仪器分析-紫外可见光光谱分析.ppt

,*,College of Bioengineering,Jimei University,CHINA,1,第二章,紫外,可见分光光度法,2.1,引言,2.2,紫外可见吸收光谱,2.3,光吸收定律,Lambert-Beer,定律,2.4,紫外可见分光光度计,2.5,分析条件的选择,2.6 UV-Vis,光度法的应用,2,光谱分析法,：利用物质与光（辐射能）相互作用而建立起来的定性、定量和结构分析方法,。,作用粒子：原子光谱法,分子光谱法和核磁共振波谱法,吸收和发射光：,吸收光谱和发射光谱,光的能量：,射线光谱法、,x,射线光谱法、,紫外可见光谱法、红外光谱法,等,分,类,2.1,引言,3,紫外可见分光光度法,定义：（又称：紫外可见吸收光谱法）是根据溶液中物质的分子或离子对紫外可见光谱区的辐射能的吸收来研究物质的组成和结构的方法。,较高的灵敏度和准确度，检出限可达10,-7,g/ml，,相对误差通常为1%5%。,该方法仪器设备简单、操作方便、易于掌握和推广，是常用分析方法之一,。,4,光是一种电磁波,整个电磁波包括：,无线电波,微波,红外光,可见光,紫外光,X,射线,射线,共同特点：横向电磁波，在真空中的传播速度等于光速，即,5,光具有波粒二象性，即波动性和粒子性。,波动性：折射、衍射、偏振及干涉等性质。,粒子性：具有动量，光电效应。,光的特性,6,光子的能量与波长的关系（反比）,能量,J,或,eV,Planck,常数,6.62610,-34,J,s,频率，,Hz,光速,2.998 10,8,m/s,波长,nm,1,eV=1.602,10,-19,J,96.55kJ/mol,9,2.2,紫外可见吸收光谱,一,.,吸收光谱的产生,分子内三种运动对应三种能级：,电子运动电子能级,(Electron energy level),原子之间的相对振动振动能级,(vibration),分子转动转动能级,(rotation),分子整体能级,E=Ee+Ev+Er,10,当有一频率,v,如果辐射能量,hv,恰好等于该分子较高能级与较低能级的能量差时，即有：,分子从基态能级跃迁到激发态能级,11,基态,激发态,12,E,电,=1-20eV,E,振,=0.05-1eV,E,转,=0.005-0.05eV,在分子能级跃迁所产生的能量变化，电子跃迁能量变化最大，它对应电磁辐射能量主要在区紫外,可见区。,用紫外,可见光照射分子时，会发生电子能级的跃迁，对应产生的光谱，称为电子光谱，通常称为,紫外,可见吸收光谱,。,13,电子能级跃迁伴随分子振动和转动能级的跃迁，因此得到光谱是带状光谱。,UV-Vis,是带状光谱？,14,二、物质的颜色与吸收光的关系,当一束白光通过棱镜后就色散成红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等颜色的光，它们具有不同的波长范围。反之，这些不同颜色的光按一定的强度比混合后便又形成白光。,15,将,两种适当颜色的光按一定的强度比例混合可形成白光，这两种光称为,互补色光,。,白光,红,650750,紫,400450,蓝,450480,绿蓝,480500,绿,500560,黄绿,560580,黄,580600,橙,600650,16,物质呈现的颜色与吸收光颜色是互补色关系。,若物质对白光中所有颜色的光全部吸收，它就呈现黑色。,若反射所有颜色的光则呈现白色,若透过所以颜色的光，则为无色,。,17,物质不同颜色是对光的选择性吸收,不同物质的分子组成和结构不同，,E,不同，,E,也不同。,M,h M*,。由于,E,h,，所以能级差决定,只能吸收特定波长的光。,人眼可以比作是定性分析可见光区分光光度计。,18,KMnO,4,溶液吸收525,nm,绿青色光,(,互补光的400,nm,附近的紫色光,),所以,KMnO,4,溶液呈紫红色。,例：,19,溶液颜色的深浅，决定于溶液吸收光的量，即取决于吸光物质浓度的高低。,如,CuSO,4,溶液的浓度愈高，对黄色光的吸收就愈多，表现为透过的蓝色光愈强，溶液的蓝色愈深。