第章-蛋白质和氨基酸的测定.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,蛋白质是生命的物质基础,蛋白质是食品的重要营养成分,蛋白质在食品加工中的意义,The importance of protein in food processing,蛋白质是食品中,三大营养素,之一,蛋白质对食品的色、香、味及组织结构等具有重要意义,一些蛋白质具有生物活功能，是开发功能性食品原料之一,蛋白质的元素组成,The elements of protein,C,：,50-55%,H,：,6-8%,O,：,20-23%,S,：,0-4%,N,：,15-18%,微量元素：,P,、,Fe,、,Zn,、,Cu,、,I,等,食品中蛋白质来源,The source of protein in food,动物中蛋白质；如猪肉、鱼肉、鸡肉、乳,植物中蛋白质：如大豆、谷物,微生物中蛋白质：酵母,哪种食物中蛋白质含量最高,？,蛋白质系数,测定方法,一、利用蛋白质的,共性,，即含氮量、肽键和折射率等测定（,定氮法、,双缩脲法、物理法,),二、利用蛋白质中特定氨基酸,残基,、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定,(,染料结合法等,）,最常用的是凯氏定氮法，测得粗蛋白质含量,第二节 凯氏定氮法（,Kjedahl Method,1833,）,(GB),一、常量凯氏定氮法（,丹麦化学家凯道尔,(Johan,Kjedahl,),首创,）,1,、原理,样品与浓硫酸和催化剂一同加热,消化,(digest),，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出。,而样品中的,有机氮,(organic nitrogen),转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。,然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。,样品消化,(sample digestion),：,消化方程式,2NH,2,（,CH,2,）,2,COOH+13H,2,SO,4,(NH,4,),2,SO,4,+6CO,2,+12SO,2,+16H,2,O,浓硫酸：,脱水性，氧化性,脱水炭化,氧化,有机物,C,、,H,、,N CO,2,、,SO,2,N,+,SO,2,NH,3,+,SO,3,加速蛋白质的分解，缩短消化时间,1,）硫酸钾,提高,溶液的沸点,而加快有机物分解，与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度,纯硫酸，沸点，,340,左右，加硫酸钾，提高至,400,以上，,原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大，故沸点升高,硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，铵盐分解。,也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾,（,2,）硫酸铜,CuSO,4,催化剂,凯氏定氮法中可用的催化剂种类很多，还有氧化汞、汞、硒粉、二氧化钛等,（效果、价格、环境污染），应用最广泛的是硫酸铜,使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物氧化，,作用机理,还可指示消化终点的到达，蒸馏时作为碱性反应的指示剂。,蒸馏,(neutralization and distillation),消化完全的样品溶液，浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气,2,N,a,OH(NH,4,),2,SO,4,2NH,3,Na,2,SO,4,2H,2,O,吸收与滴定,(titration),吸收：加热蒸馏所放出的氨，硼酸溶液,滴定：盐酸标准溶液，,硼酸呈微弱酸性（,Ka1=5.810,-10,），用酸滴定不影响指示剂的变色反应，它有吸收氨的作用,也可采用硫酸或盐酸标准溶液吸收，然后再用氢氧化钠标准溶液反滴定吸收液中过剩的硫酸或盐酸，从而计算总氮量。,2,、适用范围（,application),此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定。,3,、主要仪器,凯氏烧瓶,定氮装置,4,、试剂,5,、操作方法,样品,+,硫酸铜,+,硫酸钾,+,浓硫酸,45,度角,先小火炭化，无泡沫后，加大火力，液体变蓝绿透明，继续加热微沸,30,分钟,NaOH+,水,硼酸,+,指示剂,玻璃珠,6,、结果计算,7,、说明及注意事项,试剂溶液应用无氨蒸馏水配制,（,11,）蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸,1,分钟后关掉热源，否则可能造成吸收液倒吸。,(12),混合指示剂,在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。