、FAD,等都含,有,AMP,多磷酸核苷酸：,NMP，NDP,，,NTP,环化核苷酸:,cAMP，cGMP,AMP,ADP,ATP,cAMP,NADP,+,NAD,+,第二节,核酸,的,一级,结构,5,端,3,端,核苷酸的连接,一分子的核苷酸的,3,-,羟基,团,与另一分子核苷酸的,5,-,磷酸基,团,通过脱水可形成,3,5,-,磷酸二酯键,，从而将两分子核苷酸连接起来。,C,G,A,定义,指多核苷酸链,中核苷酸的,种类、比例和,排列顺序。,由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为,碱基序列,。,5,端,3,端,C,G,A,核酸,的一级结构,编写式：,DNA:5,-A-T-G-C-A-3,RNA:5,-U-G-C-C-A-3,第三节,DNA的,空间结构,双螺旋结构,、三级结构,1.DNA双螺旋结构的研究背景,碱基组成分析,Chargaff,规则：,A,=,T,G,C,碱基的理化数据分析（滴定）,A-T,、,G-C,以,氢键,配对较合理,DNA纤维的X-线衍射图谱分析,沃森和克里克在实验室成功搭建DNA分子双螺旋结构模型。,2、,DNA,双螺旋,结构,模型要点,（,1,）,DNA,分子由两条脱氧多核苷酸链,(,简称,DNA,单链,),组成，两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成,右手双螺旋,结构。螺旋中的两条链方向相反，即其中一条链的方向为,53,，而另一条链的方向为,35,。,（,2,）磷酸基和脱氧核糖位于螺旋外侧，彼此之间通过,磷酸二酯键,连接，形成,DNA,骨架。嘌呤碱和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，糖环平面与碱基环平面,之间的角度近似直角,。,（,3,）双螺旋的直径约为,2nm,。每条链相邻两个碱基平面之间的距离为,0.34,nm,，两个核苷酸之间的夹角为,36,。每,10,个,碱基对,形成一个螺旋，其螺矩（即螺旋旋转一圈）高度为,3,.,4nm,。,2.0 nm,小沟,大沟,（,4,）两条链由碱基间氢键相连。碱基间形成氢键有一定的规律：腺嘌呤与胸腺嘧啶成对，鸟嘌呤与胞嘧啶成对。,A,和,T,间形成两个氢键，,G,和,C,间形成三个氢键，这种碱基之间相互配对称为碱基互补。,（,5,）沿螺旋轴方向观察，配对的碱基并不充满双螺旋的全部空间。由于碱基对的方向性，使得碱基对占据的空间不对称，因此在双螺旋的表面形成两个凹下的槽，一个较大，一个较小，分别称为大沟和小沟,，又可称为深沟和浅沟,。,(6),DNA,双螺旋的稳定因素,DNA,双螺旋结构在生理条件下是很稳定的。,双螺旋稳定的力：,氢键,碱基堆积力（疏水相互作用及范德华力）,离子键等,则,DNA,变性剂（热、,pH,、脲,/,酰胺、有机溶剂）,DNA,右双螺旋结构模型,要点总结,（Watson,Crick,1953）,1、右双螺旋，反向平行,2、碱基在内，主链在外,3、碱基互补，A,T，G,C,4、螺旋一圈，十对碱基,5、结构稳定，副键维系,6、大沟小沟，调节关键,3、,DNA,的三级结构,在,DNA,双螺旋二级结构的基础上，双螺旋扭曲或再次螺旋就构成,DNA,的三级结构。超螺旋是,DNA,三级结构的一种,常见,形式。超螺旋的形成与分子能量状态有关。,（1）,原核生物,DNA,的三级结构,绝大多数原核生物的,DNA,都是共价封闭的环状双螺旋。如果再进一步盘绕则形成麻花状的超螺旋三级结构。,（2）,真核生物中的核小体结构,在真核生物中，双螺旋的,DNA,分子围绕一蛋白质八聚体进行盘绕，从而形成特殊的串珠状结构，称为核小体。核小体,是染色质的基本组成单位,。,4、,DNA,的,功能,（1）生物遗传信息的载体,（2）基因复制和转录的模板,基因：,具有遗传效应的DNA片段，是遗传信息的结构和功能单位。,分类：（1）编码蛋白质,（2）没有翻译产物,（3）不转录的DNA片段,基因诊断：,利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构或表达水平是否正常，从而对疾病做出诊断的方法。,基因治疗：,指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷并发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。,基因组：,指一个细胞或生物体所含的全套基因。,基因组学：,就是发展和应用DNA制图、测序新技术以及计算机程序，分析生命体全部基因结构和功能的一门学科。,原核生物基因组特点：,1.基因组较小，通常只有一个DNA分子,2.功能相关的基因常构成一个转录单位操纵子（,Operon,）,3.