三氯乙烯对鼠伤寒沙门氏菌的致突变实验.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,三氯乙烯对鼠伤寒沙门氏菌的致突变试验,一、实验目的,1,、掌握,Ames,试验的基本原理及应用,2,、了解,Ames,试验的基本步骤,3,、通过该实验，了解三氯乙烯的致突变作用,二、实验原理,原理：是一种利用微生物进行基因突变的体外致突变试验方法。基本原理是利用同一种微生物的,营养缺陷型突变型菌株,与受试物接触，若此化学物质具有,致突变性,，可使突变型微生物再发生一次突变，重新成为野生型微生物。这种突变叫做,回复突变,。,鼠伤寒沙门氏菌（,Salmonella typhimurium,）的组氨酸营养缺陷型（,his-,）菌株，在含微量组氨酸的培养基中，除极少数自发回复突变的细胞外，一般只能分裂几次，形成在显微镜下才能见到的微菌落。受诱变剂作用后，大量细胞发生回复突变，自行合成组氨酸，发育成肉眼可见的菌落。,某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变，故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备的,S9,混合液。,鉴于化学物质的致突变作用与致癌作用之间密切相关，故此法现广泛应用于致癌物的筛选。,鼠伤寒沙门氏菌,野生型（,his,）,鼠伤寒沙门氏菌,突变型（,his,）,正向突变,回复突变,受试物,试验菌种,(his,-,),S,9,试验菌种,(his,-,),S,9,Ames,试验原理,三氯乙烯,(Trichloroethylene,，,TCE),是一种常用的有机溶剂，主要用作金属的脱脂剂和脂肪、油、石蜡等的萃取剂，也用于干洗毛织品和衣服。近年来，三氯乙烯职业性中毒时有发生。为了解三氯乙烯的致突变作用，开展了三氯乙烯对鼠伤寒沙门氏菌的回复突变试验。,三,.,实验材料,标准试验菌株,(,配套菌株,),：有四种,TA98,、,TA97,：检测移码突变,TA100,：检测碱基置换突变,TA102,：对醛、过氧化物及,DNA,交联剂较敏感,这四个试验菌株除了含有,his,-,突变，还有一些附加突变，以提高敏性,S,9,液,三氯乙烯,辅酶,-,6-,磷酸葡萄糖单钠盐,二甲基亚砜,(DMSO),四,.,实验步骤,1.,菌株鉴定,用于测试的菌株，需经基因型和生物学性状鉴定，符合要求才能投入使用。,2.,斑点实验,3.,平板掺入实验,4.,两法比较,1.,菌株鉴定,（,1,）组氨酸缺陷型的鉴定,（,3,）,紫外线损伤修复缺陷型的鉴定,（,2,）,脂多糖屏障缺陷的鉴定,（,5,）,自发回变率的测定,（,4,）,R,因子和四环素抗性的鉴定,(1).,组氨酸缺陷型的鉴定,组氨酸缺陷型的鉴定加热融化底层培养基两瓶,(,一瓶不加组氨酸，一瓶加组氨酸,),，不加组氨酸者每,100mL,底层培养基中加,0.5mg,分子,D,生物素,0.6mL,；加组氨酸者每,100mL,底层培养基中加,L,组氨酸,(,每,100mL,中含,0.4043g)1mL,和,0.5mg,分子,D,生物素,0.6mL,，冷却至,50,左右，各倒两个平皿。接种：取有组氨酸和无组氨酸培养基平皿各一个，按菌株号顺序各取一白金耳菌液划线,(,直线,),接种在培养基表面，,37,培养,48h,。结果：四株菌在有组氨酸培养基平皿表面各长出一条菌膜，无组氨酸培养基平皿上除自发回变菌落外无菌膜，说明受试菌株确为组氨酸缺陷型,。,(2).,脂多糖屏障缺陷的鉴定,加热融化营养肉汤琼脂培养基。接种：取菌液,0.1mL,移入平皿，迅速将营养肉汤琼脂培养基,(,冷却至,50,左右,),适量倒入平皿，混匀，平放凝固。将无菌滤纸片一片放入已凝固的培养基平皿中央，用移液器在滤纸片上滴加,0.1%,结晶紫溶液,(,鉴定菌株用,)10L,，,37,培养,24h,，每个菌做一个平皿。结果：阳性者在纸片周围出现一个透明的抑制带，说明存在,rfa(,深粗型,),突变。这种变化允许某些大分子物质进入细菌体内并抑制其生长。,TA97,、,TA98,、,TA100,和,TA102,均有抑制带，野生型鼠伤寒沙门氏菌没有抑制带。,(3).,紫外修复缺陷型的鉴定,在营养肉汤琼脂培养基平皿表面用接种环划线接种需要的菌株。接种后的平皿一半用黑纸覆盖，另一半在距,15W,紫外线灭菌灯,33Cm,处照射,8s,，,37,培养,24h,。