,因此，人眼可以通过比较溶液颜色的深浅来确定溶液中吸光物质的浓度大小。,20,三、吸收光谱,吸收光谱（,吸收曲线,）：,不同波长的单色光依次照射溶液，并测量在每一波长处对光的吸收程度的大小（吸光度），并以波长（,）为横坐标，,吸光度（,A）,为纵坐标作图，即可得一条吸光度随波长变化的曲线，。,它反映物质对各种不同波长光的吸收情况。,21,吸收峰,谷,肩峰,末端吸收,22,同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为,最大吸收波长,max,不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似,max,不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和,max,则不同。,吸收曲线的讨论：,23,吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质,定性分析的依据之一,(,分子内部能级分布状况,),。,不同浓度的同一种物质，在,max,处吸光度,A,的差异性可作为,物质定量分析的依据,。,在,max,处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以,测定最灵敏,。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。,24,a.,有机分子的轨道类型及跃迁类型,四,.,有机化合物的吸收光谱,25,能量,成键,成键,未成键,反键,反键,n,*,*,*,*,n,*,n,*,1.,*跃迁,键类型：饱和键。,特点：,1.,所需能量高,2.,吸收波长短,200nm,3.,不易检测,例子：甲烷125,nm，,乙烷135,nm,成键作用越强，反键轨道能量越高。,26,2.,*跃迁,键类型：碳碳双键、三键、共轭双键等,特点：吸收强度大,单个饱和键吸收波长,200nm,如,1,，,3-,丁二烯,210nm,能量,成键,成键,未成键,反键,反键,n,*,*,*,*,n,*,n,*,27,3.,n,*,跃迁,特点：,1.n,*,所需能量小,2.,吸收波长长,3.,吸收强度很小,(10,100),键类型：连有杂原子（,N、,S,、,P,、,O）,的,不饱和键,范围：醛、酮等,能量,成键,成键,未成键,反键,反键,n,*,*,*,*,n,*,n,*,28,4.,n,*跃迁,键类型：含杂原子（,N、S、P、O）,饱和键,一般杂原子电负性越大，,n,电子被束缚得越紧，跃迁所需的能量越大，吸收的波长越短，如,CH3Cl,为,173nm,，,CH3Br,为,204nm,，,CH3I,为,258nm,。,不大，为,100,300,能量,成键,成键,未成键,反键,反键,n,*,*,*,*,n,*,n,*,特点：,n,*所需能量在,200nm,接近。,小结,：,*,饱和键,所需能量最大,200nm,远紫外区,紫外,可见分光光度法溶剂，例己烷、环己烷 等,*,C=C,或共轭双键,所需能量适中,单双键,200nm,共轭双键常为紫外可见分光光度法研究对象，跃迁强度大，,110,4,n,*,C=X,(X=O/N/S/P),所需能量最小,200nm,近,紫外区,紫外可见研究对象，跃迁强度小，,10,5,超高灵敏；（,6,10,）,10,4,高灵敏；,0.01 mol,L,-1,分子或离子间平均距离缩小，其电子云或电荷分布相互影响，分子轨道能级之差发生变化，从而改变最大吸收波长光的吸收能力。,消除措施：浓度控制在上限以下。,正偏离,负偏离,55,a,非单色光,当,E,1,=E,2,时，,A=E,1,CL A,C,有线性关系。,设,1,是需要的光：当,E1,E2,时，测得的,A,值低，负误差；反之，产生正误差。且,E1,与,E2,越接近，误差越小,单色光越纯越好；一般使用灵敏度最大的吸收波长作为测定波长。,当,E,1,E,2,时,A,C,非线性，偏离比尔定律。