核酸检测技术.ppt

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you!,核酸检测技术,直接对动植物有害生物,基因序列,和,结构,进行测定。,核酸的分离纯化,PCR,技术,核酸杂交技术,第,1,节,核酸的分离纯化,核酸的分离纯化的原则,保持核酸一级结构的,完整性,提高核酸制品的,纯度,技术路线的设计,破碎细胞的方法,机械,（匀浆、超声破、研磨等）,非机械,（化学处理、生化法）,沉淀是浓缩核酸最常用且高效的方法。,优点,缺点,乙醇,对盐类沉淀少，易挥发除去，不影响后续实验,需要量大，低温操作,异丙醇,需体积小，速度快，一般不需低温长时间放置,易使盐类、糖类与,DNA,共沉淀；异丙醇难以挥发除去,核酸浓度检测与完整性测定方法,浓度,测定,紫外分光光度法,260nm,荧光光度法,EB,荧光,完整性测定,琼脂糖凝胶电泳法：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果为依据。,基因组DNA片段如发生降解，电泳图呈拖尾状,；,完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带的荧光强度积分应呈特定的比值,问题一：,DNA样品不纯,抑制后续酶解和PCR反应,DNA提取常见问题,DNA提取常见问题,问题,二,：,DNA,降解,DNA提取常见问题,问题,三,：,DNA,提取量少,真菌,昆虫,第,2,节,PCR,扩增技术,PCR,a DNA photocopier,PCR,技术简史,DNA,的复制,核酸体外扩增的设想,聚合酶链反应的发明,1971,年，,Khorana,提出：经过,DNA,变性，与合适引物杂交，用,DNA,聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆,tRNA,基因。,但由于测序和引物合成的困难，以及,70,年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，,Khorana,的设想被人们遗忘了,1985,年，美国,PE-Cetus,公司的,Mullis,等人发明了聚合酶链反应（,PCR,）,最初采用,E-coli DNA,聚合酶进行,PCR,，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错,耐热,DNA,聚合酶的应用使得,PCR,能高效率的进行，随后,PE-Cetus,公司推出了第一台,PCR,自动化热循环仪,1993,年，,Mullis,等因此项技术获诺贝尔化学奖,PCR,技术简史,DNA,的复制,核酸体外扩增的设想,聚合酶链反应的发明,Kary B.Mullis,（,1944,）,1989,年美国,Science,杂志列,PCR,为十余项重大科学发明之首,比喻,1989,年为,PCR,爆炸年,Mullis,荣获,1993,年度诺贝尔化学奖。,1.PCR,的基础,Polymerase,Chain,Reaction,PCR,The only enzyme used in this reaction is DNA polymerase.,Polymerase,Chain,Reaction,The products of the first reaction become substrates of the following one,and so on.,PCR,Polymerase,Chain,Reaction,PCR,Components,：,Thermostable DNA Polymerase,，,Target DNA,，,Pair of Primers,，,dNTPs,，,Mg,+,ions,，,Buffer solution,Denaturation,：,The target DNA,(template),is separated into two stands by heating to 95,Primer annealing,:,The temperature is reduced to around 55 to allow the,primers,to anneal.,Polymerization(elongation,extension),:,The temperature is increased to 72 for optimal polymerization step which uses up,dNTPs,and required Mg,2+,.,The PCR cycle:,Three different steps in each PCR cycle,PCR,的扩增？,How does PCR work,The first cycle,The second cycle,How does PCR work,The third cycle,The fourth cycle,2.PCR,的类型,多重,PCR,（,multiplex PCR,）,巢式,PCR,（,nested PCR,）,定量,PCR,（,quantitative PCR,）,不对称,PCR,（,asymmetric PCR,）,反向,PCR,（,inverse PCR,）,逆转录,PCR,（,reverse transcription PCR,）,Overlap PCR,PCR using several primer pairs,SIMULTANEOUSLY,Typically generates a product band for each primer pair,多重,PCR,（,multiplex PCR,）,:,What,2.1,多重,PCR,（,multiplex PCR,）,Multiplex PCR:Why,Detect several genes at once,eg.transgenic plant screen,Internal