基因工程生物化学.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,2,nm,大沟,(2.2,nm),小沟,(1.2,nm),3.4,nm,DNA,双螺旋结构要点,(,Watson,和,Crick，1953),1.DNA,由两条反相平行的脱氧核苷酸链,组成，脱氧核糖-磷酸骨架位于双链的,外侧，碱基位于内侧，双链的碱基之,间以氢键相结合。,碱基互补配对形式：,A,T；G,C),2.DNA,是右手螺旋结构，螺旋直径为 2,nm，,螺距为 3.4,nm。,碱基平面垂直螺,旋轴，相邻碱基平面距离为 0.34,nm，,螺旋一圈包含 10 对碱基。,3.,氢键维持,DNA,双链横向稳定性，碱基,堆积力维持双链纵向稳定性。,亲代,DNA,复制,子代,DNA,DNA,双螺旋解开成为单链，用于合成新的互补链.,子代,DNA,双链中一股单链是从亲代完整地接受过来,另一股单链按碱基配对原则完全重新合成,半,保,留,复,制,DNA,复制的酶及蛋白因子,1.底物,dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dTTP),2.,聚合酶,DNA,聚合酶,（,DNA,依赖的,DNA,聚合酶),DNA-pol,3.,模板,单链的,DNA,母链,4.引物,寡核苷酸引物（,RNA),5.,其他酶和蛋白质因子,拓扑异构酶、,单链,DNA,结合蛋白,，连接酶,解旋酶、引物酶,多种蛋白因子,DNA,聚合酶,（,DNA polymerase，DNA-pol）,以,DNA,为模板，催化3，5 -磷酸二酯键的形成,5,3,A G T C A T C A G A C C C,3,5,T C A G,G,T,G,A,T,C,T,G,G,5,G,T,C,T,G,G,A,G,A,C,C,C,5,基因工程,(,Genetic engineering),(,Central dogma),基因(,Gene),能编码一条多肽链并具有一定长度的,DNA,分子。,基因组(,Genome),一种生物全部染色体的遗传物质的总和，以全长,DNA,的碱基对(,bp),数目表示。,细菌基因组,大肠杆菌：,4,x 10,6,bp,人类基因组：,3,x 10,9,bp,克隆,(,Clone),指用,无性繁殖,方法产生一组,遗传上相同的细胞,和生物群,体过程。这些细胞或个体均来自无性繁殖单一原形细胞。,分子克隆,(,Molecular cloning),利用,DNA,重组技术,可使,一个基因或,DNA,片段,产生出,许多,相同的拷贝。,DNA,重组技术,(,Recombinant DNA techniques),利用,限制性内切酶,、,连接酶,等在,体外,将,不同,生物体的,DNA,片段,进行,重新组合,的技术。重新组合在一起,DNA,片段称作,重组,DNA,分子,。,基因组,DNA,克隆,载体,限制性内切酶消化,限制性内切酶,消化、电泳分离、纯化,DNA,连接酶,重组载体,转化,或转导,大肠杆菌宿主细胞,细胞,增殖,分,子,克,隆,的,基,本,过,程,重组载体,在大肠杆菌宿主细胞中复制以产生许多相同的分子拷贝,基因组,DNA,载体,(,环状,DNA),可被克隆的,DNA,片段,线状,DNA,载体,筛选,含目的基因的重组子,限制性内切酶,限制性内切,酶,转化,或转导大肠杆菌,重组,DNA,分子,组 织,mRNA,cDNA,部分或全部酶切的,DNA,加衔接物分子,DNA,连接,酶,反转录,工具,酶,载体,目的基因,基因组,DNA,文库筛选,PCR,产物,cDNA,文库筛选,RT-PCR,产物,化学合成,宿主细胞,导入,重组,DNA,分子,到宿主细胞,筛选,携带目的基因的宿主细胞,分子克隆,的所需的,条件,工具酶,1.,限制性内切酶,和修饰酶,(,Restriction endonucleases,and modifying enzymes),一类存在于细菌中的核酸内切酶，它们,识别双链,DNA,分子上,特异的核苷酸,序列，并对,DNA,分子进行,剪切,。,“,限制性,”只降解外源,DNA,而不降解宿主,DNA,；,细菌存在甲基化酶,，对限制性内切酶识别序列中腺苷酸和胞苷酸进行甲基化而,不被限制性内切酶所剪切,。这就构成了细菌的“,限制,-,修饰系统,”的分子基础。,“,内切酶,”是指,酶切位点,在,DNA,分子内，而不是两端。