第六章-酶工程制药.ppt

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,酶工程制药,第 六 章,定义,：指由活细胞合成的对其特异底物起高效催化作用的蛋白质，是机体内催化各种代谢反应最主要的催化剂。,自然界中约有,25000,种酶，已被认可的约有,300,种。酶工程是生物技术的重要内容和组成部分。近年来，由于酶在工业、农业、食品和制药业中的运用迅速发展，酶工程的也增加了许多内容，其在生物技术领域中的重要性也得到加强,。,酶的概念,二 酶催化特性,1,酶促反应具有极高的效率,：,酶能比一般催化剂更有效地降低反应的活化能，使底物只需较少的能量便能地入活化状态。同一反应，酶催化反应的速度比一般催化剂催化的反应速度高,10,7,10,13,倍。,2,酶促反应具有高度特异性（专一性）：,酶对其所作用的底物有严格的选择性。一种酶只作用于某一类或某一种特定的物质。例如，蛋白酶只能催化蛋白质的水解，淀粉酶只能催化淀粉的水解，酯酶只能催化酯类的水解。,3,3,作用条件温和（酶易失活）,酶是蛋白质，对环境条件极为敏感，凡能使蛋白质变性的物理或化学的因素都能使酶丧失活性；酶也常因温度、,PH,等的轻微改变或抑制剂的存在使其活性发生变化。酶作用一般要求比较温和的条件，如常温、常压、接近中性的,PH,值等。,4,酶活力的可调节性：,酶促反应受多种因素的调控，以适应机体不断变化的内外环境和生命活动的需要。,5,有些酶的活力与辅助因子有关,有些酶是结合蛋白，其中的小分子物质（辅酶、辅基及金属离子）与酶催化活性密切相关，若将它们除去，酶就失去其催化活性。,4,酶催化和非酶催化的共同之处,：,1,、降低反应所需的活化能,2,、加快反应速度，,3,、不改变化学平衡,5,酶的催化过程,6,酶的专一性,酶的底物专一性可以分为以下几种类型。,（一）、绝对专一性,酶的绝对专一性（,absolute specificity,）是最普通的特异性，它表现在许多酶只能催化一种底物，进行一种化学反应。,例如，脲酶只能作用于尿素，催化其水解产生氨及二氧化碳。而对尿素的各种衍生物一概不起作用。,7,（二）、相对专一性,有的酶对底物的要求比上述绝对专一性略低一些，它的作用对象不只是一种底物，这种专一性称为相对专一性（,relative specificity,）。,（三）、立体异构专一性,是指酶只能催化一种立体异构体发生某种化学变化，而对另一种立体异构体则无作用。,8,酶的分子组成,1,、单纯酶：,仅由氨基酸组成。,2,、结合酶：,包括两部分，即蛋白质部分和非蛋白质部分（辅助因子）。,结合酶两部分结合在一起形成的复合物称全酶，只有全酶才有催化作用。蛋白质部分称为酶蛋白，决定反应的特异性。非蛋白质部分多为小分子有机化合物或金属离子，决定反应的种类与性质。辅助因子又分两种：辅基和辅酶。,全酶,=,酶蛋白,+,辅助因子,9,酶的命名与分类,原则：,根据酶所用的底物来命名,Ribonuclease,Protease,根据所催化的反应来命名,Dehydrogenase,Phosphotransferase,Aminotransferase,上述两个原则结合,上述原则再加上酶的来源,牛胰核糖核酸酶,10,（一）国际系统分类法,氧化还原酶类,AH,2,+B A+BH,2,转移酶类,AR+B A+BR,水解酶类,催化水解反应。,裂合酶类,催化底物,C-C,，,C-O,，,C-N,及其它键的断裂并形成双键的非水解性反应。,异构酶类,催化各种同分异构体的相互转变。,合成酶类,A+B+ATP AB+AMP+PPi,A+B+ATP AB+ADP+Pi,11,分类,酶类,氧化还原酶类,转移酶类,水解酶类,裂解酶,异构酶类,合成酶类,催化的反应,氧化还原反应,转移功能基团,水解反应,裂解基团,异构反应,在高能磷酸键裂解同时形成新的键,12,（二）系统命名法,1,、若酶反应中有两种底物起反应，则这两种底物均需表明，当中用,“,：,”,分开。,例如，催化,ATP+,葡萄糖,6-,磷酸葡萄糖,+ADP,的酶，其系统命名为,ATP,：葡萄糖磷酸基转移酶。,ATP:Creatine Phosphotransferase,ATP:,肌酸 磷酰基转移酶,Glutamate:Pyruvate aminotransferase,谷氨酸：丙酮酸,(GPT),氨基转移酶,若底物之一是水时，可将水略去不写。