controls,VERY important,Tells you how well the PCR reaction worked,Reduces“false negatives”,Reduces“false positives”,多重,PCR,（,multiplex PCR,）,Multiplex PCR:How,Same as regular PCR,Care in primer design,Much greater chance of primer-dimers,Much greater chance of artifacts,Annealing temperatures must be close,多重,PCR,（,multiplex PCR,）,A Typical Multiplex PCR Reaction,Sterile Water 34.0 ul,10X PCR Buffer 5.0 ul,MgCl2(50mM)2.5 ul,dNTPs(10mM each)1.0 ul,Primer1FWD 1.0 ul,Primer1REV 1.0 ul,Primer2FWD,1.0 ul,Primer2REV,1.0 ul,Primer3FWD,1.0 ul,Primer3REV,1.0 ul,DNA Polymerase 0.5 ul,DNA Template 1.0 ul,Total Volume 50.0 ul,多重,PCR,（,multiplex PCR,）,Multiplex PCR:Example,Three primer pairs,Control,resistance,and trait genes,Control gene fragment is largest and(almost)faintest,Trait gene is smallest and brightest,Resistance Gene,Trait Gene,Control Gene,Primers,多重,PCR,（,multiplex PCR,）,Multiplex PCR:Example,Three primer pairs,Resistance Gene,Trait Gene,Which are transgenic?,Control Gene,Primers,多重,PCR,（,multiplex PCR,）,Nested Multiplex PCR,2,nd,Stage PCR,Dilute 100 fold,Between 1,st,&2,nd,stage reactions,1F,1R,2R,3R,5R,6R,3F,2F,6F,4F,5F,4R,Primary Multiplex RT-PCR,多重,PCR,（,multiplex PCR,）,2.2,定量,PCR,（,quantitative PCR,）,实时荧光定量,PCR,（,Real time Quantitative PCR,）：,在,PCR,反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个,PCR,进程，对起始模板进行定量分析的方法。,Real-time PCR monitors the fluorescence emitted during the reaction as an indicator of amplicon production at each PCR cycle(in real time)as opposed to the endpoint detection,荧光定量,PCR,技术：,利用,荧光信号的变化实时检测,PCR,扩增反应中,每一个循环扩增产物量的变化,，通过,Ct,值和标准曲线的关系对,起始模板,进行定量分析。,与常规,PCR,技术比较：,对,PCR,扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，,无法对起始模板准确定量,，无法对扩增反应实时检测,（,1,）定量原理,三个概念：,扩增曲线、荧光阈值、,Ct,值,如何对起始模板定量？,通过,Ct,值和标准曲线对,起始模板,进行定量分析,荧光定量,PCR,原理,扩增曲线,扩增曲线图：,横坐标：,扩增循环数（,Cycle,）；,纵坐标：,荧光强度,每个循环进行一次荧光信号的收集,荧光基团,荧光检测元件,荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段,：基线期、,指数增长期,和,平台期,。,Cycle,（循环数）,Rn,（荧光强度）,基线期,平台期,平台期,荧光定量,PCR,原理,荧光域值,Cycle,（循环数）,Rn,（荧光强度）,基线期,指数扩增期,平台期,荧光域值,手动设置,：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段,荧光定量,PCR,原理,Ct,值,PCR,扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的,扩增循环次数,。,C(t)value,纵轴：荧光信号量,Ct,值的特点,：,相同模板进行,96,次扩增，终点处产物量不恒定；,Ct,值则极具重现性,Ct,值的重现性,定量原理,理想的,PCR,反应：,X=X,0,*,2,n,非理想的,PCR,反应：,X=X,0,(1+Ex),n,n,：扩增反应的循环次数,X,：第,n,次循环后的产物量,X,0,：初始模板量,Ex,：扩增效率,扩增效率,E,（,amplification efficiency,）,一个循环后的产物增加量与这个循环的模板量的比值，其值位于,0,到,1,之间。,在,PCR,的前,20,或,30,个循环中，,E,值比较恒定，为指数扩增期，随后,E,值逐步降低，直至,0,，此时,PCR,达到平台期，不再扩增。