,限制性内切酶,(Restriction endonucleases),限制性内切酶的,分类,回文结构,(palindrome),是双链,DNA,分子中的反向重复,结构，即每条链从,5,3,方向读其核苷酸序列都相同。,5,GGA,TCC,3,5,GGA,TCC,3,3,CCT,AGG,5,3,CCT,AGG,5,5,AGA,TCT,3,3,TCT,AGA,5,5,CCC,GGG,3,3,GGG,CCC,5,命名,属名,(genus),的第一个字母，用大写表示,种名,(species),的前两个字母，用小写表示,细菌株名,(strain),，用大写或小写表示,同一细菌株中不同的限制性内切酶被发现和分离的顺序，用罗马字表示。,类型,II,限制性内切酶,同一细菌株中不同的限制性内切酶被发现和分离的顺序，用罗马字表示,属名,(,大写,),E,co,R,I,种名,(,小写,),细菌株名,(,大写,),Escherichia,属,coli,种,R,株,识别序列,(1),具,有,回文结构,BamHI5 G,GATCC 3,3 CCTAG,G 5,KpnI5 GGTAC,C 3,3 C,CATGG 5,(2),具有,间断的回文结构,HinfI(XmnI)5 G,ANTC 3,3 CTNA,G 5,(3),具有,简并性碱基,HincII5 GT(T/C),(A/G)AC 3,3 CA(A/G),(T/C)TG 5,(4),无回文结构,MboII5 GAAGA(N),8,3,3 CTTCT(N),7,5,GAATTC,CTTAAG,CTTAA,5,-,3-,-3,-5,5,-,3-,-3,-5,G,AATTC,G,5,P-,3 OH-,-,OH,3,-P 5,CTGCAG,GACGTC,5,-,3-,-3,-5,CTGCA,5,-,3-,G,-OH 3,-P 5,ACGTC,5,P-,3 OH-,G,-3,-5,EcoRI,PstI,经限制性内切酶,酶切,后所产生的,末端类型,(1),粘性末端,(sticky ends,cohesive ends),5,凸端,(5 overhang),粘性末端,3,凸端,(3 overhang),粘性末端,CCCGGG,GGGCCC,5,-,3-,-3,-5,5,-,3-,-OH 3,-P 5,CCC,GGG,GGG,CCC,5,P-,3 OH-,-3,-5,SmaI,-3,-5,5,-,3-,5,-,3-,-OH 3,-P 5,GG,CC,5,P-,3 OH-,-3,-5,CC,GG,GGCC,CCGG,HaeIII,(2),平端,或钝端,(blunt ends),同尾酶,（,isocaudarner,）,限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割,DNA,后，产生相同黏端，这样的酶彼此互称为,同尾酶,。这两个相同的黏端称为,配伍末端,(compatible end),。,Bam H,Bg l,GGATCC,CCTAGG,AGATCT,TCTAGA,G,CCTAG,GATCC,G,+,+,A,TCTAG,GATCT,A,不同的酶可以产生同样的末端,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bst,CCCGGG,GGGCCC,C,CCCGG,CCGGG,G,+,Xma,CCCGGG,GGGCCC,CCC,GGG,GGG,CCC,+,Sma,能识别同一序列（切割位点可同或不同）但来源不同的两种酶互称同工异源酶（,isoschizomer,）或同裂酶。,不同的酶可以识别同一个序列,酶活性单位,：在,37,C(,某些限制性内切酶用,25,C,或,50,C),条件下，每,1,小时酶切,1,g DNA,所用的酶量。,类型,II,限制性内切酶的,反应条件,常用的酶反应体系为,50,l,，即,10X,缓冲液,5,l,DNA2,g,ddH,2,O42.5,l,限制性内切酶,(10U/,l)0.5,l,T4 DNA,连接酶,(,T4 DNA ligase),碱性磷酸酶,(Alkaline phosphatase),去除核酸分子末端的磷酸基团,DNA,聚合酶,I,大片段,(Klenow),T4 DNA,聚合酶,(T4 DNA polymerase),合成,DNA,T7 DNA,聚合酶,(T7 DNA polymerase),Taq,DNA,聚合酶,(,Taq,DNA polymerase),逆转录酶,(Reverse transcriptase),以,RNA,为模板合成,cDNA,末端脱氧多核苷酸转移酶,(Terminal