结果：对紫外线敏感的三个菌株,(TA97,、,TA98,、,TA100),仅在没有照射过的一半生长，具有野生型切除修复酶的菌株,TA102,仍能生长,。,(4),自发回变率的测定,准备底层培养基平皿,8,个,.,融化顶层培养基,8,管，每管,2mL,，在,45,水浴中保温。在每管顶层培养基中，分别加入待鉴定的测试菌株的菌液,0.1mL,，一式二份，轻轻摇匀，迅速将此试管的内容物倾入已固化的底层培养基平皿中，转动平皿，使顶层培养基均匀分布，平放固化，,37,培养,48h,计数菌落数。结果：每一株的自发回变率应落在正常范围内。,2,斑点试验,吸取测试菌增菌培养后的菌液,0.1ml,，注入融化并保温,45,左右的上层软琼脂中，需,S,9,活化的再加,0.3ml,0.4mlS,9,mix,，立即混匀，倾于底平板上，铺平冷凝。用灭菌尖头镊子夹灭菌圆滤纸片边缘，纸片浸湿受试物溶液，或直接取固态受试物，贴放于上层培养基的表面。同时做溶剂对照和阳性对照，分别贴放于平板上相应位置。平皿倒置于,37,温箱培养,48h,。在纸片外围长出密集菌落圈，为阳性；菌落散布，密度与自发回变相似，为阴性。,3,平板掺入试验,将一定量样液和,0.1ml,测试菌液均加入上层软琼脂中，需代谢活化的再加,0.3ml,0.4ml S,9,mix,，混匀后迅速倾于底平板上铺平冷凝。同时做阴性和阳性对照，每种处理做,3,个平行。试样通常设,4,5,个剂量。选择剂量范围开始应大些，有阳性或可疑阳性结果时，再在较窄的剂量范围内确定剂量反应关系。培养同上。同一剂量各皿回变菌落均数与各阴性对照皿自发回变菌落均数之比，为致变比（,MR,）。,MR,值,2,，且有剂量,-,反应关系，背景正常，则判为致突变阳性。,4.,两法比较,斑点实验,平板掺入实验,定量测试样品致突变性的强弱,较斑点实验敏感，获阳性结果所需的剂量较低,限于能在琼脂上扩散的化学物质,敏感性较差,定性实验,四,.,实验结果,TA102,组别,剂量,(mg/,皿,),TA97,-(S9)+(S9),TA98,-(S9)+(S9),TA100,-(S9)+(S9),-(S9)+(S9),受试物,自发回变,溶剂对照,阳性物对照,五,.,讨论,菌株,TA100,的菌落数均比空白对照菌落数增加一倍以上，且随三氯乙烯剂量的增加，,TA100,的菌落数也相应增加,三氯乙烯能导致菌株,TA100,的突变,(,碱基对置换,),，说明三氯乙烯是一种致突变剂。,S,9,存在的情况下导致鼠伤寒沙门氏菌菌株,TA100,数量增加的数量比,S,9,不存在情况下多,.,三氯乙烯的致突变作用可能部分是由于三氯乙烯经过代谢成中间活性产物而起作用。,不论是否加,S,9,，菌株,TA97,、,TA98,、,TA102,的菌落数不但未能比空白对照组的菌落数增加,1,倍以上，反而比空白对照组的菌落数少,可能与三氯乙烯具有杀菌作用有关，同时也说明三氯乙烯在本实验所设计的剂量的条件下，未能引起移码型突变,。,材料和方法,结果,讨论,三氯乙烯是能导致菌株,TA100,发生突变的致突变剂,(,碱基对置换,),。三氯乙烯的致突变作用可能部分是由于三氯乙烯经过代谢成中间活性产物而起作用。,结论,六、作 业,自主设计一个试验，利用,Ames,试验方法检测某种物质的致突变性。,可查阅相关文献。,试验报告,试验报告应包括以下内容：,（,1,）受试物名称、理化性状、配制方法、使用溶剂；,（,2,）试验菌株：所用试验菌株；,（,3,）代谢活化系统：所用诱导剂；,（,4,）试验方法：简述操作步骤，除受试物剂量分组外，还应说明空白对照、溶剂对照和阳性对照，阳性结果判定标准；,（,5,）结果：以列表方式报告受试物的,Ames,实验结果（表,1,）；,（,6,）结论。,证明,Ames,试验重要性的应用实例：,国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停”，由于其药效显著，在,60-70,年代十分流行，但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高，而且生产畸形儿的妇女大多曾服用“反应停”，后来采用,Ames,试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行,Ames,试验检测，那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免。