,2.,仪器因素（光学因素）,56,b,杂散光,仪器中常含有与所需波长相差较大的光，一般样品不吸收，所以不干扰测定。,c,散射光和反射光,浑浊溶液产生散射和反射，不能用空白消除影响,(,被认为成吸光），,I,变小，但,I,0,不变。,A,变大，正误差。,d.,非平行光,通过吸收池的非平行光影响光程,L,，不同仪器测定,A,值不同的主要原因。,57,a.,吸光物质在溶液中发生化学变化引起的偏离,由于吸光物质变成了不同的存在形式,消除措施：控制适当的显色条件。,如酸度控制。,b.,配合物不稳定也会引起的偏离,有些显色配合物不稳定,发生解离（越稀）,。,消除措施：试液浓缩富集。,3.,化学因素,58,2.4,紫外,可见分光光度计,紫外可见分光光度计由上五部分组成。,对光源的要求,足够光强、稳定、连续辐射且强度随波长变化小,1.,钨灯和碘钨灯：,340,2500nm,，多用在可见光区。,2.,氢灯和氘灯,:160,375nm,，用于紫外光区。,59,单色器,单色器的用途就是把混合光变成单色光，由入射狭缝、准直镜、色散元件、聚焦元件和出口狭缝组成。常用的色散元件有棱镜和光栅。,棱镜 不同波长的光具有不同的折射率,光栅 光的衍射和干涉。其特点是：色散波长范围宽，分辨率高，色散率基本上不随波长改变而改变。现代仪器多用光栅作色散元件。,60,吸收池,absorption cell,比色皿,cuvette,玻璃吸收池：用于可见光区,石英吸收池：用于紫外区,1,）盛放参比的吸收池和盛放样品的吸收池应匹配，即有相同的厚度与透光性。,2,）吸收池的光学面应垂直于光束方向。,比色池,0.1,、,1.0,、,1.5,、,2.0cm,微量池,0.5mL,流动池,5,11uL,61,检测器,将光信号转变为电信号进行检测。,光电池（硒光电池）、光电管 和光电倍增管,信号处理与显示装置,放大信号并以适当的方式指示或记录。检流计、数字显示及微机（控制及数据的采集和处理）。,62,1.单波长分光光度计,a.,单光束,0.575,光源,单色器,吸收池,检测器,显示,优点：结构简单，操作方便；缺点：光源不稳定会影响测定。,721,、,751,、,724,、英国,SP500,型以及,Backman DU,8,型,63,差值,A,光源,单色器,吸收池,检测器,显示,光束分裂器,b.,双光束,特点：消除光源强度变化所引起的误差,国产,710,型、,730,型、,740,型都属于这类型。,64,S,为背景吸收,切光器,吸收池,光源,检测器,单色器,单色器,2.双波长分光度计,特点：可测多组份试样、混浊试样、而且可作成导数光谱、不需参比液、克服了电源不稳而产生的误差，灵敏度高。,国产,WFZ800-5,型、岛津,UV-260,型、,UV-265,型,65,分光光度计校正,仪器使用过一段时间后,波长,和,吸光度,出现漂移，要进行校正。,波长校正,镨玻璃或钬玻璃都有若干特征的吸收峰，可用来校正分光光度计的波长标尺，前者用于可见光区，后者则对紫外和可见光区都适用。,吸光度校正,可用,K2CrO4,标准溶液来校正吸光度标度。将,0.0400gK2CrO4,溶解于,1L,的,0.05mol,L,1KOH,溶液中，在,1cm,光程的吸收池中，在,25,时用不同波长测得的吸光度值（有表可对）,。,66,2.5,分析条件选择,一,.,仪器测量条件选择,测量波长的选择,a.,选择最强吸收带的最大吸收波长,max,b.,如果,max,处有干扰，应选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。,67,2.,吸光度范围选择,最佳吸光度范围,0.2,0.7(T,为,65,20,),(,，,68,二、反应条件选择,1.,显色剂选择原则,显色剂与待测离子生成配合物组成恒定、稳定性好、吸收能力强，即,大、显色剂与配合物的吸收波长有明显的差别，一般要求,60nm,。,2.,显色剂用量,形成逐级配合物时，显色剂的用量关系较大，一般就需过量较多或必须严格控制用量。,3.,溶液酸度（配位数和水解等与,pH,相关）。