deoxynucleotidyl transferase),给,DNA,末端加尾以构成黏性末端,多核苷酸激酶,(Polynucleotide kinase)5,羟基末端磷酸化,DNA,核酸酶,I(DNA nuclease I),S1,核酸酶,(S1 nuclease),外切核酸酶,III(Exonuclease III),外切核酸酶,(,Exonuclease),2.,修饰酶,(Modifying enzymes),T4 DNA,连接酶,ATP,TGCTTAA,5-,3-,ACG,-OH 3,-P 5,AATTCGT,GCA,-3,-5,5 P-,3 OH-,TGC,TTAA,5-,3-,ACG,AATT,CGT,GCA,-3,-5,T4 DNA,连接酶,(T4 DNA ligase),催化,DNA,的,3-OH,和,5-P,之间形成,磷酸二酯键,连接,带,粘性末端,的两个,DNA,分子,T4 DNA,连接酶,ATP,ACG,5-,3-,TGC,-OH 3,-P 5,TAGCCGT,ATCGGCA,-3,-5,5 P-,3 OH-,5-,3-,TGCTAGCCGT,ACGATCGGCA,-3,-5,连接,带,平端,的两个,DNA,分子,粘性末端,平端,E.coli,DNA,聚合酶,I Klenow,片段,Klenow,片段是,E.coli,DNA,聚合酶,I,的羧基端片段，长度为全酶的,70,。,具有,5,3,聚合酶活性,及,3,5,外切酶活性。,蛋白酶酶切位点,Klenow,片段,5 GAATTC 3,3 CTTAAG 5,EcoRI,5 G 3 5 AATTC 3,3 CTTAA 5 3 G 5,Klenow,dNTPs,5 GAATT 3 5 AATTC 3,3 CTTAA 5 3 TTAAG 5,5,3,聚合酶活性,：,补平,限制性内切酶酶切所产生的,3,凹端而形成平端,5 GGTACC 3,3 CCATGG 5,KpnI,5 GGTAC 3 5 C 3,3 C 5 3 CATGG 5,Klenow,5 G 3 5 C 3,3 C 5 3 G 5,3,5,外切酶活性,：,去除,限制性内切酶酶切所产生的,3,凸端而形成平端,逆转录酶,(Reverse transcriptase,，,RT),逆转录酶为,依赖,RNA,的,DNA,聚合酶,，具有,5,3,聚合酶活性外，以,RNA,为模板合成,DNA,。,逆转录酶还具有,核糖核酸酶,H,(RNase H),活性，可,从,5,末端或,3,末端降解,RNA:DNA,杂合链中的,RNA,。,依赖,DNA,的,DNA,聚合酶,逆转录酶无,3,5,外切酶活性。,禽类,逆转录酶和,鼠类,逆转录酶的比较,以,mRNA,为模板合成第一条,cDNA,链,，所用的引物包括,Oligo(dT),12-18,特定序列的寡核苷酸,随机序列的寡核苷酸,构建,cDNA,文库,：用,Oligo(dT),12-18,引物,克隆特定的,cDNA,：,用,特定序列的寡核苷酸引物,RT-PCR,：,用,特定序列的寡核苷酸引物,制备,cDNA,探针,：,用,特定序列的寡核苷酸引物或,随机序列的寡核苷酸引物,MMLV RT,催化的,cDNA,合成,proinsulin cDNA,的合成,载体,和,宿主细胞,(,Vectors and Host cells),载体（,vector,）,是,为携带,感兴趣的,外源,DNA,，实现外源,DNA,在受体细胞中的,无性繁殖,或表达有意义的蛋白质所采用的一些,DNA,分子,按功能分,克隆载体（,cloning vector,）,表达载体（,expression vector,）,按基本元件的来源不同,质粒载体,噬菌体载体,黏粒载体,病毒载体,人工染色体载体等,载体概述,载体(,Vectors),克隆载体(,Cloning vector),用于构建基因组文库、,cDNA,文库以及克隆某一特定基因,或,cDNA,以测定其核苷酸序列。,使外源,DNA,被扩增,(1)质粒(,plasmid),(2),噬菌体载体(,phage),(3),粘粒(,cosmid),(4),细菌人工染色体(,Bacterial artificial chromosome,BAC),(5),酵母人工染色体(,Yeast artificial chromosome,YAC),表达载体(,Expression vector),用于表达某一基因或,cDNA,以,获得目的蛋白质,。