无重复序列,4.DNA顺序所含有的结构基因是连续的，一般不含有间隔序列或很短,5.有重叠基因,1.基因组较大,2.不存在操纵子结构,3.有重复序列,（1）高度重复序列（卫星DNA）,（2）中度重复序列,A.串联重复序列：小卫星DNA,微卫星DNA和rDNA,B.散布重复序列:短散布元件，长散布元件和转座子,（3）低度重复序列,（4）单一序列,4.有断裂基因（内含子和外显子）,真核生物基因组特点：,鸡卵清蛋白的基因,第四节,RNA,的,空间,结构,（一）,RNA,的类型,mRNA,tRNA,rRNA,少数,RNA,病毒,（二）,RNA,的结构特征,（,1,）,RNA,的基本组成单位是,AMP,、,GMP,、,CMP,和,UMP,。一般含有较多种类的稀有碱基核苷酸。,（2）每分子,RNA,中约含有几十个至数千个,NMP,与,DNA,相似，彼此通过,3,5,-,磷酸二酯键连接而成多核苷酸链。,（,3,）,RNA,主要是,单链,结构，但局部区域也卷曲形成双螺旋结构，或称为发夹结构,(hairpair stucture),。双链部位的碱基一般彼此形成氢键而互相配对，即,A-U,及,G-C,，双链区有些不参与配对的碱基往往被排斥在双链外，形成环状突起。,(4)RNA,与,DNA,对碱的稳定性不同，,RNA,易被碱水解，使,5,-,磷酸酯键断开，形成,3,-,磷酸酯键的单核苷酸。,（三）参与蛋白质生物合成的三类,RNA,的结构,1.,转运,RNA(tRNA),的结构与功能,（,1,）一级结构,tRNA,分子量最小，,由,7,4,-9,5,个核苷酸组成；,含有较多的稀有碱基；,3,末端为,-C-C-A,-,OH,结构。,（,2,）,tRNA,的二级结构,tRNA,的二级结构由于局部双螺旋的形成,，含有3个发夹结构、4个螺旋区、3个环和1个附加叉,而呈现,“,三叶草,”,形，故称为,“,三叶草,”,结构。,tRNA,的,“,三叶草,”,形结构包括：氨基酸臂、,DHU,（二氢尿嘧啶）,环、反密码环、额外环和,T,(胸苷假尿苷),环五部分。,氨基酸臂,TC,环,反密码环,DHU,环,额外环,(,1),氨基酸接受区包含有,tRNA,的3,-末端和5,-末端，3,-末端的最后3个核苷酸残基都是,CCA,，,A,为核苷。氨基酸可与其成酯，该区在蛋白质合成中起携带氨基酸的作用。(2)反密码区与氨基酸接受区相对的一般含有7个核苷酸残基的区域，其中正中的3个核苷酸残基称为反密码子。,（,3)二氢尿嘧啶区,该区含有二氢尿嘧啶。,(4),T,C,区,该区与二氢尿嘧啶区相对，假尿嘧啶核苷,胸腺嘧啶核糖核苷环,(,T,C),由,7,个核苷酸组成，通过由,5,对碱基组成的双螺旋区,(,T,C,臂,),与,tRNA,的其余部分相连。除个别例外，几乎所有,tBNA,在此环中都含有,T,C,。,(5),可变区,位于反密码区与,T,C,区之间，不同的,tRNA,该区变化较大。,*tRNA的三级结构,倒L形,*,t,RNA的功能,活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。,2.信使RNA的结构与功能,hnRNA,内含子,(,intron,),mRNA,*mRNA成熟过程,外显子,(,exon,),目 录,*,mRNA,结构特点,1.大多数真核mRNA的5末端均在转录后加上一个7-甲基鸟,嘌呤-三磷酸核,苷，同时第一个核苷酸的C,2,也是甲基化，形成帽子结构：,m,7,GpppN,。,2.大多数真核mRNA的3末端有一个多聚腺苷酸,(polyA),结构，称为多聚A尾。,帽子结构,帽子结构,可保护mRNA免受核酸酶从5端的降解作用，并在翻译起始中具有促进核糖体与mRNA的结合、加速翻译起始速度的作用。,多聚A尾,可增加mRNA的稳定性和维持其翻译活性。,帽子结构和多聚A尾的功能,*mRNA,的功能,把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。,DNA,mRNA,蛋白,转录,翻译,原核细胞,细胞质,细胞核,DNA,内含子,外显子,转录,转录后剪接,转运,mRNA,hnRNA,翻译,蛋白,真核细胞,原核生物mRNA结构特点,一般都为多顺反子结构。即一个单链mRNA分子可作为多种多肽和蛋白肽链合成的模板。,mRNA的转录和翻译是耦合的，即mRNA分子一边进行转录，同时一边进行翻译。,mRNA分子包含有先导区、翻译区和非翻译区，即在两个顺反子之间有不参加翻译的插入序列。,真核生物mRNA结构特点,mRNA的3-末端有一段多聚腺苷酸（polyA),5-末端有帽子结构。,mRNA一般为单顺反子，即一个mRNA分子只为一种多肽编码。,mRNA的转录和翻译是分开进行的，先在核内转录产生hnRNA,转运到胞质内后，再在核外加工为成熟的mRNA，然后起翻译作用。