,甲基红,:,红,-(,橙,)-,黄，,pH4.4-6.1,溴甲酚绿,:,黄,-(,青蓝,)-,蓝，,pH3.8-5.4,二、微量凯氏定氮法,1,、原理及适用范围,同常量凯氏定氮法,2,、主要仪器,凯氏烧瓶（,100ml),微量凯氏定氮装置,(,p222,),3,、试剂,0.01000 mol/L,盐酸标准溶液,其他同常量凯氏定氮法,4,、操作方法,稀释消化液，定容,馏出液用,0.01000mol/L,盐酸标准溶液滴定至微红色为终点，同时作一空白试验,5,、结果计算,蒸馏至吸收液中所加的混合指示剂变为绿色开始计时,继续蒸馏,10,分钟后，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏,1min,用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后停止蒸馏。,三、自动凯氏定氮法,1,、原理及适用范围,同常量凯氏定氮法,2,、主要仪器,自动凯氏定氮仪,消化装置,3,、试剂,硫酸铜和硫酸钾制成片剂,全自动凯氏定氮仪,第三节,蛋白质的快速测定法,双缩脲法,紫外分光光度法,染料结合法,水杨酸比色法,一、双缩脲法,1,、原理,当脲小心地加热至,150,160,时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成二缩脲（也叫双缩脲），反应式如下：,双缩脲与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物，此反应称为双缩脲反应,蛋白质分子含有,肽键,与双缩脲结构相似，故也能呈现此反应而生成,紫红色配合物,在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比，据此可用吸收光度法来测定蛋白质含量，该配合物的最大吸收波长为,560nm,。,2,、,方法特点及应用范围,本法灵敏度低，但操作简单快速，故在生化领域中测定蛋白质含量时常用此法。,本法亦适用于豆类油料、米、谷等作物种子及肉类等样品测定。,3,、,主要仪器,4,、,试剂,（,1,）碱性硫酸铜溶液,以甘油为稳定剂,以酒石酸钾钠作稳定剂,配制试剂加入硫酸铜溶液时，必须剧烈搅拌，否则将生成氢氧化铜沉淀,（,2,）四氯化碳,5,、,操作方法,标准曲线的绘制,凯氏定氮法测出的标准蛋白质样,显色（加入试剂静置,1,小时）,比色（取上清离心）,样品的测定,显色,比色,查标准曲线,6,、结果计算,蛋白质（,mg/100g,）,=,式中：,c,由标准曲线上查得的蛋白质,mg,数；,m,样品质量，,g,二、紫外分光光度法,1,、,原理,蛋白质及其降解物（眎、胨、肽和氨基酸）的芳香环,残基,在紫外区内对一定波长的光具有选择吸收作用。在此波长（,280nm,）下，光吸收程度与蛋白质浓度,(3,8mg/ml),成线性关系,2,、,适用范围,本法操作简便迅速，常用于生物化学研究工作，,许多非蛋白质成分在紫外区也有吸收作用，光散射作用的干扰，,在食品分析领域中的应用并不广泛，最早测定牛乳的蛋白质含量，也可测小麦面粉、糕点、豆类、蛋黄及肉制品中的蛋白质含量,3,、主要仪器,紫外分光光度计,离心机,4,、试剂,1mol/L,柠檬酸水溶液,8mol/L,尿素的,2mol/L,氢氧化钠溶液,95%,乙醇,无水乙醚,5,、操作方法,标准曲线的绘制,准确称取试样,2.00g,，,+0.1mol/L,柠檬酸,四层纱布过滤，离心,上清液,+,脲的氢氧化钠溶液，至透明,比色，,8mol/L,脲的氢氧化钠溶液作参比,样品的测定,6,、结果计算,蛋白质（,mg/100g,）,=,中,c,由标准曲线上查得的蛋白质,mg,数；,m,样品质量，,g,三、染料结合法,1,、,原理,凡是来源相同的蛋白质，,碱性,（或酸性）氨基酸的含量，大体上是相同的。利用这个特点，加入过量的,酸性,（或碱性）染料，使其和蛋白质形成不溶性盐而沉淀析出。用分光光度计测定,未反应,的染料量，然后根据算出来的结合染料量求出蛋白质含量。,2,、,适用范围,本法适用于牛乳、冰淇淋、酪乳、巧克力饮料、脱脂乳粉等食品。,3,、,主要仪器,分光光度计,组织捣碎机,离心机,4,、,试剂,5,、,操作方法,(1),样品处理：,（,2,）染料结合：,（,3,）过滤离心：,（,4,）比色：,（,5,）标准曲线的绘制：,(6),测样,四、水杨酸比色法,1,、,原理,样品中的蛋白质经硫酸消化而转化成铵盐溶液后，在一定的酸度和温度条件下可与水杨酸钠和次氯酸钠作用生成,蓝色的化合物,，可以在波长,660nm,处比色测定，求出样品含氮量，进而可计算出蛋白质含量。,2,、,主要仪器,分光光度计,恒温水浴锅,3,、,试剂,氮标准溶液,空白酸溶液,磷酸盐缓冲溶液,水杨酸钠溶液,次氯酸钠溶液,4,、操作方法,标准曲线的绘制,样品处理：消化,样品测定：稀释，取样测定,标准曲线的绘制,标准溶液于,25ml,容量瓶、比色管,2ml,空白酸工作液、,5ml,磷酸盐缓冲液、水至,15ml,、,5ml,水杨酸鈉，,36-37,0,C,恒温水浴,15,分钟,加入次氯酸钠,2.5ml,，恒温水浴,15,分，加水至标线,660nm,比色,5,、,结果计算,6,、,说明,样品消化完全后当天进行测定结果的重现性好，但样液放至第二天比色即有变化,温度对显色影响极大，故应严格控制反应温度。