表达载体,包括,原核表达载体,和,真核表达载体,，表达载体的种类较多，可根据要表达的目的蛋白质的特点来选则载体。,克隆载体宿主细胞载体结构外源插入片段,质粒,大肠杆菌环状质粒,0.1-10,kb,噬菌体载体大肠杆菌线状病毒8-25,kb,粘粒大肠杆菌环状质粒35-45,kb,细菌人工染色体大肠杆菌环状质粒50-300,kb,酵母人工染色体酵母线状染色体100-1000,kb,不同,类型克隆载体,的比较,克隆载体,应具备的主要,特点,至少有一个,复制起点,（,origin of replication,ori,）,至少有一个,选择性标志,（,selection marker,）,有适宜的,限制性内切酶的单一切点,：称为多克隆位点（,multiple cloning sites,，,MCS,）,应有,较高的拷贝数,。,pBR322,质粒图谱,质粒是,存在于细菌染色体,(基因组),外的,DNA,分子,，其,大小在 1,kb-200 kb,范围内。,质粒是,双链、共价闭合的环状,DNA,分子,，以超螺旋形式,存在。,质粒具有复制起始点，可在细胞中进行,自我复制,，并将质,粒,DNA,分配给子细胞。,高拷贝数质粒：10-200个/细胞,低拷贝数质粒：几个/细胞,质粒还,含有在特定环境条件下所必需的基因,，如抗生素的,抗性基因。,质粒,(,plasmid),克隆质粒,(,Cloning plasmid),低分子量 易于提取且不易断裂,高拷贝数,可,大量扩增被克隆的目的基因、,DNA,片段或,cDNA,。,(3),含有一个或几个可供选择的标记,，抗生素抗性基因、细菌,lacZ,基因片段及,ccdB,致死基因等。,(,4),含多克隆位点,质粒基因内有多个,限制性内切酶单一识别位点,，并允许外源,DNA,插入。,质粒载体所携带的复制子,基因组,DNA,质粒,DNA,细菌,基因组,DNA,和,质粒,DNA,超螺旋,质粒,DNA,闭环,质粒,DNA,细菌,抗生素,的作用位点,C,C,O,NH,C,C,C,N,O,S,H,CH,3,H,CH,3,HOOC,H,2,N,H,氨苄青霉素,-内酰胺环,-内酰胺酶,作用位点,抗生素的,抗性基因产物,及其功能,Ap,R,:Ampicillin resistance gene,rep(ori):replication origin,lacZ:N-terminal,-galactosidase,MCS:multiple cloning sites,MCS(pUC18),克隆质粒,带有,E.coli,乳糖操纵子的,lac,启动子,及,编码,-,半乳糖苷酶氨基端,(,-供体片段，,146 氨基酸,)的,DNA,片段。,E.coli,宿主细胞,(,DH5,JM109,XL1-Blue,菌株),的乳糖,操纵子的,-半乳糖苷酶基为缺陷型，,只能编码,-半乳糖,苷酶的羧基端片段(,-受体片段)。,异丙基,-,D-,硫代半乳糖苷(,IPTG,),诱导质粒上的,-供体,片段和,宿主细胞的,-受体,片段的表达，,两者结合,后才有,-半乳糖苷酶,活性，,使底物,5-溴-4-氯-3-吲哚-,-,D-,半乳糖,苷,(,X-gal),产生蓝色,。,两个无活性片段组合而成为功能完整的,-半乳糖苷酶的过程称为,-互补。,-互补,(,-,complementation),lacI,P,lacO,CRP site,MCS,lacZ”,P,lacO,CRP site,质粒,lacZ,宿主细胞基因组,无外源,DNA 片段,插入,MCS,-半乳糖苷酶,氨基端,(,-供体片段),IPTG,诱导,-半乳糖苷酶,羧基端(,-受体片段),水解,X-gal,(,蓝色菌落,),-互补,lacI,IPTG,诱导,-供体,片段,-受体,片段,-半乳糖苷酶,活性,X-gal,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,转 化,-半乳糖苷酶氨基端,-半乳糖苷酶氨基端,-半乳糖苷酶羧基端,-半乳糖苷酶,-半乳糖苷酶,水解,X-gal，,菌落呈蓝色,lacI,P,lacO,CRP site,外源,DNA 片段,外源,DNA 片段破坏,lacZ,外源,DNA,片段,插入,MCS,质粒,宿主细胞基因组,lacZ”,P,lacO,CRP site,-半乳糖苷酶羧基端,lacI,IPTG,诱导,IPTG,诱导,无,-半乳糖苷酶氨基端产生,无,-半乳糖苷酶,活性,不水解,X-gal,(,白色菌落),.