,13,2,单体酶（,monomeric enzyme,）：,指只有一条多肽链的酶。属于这一类的酶较少，且一般都是催化水解反应的酶。如：木瓜酶、溶菌酶、核糖核酸酶、胰蛋白酶、羧肽酶等。,3,寡聚酶（,oligomeric enzyme,）：,由两个或两个以上亚基组成的酶称为寡聚酶。亚基间以非共价键结合，彼此易于分离。亚基可以是相同的多肽链，也可以是不同的多肽链。如磷酸化酶,a,、,3-,磷酸甘油脱氢酶。,14,4,、多酶复合体（,multienzyme complex,）：,多酶复合体又命多酶体系，是由几种功能相关的酶嵌合形成的复合体。它有利于一系列反应的连续进行，以提高酶的催化效率，同时便于机体对酶的调控。相对分子量都很高，一般都在几百万以上。,15,酶工程的概念,酶工程（,Enzyme Engineering,）,是酶学和工程学相互渗透发展而成的一门新的技术科学，它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化功能并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。,16,酶工程的研究内容,酶的分离、纯化、生产和开发,酶和细胞的固定化,酶反应器,用基因工程技术改造酶,酶的结构、功能和化学修饰,酶的抑制剂和激活剂,抗体酶、核酶,模拟酶和酶分子的人工设计、合成,17,酶工程制药,概念：,利用酶的催化性质、动力学性质、可固定化性质生产一种药物或药物中间体的技术。,18,酶工程在制药业中的应用,手性药物的合成和拆分,药物的改造,简化药物生产过程,酶制剂可直接作为药物（疾病诊断、疾病治疗、药物生产等方面）。,19,手性,（,chirality,）是三维物体的基本属性。如果一个物体不能与其镜像重合，该物体就称为手性物体。,手性药物,（,chiral drug,）是指其分子立体结构和它的镜像彼此不能够重合，互为镜像关系而不能重合的一对药物结构称为对映体，对映体各有不同的旋光方向（左旋、右旋、外消旋）。,具有手性的药物，它的两个对映体在体内以不同的途径被吸收、活化或降解。在体内的药理活性、代谢过程及毒性存在着显著的差异。,20,在药学上，服用对映纯药物可减少剂量和代谢负担，提高剂量的幅度，并拓宽其用途，对药物的药物动力学及剂量能更好地控制。,手性药物是当前国际新药研究的热点,，包括不对称合成技术和手性拆分技术的手性技术。,21,2001,年,诺贝尔化学奖,授予美国科学家威廉,诺尔斯、日本科学家野依良治和美国科学家巴里,夏普雷斯，表彰他们在不对称合成方面所取得的成绩。,他们使用一种对映体试剂或催化剂，把分子中没有作用的一部分剔除，只利用有效用的一部分，就像分开人的左右手一样，分开左旋和右旋体，再把有效的对映体作为新的药物，这称作,不对称合成。,22,结构不同的分子，化学性质也不同,。比如，左手性的薄荷脑具有独特的香味，而右手性的薄荷脑则几乎没有这种香味。,“味精”的主要成分谷氨酸钠存在手性，味精用的是左手性的，右手性的就没有什么鲜味。,具有手性的药物，两个对映体的药理及毒性存在着显著的差异，比如可能左旋分子能治这个病，而右旋分子能治那个病。比如，左旋分子可以治病，右旋分子不能治病而且还有毒性。,23,许多化合物的结构都是对映性的，好像人的左右手一样，这被称作手性。,药物中也存在这种特性,，在有些药物成份里只有一部分有治疗作用，而另一部分没有药效甚至有毒副作用。这些药是消旋体，它的左旋与右旋共生在同一分子结构中。人们认识到将消旋体药物拆分的重要性。,24,历史上沉痛的酞胺哌啶酮（,Thalidomide,又名反应停）导致孕妇生产畸形婴儿的事件，就是典型的手性药物。,确切地说，是混有左右两种手性的分子的外消旋体药物的,两面性,的体现：酞胺哌啶酮的“,R-,对映体”是一种有效的镇痛剂，但其“,S-,对映体”则是致使胎儿畸形的罪魁。,25,酶工程制药的成功实例,6-,氨基青霉烷酸（,6-Aminopenicillanic Acid,6-APA,）的生产。,青霉素,G,（或,V,）经青霉素酰化酶作用，水解除去侧链后的产物称为,6-,氨基青霉烷酸,(6-APA),也称无侧链青霉素。