,4.,显色时间、温度、放置时间,69,参比溶液的选择,why,使用参比溶液,只有使用参比溶液，才能真正反映待测溶液的吸光度值。,1.,溶剂参比,当组成简单，共存组分很少，显色剂没有吸收时，,可消除溶剂、吸收池等因素的影响。,2.,试剂参比,如果显色剂或其他试剂在测定波长有吸收，按显色反应,同的条件，只是不加入试样溶液。,消除,显,色剂,的吸收影响。,70,3.,试样参比,如果试样基体（除被测组分外的其它共存组分）在测定波长处有吸收，而与显色剂不起显色反应时可按与显色反应相同的条件处理试样，只是不加显色剂，作为参比溶液。这种参比溶液适用于试样中有较多的共存组分，加入的显色剂量不大，且显色剂在测定波长无吸收的情况。,4.,平行操作溶液参比,用不含被测组分的试样，在相同条件下与被测试样同样进行处理，由此得到平行操作参比溶液干扰及消除方法。,71,小结：,参比溶液选择原则：,凡是有色的溶剂或显色剂或基底液，应尽量消除对测定配合物的吸收影响。当作为参比溶液时，可扣除这种影响。,如果仍有干扰，则可采取下列方式：,72,1.,控制酸度,例双硫腙能与,Hg2+,、,Pb2+,、,Cu2+,、,Ni2+,、,Cd2+,等形成有色配合物，其中与,Hg2+,生成的配合物最稳定，而上述其他离子在此条件下不发生反应。,2.,选择适当的掩蔽剂,3.,选择适当的测量波长,4.,干扰物分离,5.,导数光谱及双波长技术,73,2.6 UV-Vis,分光光度法应用,一、定性分析,二、纯度分析,三、结构分析,四、定量分析,74,作用：鉴定物质,做法：与已知或标准物的,UV-Vis,进行比较,原则：对比吸收光谱的特征（形状和,max,）,一、定性分析,1,对比吸收光谱特征数据,max,，,min,，,等,2.,对比吸收光谱的形状一致性,75,比较未知物与已知标准物的吸收光谱曲线,76,1 Sadtler Standar Spectra(Ultraviolet),Heyden,London,1978.(46000,种化合物,),。,2 R.A.Friedel and M.Orchin,“,Ultraviolet and,Visible Absorption Spectra of Aromatic Comp,-ounds,”,Wiley,New York,1951.(597,种芳香化合物,),。,3 Kenzo Hirayama,：,“,Handbook of Ultraviolet and,Visible Absorption Spectra of Organic,Compounds.,”,New York,Plenum,1967,。,4,“,Organic Electronic Spectral Data,”,，,John Wiley,and Sons,，,1946,（目前还在继续编写）。,与标准谱图比较（以下四种）,77,二、纯度分析：,1.,当化合物在紫外光谱区的某一波长范围内无吸收，而杂志有强的吸收时，则可用于测定该化合物中的杂质。,例如,乙醇中微量苯的鉴定。,2.,如果在某一紫外光谱区，化合物有强吸收而杂志无吸收，也可以用摩尔吸光系数检查它的纯度。,例如,标准菲的氯仿溶液在,296nm,处有强吸收，测得摩尔吸光系数比精制的菲在相同波长处低,10,，说明菲样品的实际含量只有,90,78,三、结构分析,可以鉴定化合物中的共轭结构和芳香环结构（无这些结构，则近紫外区内无吸收）。,经验规则：,伍德沃德（,Woodward,）规则,适用：,计算二烯烃或多烯烃的最大吸收位置,斯科特（,Scott,）规则,适用：,计算不饱和羰基化合物的,*,最大吸收位置,79,母体类型,/nm,基数,214,同环的二烯烃,基数,253,（注意：当两种情形同时存在时，选择波长较长的为其母体）,增加一个共轭双键,30,环外双键,5,每个烷基取代基,5,O,乙酰基,0,OR,6,SR,30,Cl,，,Br,5,NR,2,60,（,Woodward,）规则,80,母体（同环二烯）,253,取代烷基（,5,个）,25,环外双键（,3,个）,15,延伸双键,30,323nm,例子：,(,实测,320nm,）,81,，,不饱和羰基化合物母体,215,每增加一个共轭双键,30,同环二烯化合物,39,环外双键,5,每个烷基,10,12,18,OH,35,30,50,OAc,6,6,6,Cl,15,12,Br,25,30,NR,2,95,母体,215,延伸双键,30,取代烷基（,3,个）,54,299,（实测,296,）,（,Scott,）规则,82,四、定量分析,（一）单组分定量,1.