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,外源,DNA 片段,破坏,lacZ,转 化,无,-半乳糖苷酶氨基端,-半乳糖苷酶羧基端,无,-半乳糖苷酶活性,不水解,X-gal,，,菌落,呈,白色,噬菌体,由,噬菌体改造而成的载体，可容纳 5-25,kb,的,外源,DNA,片段，,常用于构建基因组文库或,cDNA,文库,。,(1),插入型载体,只有一个目标位点可供外源,DNA,插入的载体为插入,型载体。可在克隆位点插入 5-11,kb,的,外源,DNA,片段。,(2)置换型载体,在非必需,DNA,两侧有一对克隆位点的噬菌体载体称,作置换型载体。中部的,DNA,由外源,DNA,片段(8-25,kb),所置换。,噬菌体,载体(,Phage vector),外源,DNA,重组,DNA,分子,体外包装,携带重组,DNA,分子的,噬菌体,DNA 连接酶,限制性内切酶,(1)粘粒载体是,质粒和,噬菌体的重组体,，将含有,cos,位,点的部分,DNA,插入到质粒中即构建成粘粒载体。,(2)粘粒载体可容纳 35-45,kb,的外源,DNA,片段，用于构,建基因组,DNA,文库。,(3)粘粒载体可经体外包装而形成感染颗粒，然后转导入,大肠杆菌，具有较高的转导率。,粘粒,(,Cosmid),(1),BAC,是环状,DNA,分子，包括,MCS,抗生素抗性基因、,复制子：来源于大肠杆菌,F,因子,RepE：,调节复制复合物在复制位点,处组装,parA-C,基因：确保子细胞含有单拷贝质粒,cos,位点：用于,噬菌体外壳蛋白包装,(2),BAC,可容纳至 1,Mb,大小的外源,DNA,片段。用电穿孔,方法将,BAC,与外源,DNA,片段的连接物导入大肠杆菌,或经噬菌体外壳蛋白包装后转导大肠杆菌。,细菌人工染色体,(,Bacterial artificial chromsome，BAC),目的基因的表达,(,Expression of target genes),功能分析,结构分析,建立药筛模型,临床药物,获得目的基因或,cDNA,亚克隆到表达载体,表达目的蛋白,基因治疗,表达载体(,Expression vectors),用于表达某一基因或,cDNA,以获得目的蛋白质,表达载体包括原核表达载体和真核表达载体,根据要表达的目的蛋白质的特点来选择载体,复制起始点(,Replication origin),多克隆位点(,Multiple cloning sites),抗生素抗性基因(,Antibiotics resistance gene),启动子(,promoter),转录终止子(,transcription terminator),加,PolyA,的信号序列(,真核表达载体,),核糖体结合位点(,ribosome binding site,RBS),表达载体,启动子,转录终止子,抗生素,抗性基因,多克隆位点,复制起点,表达载体,（一）,原核表达载体,除具备克隆载体的一般特点外，还需有,调控外源基因有效转录,和翻译的序列，如启动子、核糖体结合位点、转录终止序列等。,原核表达载体 大肠杆菌表达载体,基本组成如下：,R,：调节序列；,P,：启动子；,SD,：,SD,序列；,TT,：转录终止序列,大肠杆菌表达载体,Lac,启动子（乳糖启动子）,Trp,启动子（色氨酸启动子）,Tac,启动子（乳糖和色氨酸的杂合启动子）,P,L,和,P,R,启动子（,噬菌体的左向和右向启动子）,T7,启动子,启动子 表达必需元件，其能被,RNA,聚合酶所识别：,目前原核表达载体常使用的启动子有以下几种,2.,SD,序列,提供核糖体结合位点,mRNA,在细菌中的翻译严格依赖于核糖体结合位点（,ribosome binding site,）的存在。,SD,序列作为核糖体结合位点，保证了翻译起始复合物的形成。,3.,转录终止序列有助于外源基因的高效表达,多数原核表达载体中都带有转录终止序列,转录终止序列长短不一，几十,bp-,几百,bp,有助于使,RNA,聚合酶重点转录克隆的外源基因,4.,几种常见的原核表达载体各有特点,依据表达目的蛋白的方式，可将原核表达载体分为,（,1,）非融合型表达载体,（,2,）融合型表达载体,（,3,）分泌型表达载体,（,1,）非融合型表达载体用于表达非融合蛋白,非融合蛋白是指不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起进行表达的蛋白。表达该类蛋白的载体称为非融合型表达载体。,强启动子,tac,多克隆位点,目的基因克隆于启动子和,SD,序列下游,rrnB,核糖体,RNA,转录终止子，稳定载体系统，不至于干扰与载体本身稳定性有关的基因表达。