,扩增效率的计算可以采用系列稀释法，将稀释后浓度的对数值与所得,Ct,值做图，在一定范围内应该是得到一条直线，利用公式（,1,）：,E=10,-1/K,-1,（,K,为该直线斜率）即可计算出,E,值。,在扩增产物达到阈值线时,:,X,Ct,=X,0,(1+Ex),Ct,=M (1),X,Ct,:,荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量,.,在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为,M,方程式,(1),两边同时取对数得,:,log M=log X,0,(1+Ex),Ct,(2),整理方程式,(2),得,:,log,X,0,=-log(1+Ex)*,Ct,+log M,(3),CT=-k lg X,0,+b,（线性方程）,LogX,0,浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到,域值的循环数即,Ct,值,就可计算出样品中所含的模板量。,标准,曲,线,：,CT,值对,DNA,0,作图,模板,DNA,量越多，荧光达到域值的循环数越少，即,Ct,值越小。,Log,模板起始浓度与,Ct,值呈线性关系。,Cycle number,Ck 10,4,Ck 10,2,Sample,Log of DNA concentration,（,2,）荧光定量,PCR,的化学原理,1.Hydrolysis probes,（水解探针）,(TaqMan,Beacons),2.DNA-binding(intercalating)agents,（结合）,(SYBR Green,Eva Green,LC Green),3.Hybridization or FRET probes,（杂交）,(Light Cycler),非特异性荧光标记：,1,、,SYBR Green,特异性荧光标记：,2,、,TaqMan,3,、,Molecular Beacon,4,、,Amplisensor,Q,Q,R,DNA,产物的荧光标记,SYBR Green,法,SYBR Green,能结合到双链,DNA,的小沟部位,SYBR Green,只有和双链,DNA,结合后才发荧光,变性时，,DNA,双链分开，无荧光,复性和延伸时，形成双链,DNA,，,SYBR Green,发荧光，在此阶段采集荧光信号。,信号强度与,DNA,分子总数目成正比,。,SYBR Green,5,3,5,3,SG,No Emission,SG,SG,SG,Excitation,SG,SG,SG,SG,SG,SG,SG,5,3,5,3,Emission,Excitation,SYBR Green,法优缺点,对,DNA,模板没有选择性,-,适用于任何,DNA,使用方便,-,不必设计复杂探针,非常灵敏,便宜,优 点,容易与非特异性双链,DNA,结合，产生假阳性,但可以通过,融解曲线的分析,，优化反应条件,对引物特异性要求较高,缺 点,Tm,值：,DNA,解链一半时的温度,将温度与荧光强度的变化求导。,(-dI/dT),与目标序列互补,TaqMan,法,TaqMan-,水解型杂交探针,5,端标记有报告基团,(Reporter,R),，如,FAM,、,VIC,等,3,端标记有荧光淬灭基团,(Quencher,Q),探针完整，,R,所发射的荧光能量被,Q,基团吸收，无荧光，,R,与,Q,分开，发荧光,Taq,酶有,53,外切核酸酶活性，可水解探针,每扩增一条,DNA,分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光,TaqMan,法优缺点,对目标序列的高特异性,-,阴性结果确定,设计相对简单,-,与目标序列某一区域互补,重复性比较好,优 点,只适合一个特定的目标,委托公司标记，价格较高,不易找到本底低的探针,缺 点,Title=(Real-time PCR),Timespan=2009-2012.,Published Items in Each Year,Examples of SYBR Green real-time PCR assays for detection of plant pathogenic,fungi(last 6 years),（,3,）定量方法,绝对定量（,Absolute Quantification,）,确定未知样本中某个核酸序列的,绝对量值,，即通常所说的拷贝数。,相对定量（,Relative Quantification,）,测定一个测试样本中目标核酸序列与校正样本中同一序列表达的,相对变化。,2,-C,（,t,）,双标准曲线法,相对定量中的内标,内标通常是,-actin,、,GAPDH,基因等看家基因,在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小,内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量,绝对定量的标准样品：,已知拷贝数的质粒,DNA,和体外转入的,RNA,相对定量：参照因子,Calibrator,相对定量分析方法,1,-Ct,相对定量分析方法,2,：,双标准曲线法,目标基因与内参基因扩增效率不同,特异性,重复性,灵敏度,其他问题,常见问题讨论,扩增的特异性,引物？,Tm,，重新设计引物，优化条件,Tm,重复性,-,判断实验优劣的重要指标,判断指标,：主要为标准差（,SD,）和变异系数（,CV,）,影响重复性的因素,：,PCR,反应扩增的效率：优化实验条件，使反应体系达到最佳扩增效率。,目的基因的初始浓度：使用初始浓度具有较高数量级的样本或作平行孔。,标准曲线的影响：不少于,5,个稀释度的标准品，涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围；理想的标准品应与样本具有高同源性，质粒,DNA,或是体外合成、转录的,RNA,。