标准曲线法,83,A,c,A,x,c,x,标准曲线,84,2.标准比较法,该法是标准曲线法的简化，即只配制一个浓度为,c,s,的标准溶液，并测量其吸光度，求出吸收系数,k,，,然后求出,c,x,该法只有在测定浓度范围内遵守,L-B,定律，且,c,x,与,c,s,大致相当时，才可得到准确结果,。,85,（二）多组分定量方法,(a),当各组分的吸收光谱不重叠，如单组分测定其浓度。,(b),、（,c),中,A,、,B,互相干扰，根据吸光度加和性，解方程组。,可分别用已知浓度,A,、,B,纯液求出,86,2.双波长法,等吸收点法,双波长输出信号为,A,输出讯号,A,与干扰组分,A,无关，它只正比于待测组分,B,的浓度，即消除了,A,的干扰,.,吸收光谱重叠较为严重,87,3.,系数倍率法,当干扰组分,A,是陡坡状，不存在两个波长处等吸收点。,利用双波长分光光度计中差分函数放大器，把分别,(,双波长分光光度计）放大,k,1,、,k,2,倍，则两波长处的信号差为,S,、,调节放大器，使,2,和,1,满足：,干扰组分,A,无关，即消除了,A,的干扰,88,4.,导数法,1,）定义：将吸光度信号转化为对波长的导数信号的方法。导数光谱是解决干扰物质与被测物光谱重叠，消除胶体等散射影响吸收，提高光谱分辨率的一种数据处理技术。,2,）原理：,控制,一阶导数信号与浓度成正比。同样可得到二阶、三阶,n,阶导数信号亦与浓度成正比。,89,N,阶微分产生,n+1,个谱峰，宽度变小，峰形越来越尖锐，因而导数光谱法分辨率高（左图）。,90,应用实例,1,、配合物组分及其稳定性常数的测定,摩尔比法、等摩尔连续变化法、斜率比法和平衡移动法四种，前两种方法更为常用,1.,摩尔比法,(,也称为饱和法,),固定金属离子,M,的浓度，改变配位体,R,的浓度，可得到一系列,C,R/,C,M,值不同的吸光度曲线，曲线拐点处为,n.,设配合物电离度为,显色,91,应用实例二：弱酸离解常数的测定,若测出,L,-,HL,即可求出,K,a,。,一份强碱性，,maxL,-,，,A=,L,-,bC,，求出,L-,另一份为强酸性，同理求出,HL,。,第三份为已知,pH,值的缓冲溶液，分别在碱性和酸性体的最大吸收波长处测定总吸光度，解联立方程求得,L-HL,，然后按前式求出,Ka,。,92,思考题与练习题,分子的紫外可见吸收光谱呈带状光谱，原因是什么？,dcab,2.,93,思考题与练习题,紫外吸收光谱有何特征？紫外吸收光谱说明什么？,2.,朗伯比尔定律的物理意义是什么？,3.,在双波长法中，测定波长与参比波长如何选择？,4.,某化合物在已炔溶剂中吸收波长为,305nm,而在水中吸收波长为,307nm.,试问：引起该吸收的是,n-,*,还是,-,*,跃迁？,5.,排列下列化合物的最大吸收波长的顺序：,乙烯、,1,，,3,，,5,己三烯、,1,，,3,丁二烯。,94,95,澳洲的宝石蛋白石,(opal),蛋白石是由二氧化硅,纳米,球,(nano-sphere),沉积形成的矿物，其色彩缤纷的外观与色素无关，而是因为它,几何结构上的周期性,使它具有光子能带结构，随着能隙位置不同，反射光的颜色也跟着变化,光子晶体选择反射太阳光中某波长光而呈现颜色,96,这是因为太阳光是由,红,、橙、黄、绿、青、,蓝,、紫七种颜色组成的。这七种颜色的光波长是不一样的。大气中的尘埃以及其他微粒散射蓝光的能力大于散射其他波长较长的光子的能力，因此天空显现出蓝色。,波长愈短的光，散射愈强，波长愈长的光，散射愈弱,。,散射能力不同使天空呈现蓝色,