,6-APA,是生产半合成青霉素的最基本原料。,26,1932,年由,Fleming,首次发现,占据全世界,19%,的抗生素市场,作用机理是抑制细菌细胞壁的形成,具有广谱抗菌作用,低毒,杀菌作用强,是一种酸性物质，性质不稳定,大量长期普遍使用使致病菌对青霉素具有耐药性,青霉素,27,6-APA,由青霉素酰化酶水解除去侧链后而成，是生产半合抗青霉素类抗生素氨苄钠和阿莫西林的重要中间体。,修饰或改变青霉素分子中的苯乙酰基可克服细菌对青霉素的耐药性。,目前临床以,6-APA,为原料已合成近,3,万种衍生物，筛选出数十种耐酸、低毒及具有广谱抗菌作用的半合成青霉素，对,6-APA,的需求量约为,25800,吨年。,6-APA,28,产率低,用到有毒化合物,反应条件苛刻,设备复杂,生产,6-APA,的化学方法,29,固定化细胞法产,6-APA,大肠杆菌斜面,培养细胞,固定化细胞,转化青霉素,G,(,或,V),转化液过滤,滤液抽提,6-APA.,按照青霉素,G,计算，回收率为,70%-80%,。,30,设备简单,操作简单,产率高,成本低,无环境污染,生产,6-APA,的酶法,31,酶的来源,来源于动植物组织,来源于动植物细胞培养,来源于微生物,基因工程重组酶,32,利用微生物产酶的,优点,：,1,、微生物种类繁多，酶品种齐全。,2,、微生物生长繁殖快，生产周期短，产量高。,3,、培养方法简单，原料来源丰富，价格低廉。,4,、微生物有较强的适应性和应变能力，可培育出新的高产菌株。,33,酶的生产菌,对菌种的要求：,1,、繁殖快、酶产量高、最好产胞外酶的菌种。,2,、不是致病菌，系统发育与病原体无关，不产生有毒物质。,3,、产酶稳定性好，不易变异退化、不易感染噬菌体。,4,、能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。,生产菌的来源：,筛选和遗传改良。,菌样采集、菌种分离初筛、纯化、复筛、生产性能鉴定。,34,常用的产酶微生物,大肠杆菌,枯草杆菌,啤酒酵母,曲酶,青霉菌,木霉菌,根霉菌,链霉菌,35,酶制剂的提取,细胞膜的破碎,研磨器、匀浆器、捣碎机、超声波、溶菌酶、甲苯、去氧胆酸钠,抽提,抽提液离子强度调节剂,PH,缓冲液温度效应剂蛋白酶抑制剂抗氧化剂重金属络合剂增溶剂,36,酶的分离纯化,盐析（,salting out,）,离心（,centrifugal separation,）,凝胶过滤（,gel filtration,）,电泳分离（,electrophoresis separation,）,离子交换层析（,ion exchange chromatography,）,亲和层析（,affinity chromatography,）,亲和超滤（,affinity ultrafiltration,）,37,两种不同的酶反应体系,均相混合体系,异质两相混合体系,38,什么是固定化酶？,水溶性酶,水不溶性载体,水不溶性酶,（固定化酶）,固定化技术,39,固定化酶的概念,所谓,固定化酶,，是指限制或固定于特定于特定空间位置的酶。具体来说是指经物理或化学方法处理，是酶变成不易随水流失既运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。,限制或固定于特定空间位置的酶，即经物理或化学方法处理后，,酶不易流失，而催化作用不变,。,40,化学偶联,酶,固定化,间歇,可溶,交联,包埋,吸附,间歇,连续,酶的固定化技术和固定化酶,41,固定化酶的优点,稳定性提高，可多次使用,反应后，产物易纯化、质量高,反应条件易于控制,酶的利用率提高,比水溶性酶更适合多酶反应,缺点：,固定化过程中往往会引起酶的失活,42,酶的固定化方法,酶或细胞固定方法,载体结合法,物理吸附,离子结合,共价结合,交联法,包埋法,胶格型,微囊型,脂质体,43,固定化酶的方法,（一）微型胶囊法,将酶或细胞包埋在高分子半透膜中的称为微囊型。,44,优点：,由包埋法制的的微囊型固定化酶通常为直径几微米到几百微米的球状体，其表面积与体积比很大，包埋没量多，比较有利与底物与产物的扩散。,缺点：,反应条件要求高，制备成本也高。