,影响灵敏度的因素,反应体系中形成的引物二聚体的影响,可以用水解探针代替,SYBR Green I,，有文献报导使用水解探针的敏感性要比,SYBR Green I,高出,10,倍。,可以使用热启动办法或使用特殊处理的,Taq,酶,要尽可能地优化引物设计,如果反应体系中出现,PCR,的抑制因素，应适当将目的基因的浓度稀释后再进行扩增。,注意避免室温混合各种试剂，并且在一经混合后立即开始进行扩增。,循环数,Mg,2,的浓度,Q1:,无,Ct,值（信号）出现,可能性不大,检测荧光信号的步骤有误,:,一般,SG,法采用,72,延伸时采集，,Taqman,法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。,引物或探针降解,:,可通过,PAGE,电泳检测其完整性。,模板量不足,:,对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。,模板降解,:,避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。,Q2:Ct,值出现过晚（,Ct,38,）,扩增效率低,:,反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。,PCR,各种反应成分的降解或加样量的不足。,PCR,产物太长,:,一般采用,80-150bp,的产物长度。,Q3:,标准曲线的线性关系不佳,加样存在误差,:,使得标准品不呈梯度。,标准品出现降解,:,应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。,引物或探针不佳,:,重新设计更好的引物和探针,模板中存在抑制物，或模板浓度过高。,Q4:,阴性对照也出现明显的起飞,反应,mix,或水被污染。,引物二聚体的出现：用,SG,法在,35cycles,以后阴性出现起飞属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。,反应过程中探针的降解：用,PAGE,电泳对探针进行检测。,ROX,校正的问题：如果使用了，则可能是,ROX,的降解所造成。,Q5:,熔解曲线不止一个主峰,引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。,引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。,镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的,mix,试剂盒。,模板有基因组的污染：,RNA,提取过程中避免基因组,DNA,的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。,Q6:,扩增效率低,反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。,反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。,反应体系中有,PCR,反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。,两步扩增反应,Real-time qPCR:,循环数,Step,温度,时间,检测,说明,1,1,95,2min,Off,起始模板预变性,35-45,1,95,15sec,Off,模板变性,2,60-68,20-60sec,On,退火,/,延伸,三步扩增反应,Real-time qPCR:,循环数,Step,温度,时间,检测,说明,1,1,95,2min,Off,起始模板预变性,35-45,1,95,10-20sec,Off,模板变性,2,55-65,10-20sec,Off,退火,3,72,20-60sec,On,延伸,3.,提高,PCR,反应特异性的策略,巢式,PCR,（,Nest-PCR,）,四种策略,递减,PCR,（,TouchDown PCR,）,热启动,PCR,（,HotStart PCR,）,使用,PCR,增强剂,策略之一,巢式,PCR,（,Nested-PCR,）,P,1,P,2,P,3,P,4,巢式,PCR,的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。,巢式,PCR,可以增加有限量靶序列,（,如稀有,mRNA,）,的灵敏度，并且提高了困难,PCR,（,如,5 RACE,）的特异性。,First round,primers,First round,PCR,Second round,primers,Second round,PCR,Gene of interest,Nested PCR:to increase specificity,策略之二,递减,PCR,（,TouchDown PCR,）,递减,PCR,通过在,PCR,的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的,Tm,高大约,5,的退火温度下开始，然后每个循环降低,1,-,2,直到退火温度低于,Tm,5,。,特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。,递减,PCR,对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如,AFLP,、,DNA,指纹分析等。,策略之三,热启动,PCR,（,HotStart PCR,）,热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟,DNA,合成，直到,PCR,仪达到变性温度；,现在有很多公司都有,HotStart Taq,酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用,；,热启动,PCR,是除了好的引物设计之外，提高,PCR,特异性最重要的方法之一。