,*rRNA的结构,3.核,糖,体RNA的结构与功能,*,rRNA,的功能,参与组成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。,16S rRNA,*rRNA,的种类（根据沉降系数S）,真核生物,5S rRNA,28S rRNA,5.8S rRNA,18S rRNA,原核生物,5S rRNA,23S rRNA,16S rRNA,核蛋白体的组成,原核生物（以大肠杆菌为例）,真核生物（以小鼠肝为例）,小亚基,30S,40S,rRNA,16S,1542个核苷酸,18S,1874个核苷酸,蛋白质,21种,占总重量的40%,33种,占总重量的50%,大亚基,50S,60S,rRNA,23S,5S,2940个核苷酸,120个核苷酸,28S,5.85S,5S,4718个核苷酸,160个核苷酸,120个核苷酸,蛋白质,31种,占总重量的30%,49种,占总重量的35%,1、,一般理化性质,两性物质，通常表现为酸性,DNA纯品为白色纤维状固体，RNA纯品为白色粉末，均微溶于水，不溶于有机溶剂,DNA溶液的粘度极高，而RNA溶液要小得多,溶液中的核酸分子在引力场的作用下可以沉降。,第,五,节 核酸的,主要,理化性质,2,、核酸的紫外吸收,在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在,260nm,左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。,以,A,260,/A,280,进行定性、定量。,DNA,和,RNA,溶液中加入溴化乙锭（,EB,），在紫外下发出荧光。,增色效应：,核酸水解为核苷酸，,A,260,增高30%40%的现象。,3,、,核酸,的变性,(denaturation),定义,：,双螺旋区氢键,断裂,，空间结构破坏，形成单链无规线团状态的过程。,方法：,强酸，强碱，高温，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。,变性后其它理化性质变化：,A,260,增高（增色效应）,粘度下降,比旋度下降,浮力密度升高,生物活性丧失,DNA变性的本质是双链间氢键的断裂,例：变性引起紫外吸收值的改变,DNA,的紫外吸收光谱,增色效应：,DNA变性时其溶液,A,260,增高的现象。,热变性,解链曲线：,如果在连续加热DNA的过程中以温度对,A,260（absorbance260，,A,260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线或热变性曲线。,Tm：,变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为核酸的解链温度，又称,变性,温度(melting temperature,Tm)。,影响Tm的因素,1.G-C对含量,：含量越高,Tm的值越大，当G-C的含量上升1%，则Tm上升0.4。马默多蒂,（Marmur-Doty）,关系式：Tm=69.3+0.41(G+C)%,或GC%=（Tm-69.3）2.44,2.,溶液的离子强度,：较高时,Tm的值较大。,3.,溶液的pH,：酸性条件下,核酸容易脱嘌呤；碱性条件下,核酸容易变性,通常加NaOH 维持变性状态。,4.,变性,剂,：,尿素,甲醛,甲酰胺等化学试剂可以降低Tm的值,称作,变性剂,。,4,、核酸的复性,核酸复性(renaturation)的定义,在适当条件下，变性核酸的两条互补链可重新缔合成双螺旋的过程称为,复性,。,减色效应,核酸复性时，其溶液,A,260,降低。,热变性的核酸经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为,退火(annealing),。,影响复性速度的因素,1.复性的温度：Tm 25,2.单链片段的浓度：浓度越高,复性的速度越快;,3.单链片段的长度：片段越大,复性的速度越慢;,4.单链片段的复杂度：重复序列越多,复性的速度越快;,5.溶液的离子强度：适当增高溶液的离子强度,复性的速度会增高。,在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成,杂化双链(heteroduplex),。,这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为,核酸分子杂交,。,六、核酸的分子杂交(hybridization),DNA-DNA,杂交双链分子,变性,复性,不同来源的DNA分子,核酸分子杂交的应用,研究DNA分子中某一种基因的位置,确定两种核酸分子间的序列相似性,检测某些专一序列在待检样品中存在与否,是基因芯片技术的基础,