,45,分离相,酶,硝酸纤维素,D,半乳糖苷酶,天门冬酰胺酶,火棉胶醇脱氢酶,苹果酸脱氢酶,丙酮酸激酶,脲酶,界面聚合法尼龙,液膜法聚脲,液体干燥法乙基纤维素,聚苯乙烯,46,（二）吸附法,物理吸附法,通过物理吸附作用将酶吸附于不溶性载体上的方法。,静止法,电沉积法,反应器上直接吸附法,混合浴或振荡浴吸附法,47,优点：,固定化时酶分子的构象很少或基本不发生变化。,缺点：,结合力弱，易解吸附。,载体：,纤维素、琼脂糖、活性炭、沸石及硅胶等。,离子结合法,酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体上的固定方法。,第一个离子结合法固定化酶：,固定化过氧化氢酶,第一个工业化的固定化酶：,固定化氨基酰化酶,载体：多糖类离子交换剂、高分子离子交换树脂,49,离子结合法中离子交换剂的结合蛋白质能力较强，常常被采用。,优点：,操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活回收率较高的固定化酶。,缺点：,载体和酶的结合力较弱，容易受缓冲液种类或,pH,的影响，离子强度高时，酶往往从载体上脱落。,50,（三）胶格包埋法,被采用的胶格包埋法是：,固定化胰蛋白酶,木瓜蛋白酶,淀粉酶,将聚合物的单体和酶溶液混合后，再借助聚合促进剂的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中的固定方法。,51,（四）共价交联法,利用双功能或多功能试剂在酶分子之间或微生物细胞间或酶分子和载体之间进行交联反应以共价键制备固定化酶的方法。,交联剂：最常用是戊二醛,优缺点：,一般用交联法得到的固定化酶颗粒小、结构性能差、酶活性低，常常与吸附法或包埋法联合使用。,52,图,7,11,酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联,酶分子；（,a,）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（,b,）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶,53,表,7,2,常用于固定化酶的交联剂,交联剂 参考文献,戊二醛,13,16,二重氮联苯胺,2,，,2,二磺酸,17,，,18,4,，,4,二氟,3,，,3,二硝基二苯砜,19,二苯基,4,，,4,二硫氰酸,2,，,2,二磺酸,20,1,，,5,二氟,2,，,4,二硝基苯,21,酚,2,，,4,二磺酰氯,22,3,甲氧基二苯基甲烷,4,，,4,二异氰酸盐,23,54,（五）共价结合法,55,共价结合法,酶以共价键结合于水不溶性载体上的固定方法。,载体：结构疏松、表面积大、有较高的机械强度、具有在温和条件下可与酶的侧链基团进行共价偶联反应。,优点：,酶与载体结合牢固，稳定性好，不易脱落。,缺点：,反应条件苛刻，操作复杂，酶蛋白高级结构易变化，固定化酶易失活。,56,固定化酶的性质,1,、酶活力的变化（固定化后大多会下降）,2,、酶稳定性的变化,操作稳定性,保存稳定性,热稳定性,对蛋白酶的稳定性,57,3,、酶学特性的变化,底物专一性,最适,Ph,最适温度,米氏常数,最大反应速度,58,固定化酶的形状,1,、颗粒状固定化酶：,酶珠、酶块、酶片和酶粉。制作方法简单，颗粒比表面积大，转化效率高，适用各种类型的反应器。,2,、纤维状,固定化酶,三醋酸纤维素。比表面积大，转化效率高，适用填充床反应器。,3,、膜状,固定化酶,酶膜的表面积大，渗透阻力小，可用酶电极。,4,、管状,固定化酶,可用连续测定，酶管机械强度大，可用填充床反应器,59,固定化酶的反应器,间隙式搅拌罐反应器,连续流动搅拌罐反应器,填充床反应器,流化床反应器,循环反应器,连续流动搅拌罐超滤反应器,60,固定化酶的反应器,间隙搅拌罐反应器,连续流动搅拌罐反应器,填充床反应器,流化床反应器,61,固定化细胞,定义：将细胞限制或固定于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。,固定化细胞既有细胞的特征，也有生物催化的功能，又有固相催化剂的特点。,62,固定化细胞的优点,无需进行酶的分离纯化。,酶在细胞中保持原始状态，回收率高。,细胞内酶比固定化酶稳定性更高。