,策略之四,使用,PCR,增强剂,甲酰胺，,DMSO,，甘油，甜菜碱等都可充当,PCR,的增强剂。,其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助,DNA,聚合酶延伸通过二级结构区,。,增强剂浓度要适当,4.PCR,常见问题及分析,Denaturation Temp,Annealing Temp,Extension Temp,Time,Number of Cycles,Reaction Volume,“Odd”Protocols,PCR Cycling Parameters,Water,Buffer,DNA template,Primers,Nucleotides,Mg+ions,DNA Polymerase,Extras,Reaction Components,IMPORTANT,!Basic Experimental Design,A well-designed experiment can keep you from ever getting into trouble!,A poorly-designed experiment is asking for problems!,Main point:Always use CONTROLS,Positive control,So youll know what a successful result looks like.,Negative control,Lets you know if you have contamination.,Experimental Design:Controls,No positive or negative controls,What does this result mean?,Only a positive control,How do we know the result isnt due to contamination?,Both positive and negative controls,Results can be interpreted withconfidence.,U,U,+,U,-,+,PCR,常见问题之一,无扩增产物（假阴性）,模板,:,含有抑制物，含量低,Buffer,对样品不合适,引物设计不当或者发生降解,反应条件：,退火温度太高，延伸时间太短,原因,对,策,纯化模板或者使用试剂盒提取模板,DNA,或加大模板的用量,更换,Buffer,或调整浓度,重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物,降低退火温度、延长延伸时间,现象：,正对照有条带，而样品则无,；,PCR,常见问题之二,非特异性扩增,现象：,PCR,扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。,PCR,常见问题之二,引物特异性差,模板或引物浓度过高,酶量过多,Mg,2+,浓度偏高,退火温度偏低,循环次数过多,原因,对,策,重新设计引物或者使用巢式,PCR,适当降低模板或引物浓度,适当减少酶量,降低镁离子浓度,适当提高退火温度或使用二阶段温度法,减少循环次数,非特异性扩增,PCR,常见问题之三,拖尾,现象：,产物在凝胶上呈,Smear,状态,。,M 1 2,PCR,常见问题之三,模板不纯,Buffer,不合适,退火温度偏低,酶量过多,dNTP,、,Mg,2+,浓度偏高,循环次数过多,原因,对,策,纯化模板,更换,Buffer,适当提高退火温度,适量用酶,适当降低,dNTP,和,镁离子,的浓度,减少循环次数,拖尾,PCR,常见问题之四,假阳性,（筛选转基因、检测基因表达情况,),原因：,靶序列或扩增产物的交叉污染,现象：,空白对照出现目的扩增产物,对策：,操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；,除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。,各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。,PCR,常见问题之五,-,引物二聚体,5.,分子检测的靶标基因,Purvis and Hector,2000,Nature,昆虫,菌物,昆虫和菌物的物种丰富度,The,mitochondrial cytochrome oxidase c subunit I(COI),gene is one of the most popular markers for population genetic and phylogeographic studies across the animal kingdom.,5,3,LCOF 1490*,Ag1718F,1401,2942,COI,tRNA Coding Regions,Gene Coding Regions,Control Region,Barcoding Region,Forward Primer,Reverse Primer,HCOR 2198*,Ag1859R,mtDNA Genome,The order of genes on the mitochondrial genome,Relatively well studied at the biochemical level,Size and structure conserved across all aerobic organisms,Mix of variable and conserved regions,Largest of the three CO subunits,Broad spectrum of substitutional rates,菌物常用的靶标基因,核糖体基因包括,5S,、,5.8S,、,18S,、,28S,在内的,4,个,rDNA,基因，是细胞核内染色体上的多拷贝、中度重复序列。