,对谷物及饲料等样品的测定证明，此法结果与凯氏法基本一致,蛋白质氮和非蛋白质氮的测定,利用蛋白质能与重金属离子（如,Cu,2+,、,Hg,2+,、,Pb,2+,等）结合形成蛋白质盐而变性沉淀的特性，在一定的条件下，将蛋白质氮和非蛋白质氮分离,.,然后用凯氏定氮法分别进行定量。,蛋白质沉淀剂,:,常用的有氢氧化铜、醋酸铅、三氯乙酸、单宁等,.,第五节,氨基酸总量的测定,双指示剂甲醛滴定法,电位滴定法,茚三酮比色法,(ninhydrin method),双指示剂甲醛滴定法,1,、原理,氨基酸具有,酸性的,-COOH,基和,碱性的,-NH,2,基,。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，,-NH,2,基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定,-COOH,基，并用间接的方法测定氨基酸总量。,2,、方法特点及应用,此法简单易行、快速方便,在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基氮含量的变化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此作为,控制发酵生产的指标之一,。,脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏低；,酪氨酸含有,酚羧基,，滴定时也会消耗一些碱而致使结果偏高；,溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往使结果偏高。,3,、试剂,40%,中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将,40%,甲醛中和至淡蓝色。,0.1%,百里酚酞乙醇溶液（,9.3-10.6,）,0.1%,中性红,50%,乙醇溶液（,6.8-8.0,）,0.1mol/L,氢氧化钠标准溶液,4,、操作方法,样品溶液,(,氨基酸约,20-30mg),2,份,，,+50ml,蒸馏水,1,份，,+3,滴中性红指示剂，用,0.1mol/L,氢氧化钠标准溶液滴定（红色,琥珀色，终点）,1,份，,+3,滴百里酚酞指示剂,+,中性甲醛,20ml,，摇匀，静置,1,分钟，,0.1mol/L,氢氧化钠标准溶液滴定（淡兰色，终点）,分别记录,两次所消耗的碱液,ml,数,。,5,、结果计算,6,、说明及注意事项,此法适用于测定食品中的游离氨基酸,固体样品应先进行粉碎，准确称样后用水萃取，然后测定萃取液；,液体试样如酱油、饮料等可直接吸取试样进行测定。萃取可在,50,0,C,水浴中进行,0.5,小时即可。,与本法类似的还有单指示剂（百里酚酞）甲醛滴定法，此法用标准碱完全中和,-COOH,基时的,pH,为,8.5-9.5,，但分析结果稍偏低，双指示剂法的结果更准确。,若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定，或用,电位滴定法,进行测定。,二、电位滴定法,1,、,原理,根据氨基酸的两性作用，加入,甲醛,以,固定氨基的碱性,，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的,pH,值判断和控制滴定终点。,2,、,仪器,酸度计,磁力搅拌器,微量滴定管,3,、,试剂,20%,中性甲醛溶液：参考甲醛滴定法试剂,0.05mol/L,氢氧化钠标准溶液,磁力搅拌器,操作方法,pH8.2,，计算总酸含量用,pH9.2,记录碱液体积,试剂空白试验。记录空白消耗碱液体积,5,、,结果计算,6,、,说明,本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定,对于浑浊和色深样液可不经处理而直接测定,茚三酮比色法,(ninhydrin method),1,、,原理,氨基酸在,碱性,溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色,(Ruhemann purple color),化合物（除,脯氨酸,外均有此反应）。该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为,570nm,，故据此可以测定样品中氨基酸含量。,脯氨酸生成黄色化合物，,440nm,1,、,主要仪器,2,、,试剂,4,、,操作方法,（,1,）标准曲线绘制,（,2,）样品的测定,5,、结果计算,1,、字体安装与设置,如果您对PPT模板中的字体风格不满意，可进行批量替换，一次性更改各页面字体。,在,“,开始”,选,项卡,中,，点击“,替,换”按,钮右,侧箭,头,，,选,择“,替,换,字,体,”。（如下,图）,在图“替换”下拉列表中选择要更改字体。（如下图）,在“替换为”下拉列表中选择替换字体。,点击“替换”按钮，完成。,78,2,、替换模板中的图片,模板中的图片展示页面，您可以根据需要替换这些图片，下面介绍两种替换方法。,方法一：更改图片,选中模版中的图,片,（,有些图片与其他,对象,进行了组合，,选,择,时,一定要选中图,片 本身，而不是组合）。,单击鼠标右键，选择“更改图片”，选择要替换的图片。（如下图）,注意：,为防止替换图片发生变形，请使用与原图长宽比例相同的图片。,78,赠送精美图标,