,细胞内酶的辅因子可自动再生。,细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应。,抗污染能力强。,63,固定化细胞的缺点,1,、细胞内多酶的存在，形成不需要的副产物。,2,、细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制。,3,、载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性。,64,细胞固定化的方法,载体结合法,交联法,包埋法,无载体法,65,固定化方法的选择依据,1,、固定化方法的选择,固定化酶应用的安全性,固定化酶在操作中的稳定性,固定化的成本,2,、载体的选择,最好选廉价的材料为载体，如聚乙烯醇、卡拉胶及海藻胶等等。,66,用固定化细胞生产,6-APA,大肠杆菌培养,大肠杆菌固定化,置于填充床反应器,加入青霉素反应液,纯化,6-APA,67,基因工程酶,酶基因的克隆和表达,酶基因的遗传修饰,自然突变,实验分子进化,酶的遗传设计,68,酶基因的遗传修饰,低活性,选择性差,稳定性差,高活性,选择性提高,稳定性提高,野生型酶,底物,结构和功能的关系,突变基因库,筛选,酶的遗传设计,酶的功能和结构研究,实验分子进化,（随机突变,）,Substrat,基因工程酶,底物,69,实验分子进化,自然突变的局限性,增加了突变率,又叫分子育种体外定向进化,要经过选择和筛选,70,实验分子进化条件,所期望的功能应容易检测,所期望的功能应在生物学上是可行的,应能获得相当的突变体,筛选快速简单,71,实验分子进化的方法,体内方法：用化学诱变剂和物理诱变剂作用于活细胞，使其基因发生突变，再从各种突变体中筛选获得所需的突变体,体外方法,PCR,突变：利用,Taqase,复制时的错配特性,DNA,洗牌技术,72,PCR,突变,extension,DNA,denaturation,denaturation,n cycles,73,StEP,STEP(STandard Exchange of Product data model),标准是国际标准化组织制定的描述整个产品生命周期内产品信息的标准，它提供了一种不依赖具体系统的中性机制，旨在实现产品数据的交换和共享。这种描述的性质使得它不仅适合于交换文件，也适合于作为执行和分享产品数据库和存档的基础。发达国家已经把,STEP,标准推向了工业应用。它的应用显著降低了产品生命周期内的信息交换成本，提高了产品研发效率，成为制造业进行国际合作、参与国际竞争的重要基础标准。,StEP,：,Staggered Extension Process,，交错延伸。在一个反应体系中加入两个或两个以上的亲本,DNA,作为模板。根据每一个亲本,DNA,序列设计一条引物。加入这些引物，延伸时间予以控制。,74,StEP,Primer annealing,DNA,DNA,denaturation,extension,denaturation,75,StEP,annealing,extension,n cycles,76,DNA,洗牌技术,又称体外同源重组技术。,将来源不同但功能相同的一组同源基因，用核酸酶,消化成随机片段，由这些随机片段组成一个文库，使之互为引物和模板进行,PCR,扩增，当一个基因拷贝片段作为另一基因拷贝的引物时，引起模板互换，重组因而发生，导入体内后，选择正突变体作为新一轮的体外重组。,77,DNA,洗牌技术,primers,78,Denature&anneal,5,5,*,*,*,5,5,*,*,5,5,*,*,5 3,3 5,*,*,fill in&amplify,*,*,DNAse,I,DNAse,I,DNA,洗牌技术,79,DNA,洗牌技术,Homo-duplex formation,5 3,3 5,5 3,3 5,5 3,3 5,Hetero-duplex formation,5 3,3 5,PCR PCR,Resembles synthesis of,synthetic gene,(Directed Mutagenesis),Resembles synthesis of,gene fusions,(Directed Mutagenesis),80,谢谢！,81,