,载体的其余部分来自,pBR322,。,使用,pKK223-3,时，应配套使用,LacI,q,宿主菌，在无,IPTG,诱导时，,tac,启动子受阻遏，当加入,IPTG,后，便可去阻遏，从而使外源基因表达。,将一段特殊蛋白质基因构建入载体，使之与目的蛋白融合表达形成融合蛋白（,fusion protein,）。,表达该类蛋白的载体称为融合型表达载体，如,pGEX,系统（,pGEX-lT,、,pGEX-2T,、,pGEX-3X,、,pGEX-4T,、,pGEX-5X,、,pGEX-6P,）。,载体使用强启动子,tac,，,SD,序列,下游,GST,基因,多克隆位点,用,IPTG,可诱导目的基因表达，表达产物与,GST,融合，故可利用该标签对蛋白进行纯化,。,（,2,）融合型表达载体用于表达融合蛋白,把受体细菌内表达的外源蛋白有效地分泌到周质腔，甚至穿过细胞外膜进入培养基中。,启动子、编码信号肽的序列（通常置于,SD,序列下游）。,非融合蛋白、融合蛋白表达。,pIN,系列载体 常用，可使所表达的蛋白分泌到宿主菌的周质腔中。,（,3,）分泌型表达载体用于外源基因的分泌表达,pIN,系列载体有,3,种，即,pIN-ompA1,、,pIN-ompA2,和,pIN-ompA3,，分别适用于使用不同密码子框架的目的基因的插入，克隆位点分别为,Eco,R,、,Hind,和,Bam,H,。,T7,启动子：与,T7 RNA,聚合酶特异结合,RBS：,目的蛋白质翻译时,mRNA,与核糖体结合的位点,标记：便于检测和纯化目的蛋白,(1)组氨酸标记(,His-Tag),6-10,个,组氨酸,与目的蛋白质的,N,或,C,末端形成融合蛋,白，便于用组氨酸-,Ni,2+,亲和层析方法一次纯化目的蛋,白质。,His-tag,是亲水性物质，不影响目的蛋白的三维,空间构象的形成，因此，,His-tag,不影响目的蛋白质的,生物活性。,(2)其它标记,T7-Tag，S-Tag，GST-Tag，CBD-Tag,等,T7,转录中止子,原核表达载体-,pET,表达系统,（二）,真核表达载体,用于在真原核细胞中表达外源基因,真核表达载体包括在大肠杆菌中起作用的复制起始位点、抗生素抗性基因、多克隆位点等。,真核表达载体中还具有：,真核表达,调控元件,：包括启动子、增强子、转录终止序列、,poly A,加尾信号等,真核细胞,复制起始序列,真核细胞,药物抗性基因,Ori,Pro,：原核复制起始序列,P,：启动子,MCS,：多克隆位点,TT,：转录终止序列,ori,euk,：真核复制起始序列,注：不是所有真核表达载体都有整合序列,真核表达载体的基本组成,酵母表达载体,昆虫表达载体,哺乳类细胞表达载体,根据真核宿主细胞的不同，真核表达载体可主要分为,：,用于基因治疗的病毒表达载体,逆转录病毒载体(,Retroviral vectors),腺病毒载体(,Adenoviral vectors),用于转基因动物的表达载体,含组织表达特异性的启动子,其它特殊表达载体,脂质双层,受体结合蛋白,逆转录酶,病毒,RNA,基因组(2 个分子拷贝),核心蛋白质,病毒,RNA,基因组,逆转录病毒(,Retrovirus),逆,转,录,病,毒,生,活,周,期,逆转录病毒载体的构建,(,pastoris，S.Cerevisiae，S.pombe,和,P.methanolica,昆虫细胞系,S2，Sf9，Sf21,各种高等真核生物组织细胞,表达用宿主细胞,大肠杆菌：,化学法和,电穿孔法转化,酵母细胞：电穿孔法转化,昆虫细胞和哺乳类细胞：转染和感染,(1)转染,CaPO,4,/DNA,共沉淀法,DEAE-,葡聚糖方法,脂质体法,电穿孔法,显微注射法,(2)感染,用携带目的基因的“病毒”颗粒感染宿主细胞,表达载体导入宿主细胞的方法,CaPO,4,-DNA,共沉淀法,钙离子与,DNA,的磷酸基团结合形成不溶沉淀,CaPO,4,-DNA，,并附着于细胞表面，通过细胞内吞作用被细胞所吸收。,DEAE-,葡聚糖方法,带正电荷的,DEAE-,葡聚糖与带负电荷的,DNA,磷酸基团结合形成,DEAE-,葡聚糖-,DNA,复合物并结合带负电荷的细胞膜，通过细胞内吞作用被细胞所吸收。,脂质体法,阳离子脂质富集,DNA,分子，形成稳定的,DNA-,脂质体并附着于带负电荷的细胞膜，脂质体与细胞膜发生融合，,DNA,被细胞所吸收,。,电穿孔法,原理同,电穿孔,转化方法，但所用的参数不同。