,编码,18S,、,5.8S,和,28S,的,rDNA,作为,1,个转录单 元，以中等重复的串联形式存在于染色体 上。,18S(SSU),5.8S,28S(LSU),IGS,ITS,1,ITS,2,IGS,5,3,IGS,，基因间隔区（,intergenic region spacer,）；,ITS,，内转录间隔区（,internal transcribed spacer,）,ITS5,ITS1,ITS3,ITS2,ITS4,ITS4-B,rDNA,（核糖体,DNA,）基因的结构图,ITS,作为,DNA,条形码的优点,（,1,）,ITS,两侧序列保守便于设计通用引物，可广泛应用于,PCR,扩增,；,（,2,）,ITS,的高重复度有利于从微量,DNA,样品中进行检测,（,3,）,ITS,可应用于同属近缘种及种内的进化关系研究,；,IGS,（,Intergenic spacer,，核糖体基因内间隔区）序列：分开每个重复序列的,DNA,片段。,相对于,ITS,区，,IGS,是一个高变区,它们常用于属内种间比较或种内群体比较。,beta tubulin,Actin,RNA polymerase II large subunit,RPB1,Translation elongation factor 1-,Ypt1,.,菌物常用的靶标基因,List of primers reported for the identification and detection of Phytophthora species known to threaten forests and other natural ecosystems.,线粒体,DNA,是真核生物细胞核外一种呈环状的小分子双链,DNA,，单拷贝，不含基因间隔区和内含子，进化历史简单明了，酶切位点少，易于分析。,由于,mtDNA,的分子进化速度比细胞核,DNA,快，所以,mtDNA,分子的分析物种种内和种间的分类灵敏度高，应用,PCR,等分子生物学技术可将分类单位精确到种以下，可以用来对种、变种、个体菌株及杂交种进行检测。,线粒体,DNA,（,mitochondrial DNA,，,mtDNA,思考题：,1.,核酸沉淀常用的有机溶剂，他们的优缺点是什么。,2.,核酸提取不纯的原因是什么，如何改进。,3.,基因组提取过程中降解的原因及改进。,4.1,个,PCR,循环是有哪几步组成，分别是什么。,5.,不同,PCR,的类型，,6.,多重,PCR,如何进行，有什么优缺点,7.,定量,PCR,、扩增曲线、荧光阈值、,Ct,值、标准曲线、融解曲线、绝对定量、相对定量、,-Ct,、双标准曲线法,8.,SYBR Green,法和,TaqMan,法,9.Q2:Ct,值出现过晚（,Ct,38,）、阴性对照也出现明显的起飞、熔解曲线不止一个主峰的原因。,10.TouchDown PCR,是什么。,11,假阴性、非特异性扩增、拖尾、假阳性和引物二聚体出现的原因是什么，如何改进。,12.COI,、,ITS,、,IGS,指的是，有什么价值,第,4,节,核酸杂交技术,核酸杂交技术,核酸杂交,（,hybridization,）是两条互补的核苷酸单链在特定的条件下退火形成异质双链的过程。核酸杂交技术是建立在以碱基互补为基础的、以双链核酸分子在特定条件下的变性和复性为手段的，对核酸分子进行定性和定量检测的技术。,核酸杂交既可以是,DNA,与,DNA,链、,RNA,与,RNA,链之间的杂交，又可以是,DNA,与,RNA,链之间的杂交。,核酸杂交可进行染色体图谱分析，测定特异,DNA,序列的拷贝数（甚至可检测到哺乳动物基因组中的单拷贝基因），鉴定与疾病有关的限制性片段长度多态性标记，进行基因克隆的筛选，检测不同浓度的,DNA,，鉴别特异基因的表达部位，,核酸探针,含有标记物的与待检测核酸片段具有高度同源性的特定核酸片段，可以对待检测核酸进行定性、定量和定位的工具。,根据核酸探针分子性质的不同可分为,DNA,探针和,RNA,探针；,根据核酸探针来源的不同又分为基因组,DNA,探针、人工合成的寡核苷酸探针和,cDNA,探针。,探针的标记,放射性标记物,32,P,、,3,H,、,35,S,、,14,C,、,125,I,、或,131,I,非放射性标记物,地高辛,(Digoxigenin,Dig),；,荧光素,(fluorecein),标记，如罗丹明或,FITC,；,生物素,；,Southern blot,Northern blot,斑点杂交,斑点杂交是分子杂交中最简单的一种，直接将,DNA,或,RNA,分子以斑点的形式固定在滤膜上，然后进行分子杂交。,当核酸分子的斑点面积变得更小，在单位面积滤膜上处理的样品数量就更多，当检测的灵敏度进一步提高后，就发展成,DNA,芯片。,基因芯片（,Gene Chip,）通常指,DNA,芯片，其基本原理是将指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。基因芯片的概念现已泛化到生物芯片（,biochip,）、微阵列（,Microarray,）、,DNA,芯片（,DNA chip,），甚至蛋白芯片。,基因芯片集成了探针固相原位合成技术、照相平板印刷技术、高分子合成技术、精密控制技术和激光共聚焦显微技术，使得合成、固定高密度的数以万计的探针分子以及对杂交信号进行实时、灵敏、准确的检测分析变得切实可行。,开发基因芯片的公司主要有：,Affymetrix,，,Nanogen,，,BioRobotics,，,Caliper,等。,基因芯片发展历史,Southern&,Northern Blot,Dot,Blot,Macroarray,Microarray,应用领域,一、科研领域,基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等方面。,二、生物制药领域,筛选新药等,三、诊断,病原体诊断，如细菌和病毒鉴定、耐药基因的鉴定