,Ames,实验室无菌操作,吸入染毒试验装置（液气,）,吸入染毒试验装置（粉尘,),）,动物饲养装置,鼠伤寒沙门氏菌,/,哺乳动物微粒体酶实验（,Ames,实验）,目的,:,为了 研究 复方生物黄酮（圣安泰牌百力康片）的潜在致突变性。方法 我们对该产品进行了,Ames,实验,结果,:,为阴性，均未见毒性改变。,结论,:,复方生物黄酮在服用剂量内未见致突变性。,1,材料与方法,1.1,样品 复方生物黄酮的商品名称为圣安泰牌百力康片，由哈尔滨圣安泰生物 科技 有限公司提供。样品以枸杞、黄芪、银杏叶为主要原料，辅以其他辅料制成，功效成分为总黄酮。,1.2,材料 昆明种小白鼠（批准证号：医动字第,09-2-7,号），购自黑龙江省肿瘤研究所实验动物中心。,TA97a,、,TA98,、,TA100,和,TA102,四种菌株引自美国加州大学,Ames,实验室。,1.3,方法,TA97a,、,TA98,、,TA100,和,TA102,四种菌株引自美国加州大学,Ames,实验室。经菌株特性鉴定均符合实验要求。活化系统为,PCB-,五氯诱导的雄性,Wistar,大鼠肝,s-9,液。按,1,：,9,加入辅助因子（,Ames,1983,年配方）配成,10,s-9,混合液，经阳性诱变剂活性鉴定符合实验要求。实验样品经,XAD-11,树脂柱过滤及洗脱预处理，最后以,DMSO,为溶剂，剂量设计分别为,5mg/,皿、,1mg/,皿、,0.2mg/,皿、,0.04mg/,皿和,0.008mg/,皿受试物。除上述,5,个剂量组外，又设未处理对照组、溶剂对照组（,DMSO,）和阳性对照组加,s-9,用,2-AF,（,TA102,用,1,，,8-,二羟蒽醌），不加,s-9,用,DEXON,（,TA100,用叠氮钠）。采用平板渗入法进行实验。在保温的顶层培养基中依次加入测试菌株新鲜增菌液,0.1ml,，混匀；加受试物或对照物,0.1ml,需活化时加入,10,s-9,混合液,0.5ml,（含,s-9,5l,），论文联盟整理再混匀，迅速倾入底层培养基上，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上，平放固化，,37,培养,48h,观察结果。每个剂量平行做了,3,皿，并重复一次，最后以,3,皿平均值报告实验结果,.,2,结果,表,1,圣安泰牌百力康片第一次,Ames,实验结果,(xs),注：以上结果为,3,皿回变菌落数的平均值,表,2,圣安泰牌百力康片第二次,Ames,实验结果 （,xs,）,注：以上结果为,3,皿回变菌落数的平均值,结论,受检样品对,Ames,各实验菌株在加与不加活化系统条件下均呈阴性结果，即鼠伤寒沙门氏菌,/,哺乳动物微粒体酶实验为突变阴性结果。,昆明种小白鼠，体重,25,30g,，共,50,只，在本实验室适应环境,7,天后，随机分成,5,组，每组,10,只，雌雄各半。,高剂量组剂量为,10g/kg bw,；中剂量组为,5g/kg Bw,；低剂量组为,2.5g/kg bw,。,阴性对照组经口灌胃蒸馏水；阳性对照组灌胃给予环磷酰胺，剂量为,40.0mg/kg bw,。按,20ml/kg bw,灌胃容积进行灌胃。,采用,30h,给受试物法，即二次给受试物间隔,24h,，第二次给受试物后,6h,颈椎脱臼处死小鼠，取股骨，常规制片。,显微镜双盲法阅片，每只小鼠观察,1000,个嗜多染红细胞（,PCE,），记录有微核的嗜多染红细胞数，计算 出微核率。每只动物计数,200,个嗜多染红细胞，观察嗜多染红细胞与成熟红细胞比值。,1.3.2,小鼠骨髓细胞微核实验,昆明种小白鼠,25,只，体重,25,30g,；随机分成,5,组，每组,5,只。,设,3,个剂量组，剂量设计同小鼠骨髓微核实验，即高剂量组为,10g/kg bw,，中剂量组为,5g/kg bw,，低剂量组为,2.5g/kg bw,。,阴性对照组给予蒸馏水，阳性对照组给予环磷酰胺，剂量为,40mg/kg bw,。所有各组均按,20ml/kg bw,容积灌胃，每日,1,次，连续,5,天。各组动物均于首次投入检样后,35,天处死。,按常规方法制片，固定，,2,伊红溶液染色，每只小鼠镜检,1000,个完整精子，计算畸形率。,1.3.3,小鼠精子畸形实验,