,转染方法,人工合成的阳离子脂质的结构,构建携带目的基因的表达载体,表达载体被细胞吸收到细胞质中,表达载体转移到细胞核中,目的基因及选择性标记整合到,基因组,DNA,中,目的基因在真核细胞中的表达,暂态表达,稳定表达,转染,暂态表达(,Transient expression),携带目的基因的表达载体转染动物细胞后，表达载体以附加体(,episome),形式存在于细胞核，目的基因不整合到宿主细胞的基因组,DNA,中。通常目的基因的表达及其对细胞的影响在 24-72 小时内被检测到,并随着附加体的消失而最终消失。,稳定表达(,Stable expression),携带目的基因的表达载体转染动物细胞后，经选择培养基的筛选而获得稳定的转染细胞系，目的基因整合到细胞的基因组,DNA,中并随着,基因组,DNA,的复制而复制,。,稳定细胞系可以持续表达,目的基因。,核糖体,细胞核,RNA,目的蛋白,染色体,1,2,目的基因,选择性标记,1,暂态表达,2,稳定表达,整合,宿主细胞的选择由所用的载体来决定，即细胞必须,与载体匹配。,1.,克隆用宿主细胞,(1)基因组修饰的大肠杆菌菌株，如,DH5,NovaBlue,JM109,XL1-Blue,等,(2)酵母细胞,Saccharomyces cerevisiae,2.,表达用宿主细胞,(1)大肠杆菌,菌株，如,BL21(DE3),BL21(DE3)pLysS,等,(2)酵母细胞,(3)昆虫细胞系,(4)各种高等真核生物组织细胞,宿主细胞,(,Host cells),转化,(,Transformation)：,将外源,DNA,导入,细菌,的过程。,转染,(,Transfection)：,将外源,DNA,导入,真核细胞,的过程。,转导(,Transduction)：,利用噬菌体将外源,DNA,导入细菌,的过程。,感染(,Infection)：,利用病毒将外源,DNA,导入真核细胞的,过程。,载体,导入宿主细胞的方法,感受态细胞(,Competent cells),是有利于外源,DNA,分子进入的细胞。所用的转化方法不同，处理细胞使其进入感受态的方法也不同。,化学转化(,Chemical transformation),用 30,mM-100 mM,的,CaCl,2,处理大肠杆菌，细胞周围的,CaCl,2,促进,DNA,结合到细胞表面并增加细胞对,DNA,的,通透性。转化率为 5,X 10,6,-2 X 10,7,转化子/,g DNA。,物理转化(,Physical transformation),电穿孔法(,Electroporation):,当细胞经受高压电流脉冲,时，细胞膜上可逆地形成小至 2,n m,大小的孔洞，介质中,的,DNA,分子很容易通过孔洞进入细胞质,。,转化率为 10,9,转化子/,g DNA。,转化方法,DNA,克隆,的基本,过程,Procedure of DNA Cloning,目的,DNA,的分离获取（,分,）,载体的选择与准备（择、,切,）,目的,DNA,与载体连接（,接,）,重组,DNA,转入受体细胞（,转,）,重组体的筛选与鉴定（,筛,）,DNA,克隆的基本过程,风格法,如何获得目的基因,(1),基因组文库,中获得,(2),cDNA,文库,中获得,(3),通过,PCR,技术获得,(4),人 工 合 成,一、,化学合成法可直接合成目的,DNA,要求：,已知目的基因,的核苷酸,序列,或其产物的氨基酸序列,应用：一般用于,小分子,肽类基因的合成,*,化学合成法获取目的,DNA,由,已知氨基酸序列推测可能的,DNA,序列,色 苯丙 蛋 赖,第一步：,构建,基因组,DNA,文库,（是指包含某一个生物细胞或组织,全部基因组,DNA,序列,的随机克隆群体，以,DNA,片段的形式贮存了所有的基因组,DNA,信息）。,第二步：,筛选含有目的基因,的克隆。,二、,从基因组,DNA,文库中获取目的,DNA,组织或细胞染色体,DNA,基因片段,克隆载体,重组,DNA,分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶或机械剪切,受体菌,基因组,DNA,文库,存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组,DNA,片段的集合,*,从基因组,DNA,文库获取目的基因,三、从,cDNA,文库中获取目的,DNA,第一步：,构建,cDNA,文库,（包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部,mRNA,经反转录而合成的,cDNA,序列的克隆群体，它以,cDNA,片段的形式贮存了全部的基因表达信息）。,第二步：,筛选,含有目的,cDNA,的克隆。,cDNA,文库,存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有,cDNA,片段的集合,基因组,DNA,文库和,cDNA,文库的构建,从,基因组,DNA,文库或,cDNA,文库中筛选目的,DNA,的策略,1.,菌落或噬斑原位杂交,2.,针对表达文库，可用,抗原,-,抗体或配体,-,受体,结合的原理（亲和筛选法）筛选,*,从基因组,DNA,文库获取目的基因,菌落原位杂交法等方法，可从文库中筛选含有目的基因的噬菌体,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,cDNA synthesis,Infect cells,cDNA library,从,cDNA,文库获取目的基因,如果已经知道目的基因的序列，就能很方便地用,PCR,反应，从基因组,DNA,或,cDNA,中获得目的基因，可不必要经过复杂的,DNA,文库构建过程。,PCR,是一种高效快速的,体外,DNA,聚合,程序,四、经,PCR,获取目的,DNA,PCR,体系,模板,引物,耐热,DNA,聚合酶,dNTPs,含,Mg,2+,的缓冲液,PCR,的过程,变性,(Denaturing),:,经加热使模板,DNA,从,dsDNA,变成,ssDNA,退火,(Annealing),:,引物与模板,DNA,杂交,延伸,(Extension),:DNA,合成,ing,PCR,的头三个循环,基因组,DNA,的制备,(,Preparation of genomic DNA),从细胞或组织中提取的,基因组,DNA,可用于:,建立基因组文库；,克隆特定的基因；,用,Southern,印迹检测某一基因的存在和拷贝数；,用,PCR,反应检测基因的存在和突变等；,进行,RFLP(,限制性片段长度多态性,),分析,蛋白酶,K,和,SDS,可,破坏细胞膜,及细胞中的蛋白质，使,基因组,DNA,从破碎的细胞中释放出来。,酚/氯仿,去除,核酸溶液中的,蛋白质,以纯化,DNA,。,盐离子存在时,乙醇或异丙醇,沉淀基因组,DNA,以,浓缩,DNA。,从 1,g,哺乳动物组织或 10,9,培养细胞中可得到 2,mg,基因组,DNA。,从细菌或真菌中制备基因组,DNA,时,，首先用溶菌酶破坏,其细胞壁结构。,基因组,DNA,的制备原理,(1)细胞裂解,在 50,C,条件下用裂解缓冲液(100,mM NaCl；10 mMTris-Cl,pH,8.0；25 mM EDTA,pH 8.0；0.5%SDS；0.1 mg/ml,蛋白酶,K；,100,g/ml RNase A),消化组织细胞 16-18小时；消化培养细胞 2-3,小时。,(2)蛋白质淬取,用酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)淬取蛋白质。,(3)基因组,DNA,沉淀,用 0.1 倍体积的 3,M NaAC,和 2.5 倍体积的 100%乙醇沉淀,DNA,用 70%乙醇除去,DNA,沉淀中的盐离子。,(4)将基因组,DNA,溶解在,TE,缓冲液,中，使其终浓度为 1,mg/ml，,置,4,C,保存。,基因组,DNA,的制备方法,(1)防止内源性,DNase,应快速分离、剪切、匀降组织或快速洗涤培养细胞。一旦组织,被冷冻或培养细胞被加到裂解缓冲液中，,DNA,将免于被,DNase,降解。尽量将组织切得小一些，便于蛋白酶,K,和,SDS,快速、有,效的作用于组织块。,(2)保证得到高分子量的基因组,DNA，,以便于构建基因组文库。因,此，在制备基因组,DNA,过程中应减少物理机械作用，如不要使,用旋涡振荡仪等。,(3)保证基因组,DNA,不被蛋白质所污染，否则将影响限制性内切酶,对,DNA,的酶切作用。高纯度,DNA,的,OD,260,/OD,280,值大于 1.8；,50%蛋白质/50%,DNA,混合物的,OD,260,/OD,280,值大约为 1.5。,制备基因组,DNA,时的注意事项,小鼠基因组,DNA,1.,未被酶切的,DNA,2.HindIII,酶切产物,3.,MboI,酶切产物,1 2 3,基因组,DNA,的检测,总,RNA,的制备,(,Preparation of to