基因信息的传递.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,目 录,目 录,目 录,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,目 录,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,中心法则,DNA,RNA,蛋白质,复制,转录,翻译,逆转录,第三篇 基因信息的传递,DNA,的生物合成,(,复制,),DNA Biosynthesis,，,Replication,第 十 章,复制,(,replication),是指遗传物质的传代，以母链,DNA,为模板合成子链,DNA,的过程。,复制,亲代,DNA,子代,DNA,复制的基本规律,Basic Rules of DNA Replication,第一节,复制的高保真性,(high fidelity),复制的三个重要特点,半保留复制,(semi-conservative replication),双向复制,(bidirectional replication),半不连续复制,(semi-discontinuous replication),一、半保留复制的实验依据和意义,DNA,生物合成时，母链,DNA,解开为两股单链，各自作为模板,(template),按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的,DNA,，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的,DNA,都和亲代,DNA,碱基序列一致。这种复制方式称为,半保留复制,。,半保留复制的概念,子链继承母链遗传信息的几种可能方式,全保留式 半保留式 混合式,密度梯度离心,CsCl,溶液,形成密度梯度,加入样品,超速离心,(25Krpm),进行分离,超速离心,分离结果,密度梯度实验,实验结果支持,半保留复制,的设想。,含重氮,-DNA,的细菌,培养于普通培养液,第一代,继续培养于普通培养液,第二代,梯度离心结果,密度梯度离心对假设的支持与否定,按半保留复制方式，子代,DNA,与亲代,DN,A,的,碱基序列一致,，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的,保守性,。,半保留复制的意义,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但,不是绝对的,。,二、双向复制,原核生物复制时，,DNA,从,起始点,(origin),向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为,双向复制,。,复制中的放射自显影图象,A.,环状双链,DNA,及复制起始点,B.,复制中的两个复制叉,C.,复制接近终止点,(termination,ter),ori,ter,A B C,大肠杆菌染色质,DNA,复制的放射性自显影照片,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。,习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个,复制子,(replicon),。复制子是独立完成复制的功能单位。,5,3,ori,ori,ori,ori,5,3,5,5,3,3,5,5,3,复制子,3,三、复制的半不连续性,3,5,3,5,解链方向,3,5,3,3,5,领头链,(leading strand),随从链,(lagging strand),顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为,领头链,。,另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为,随从链,。复制中的不连续片段称为,岡崎片段,(okazaki fragment),。,领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的,半不连续性,。,DNA,复制的酶学,The Enzymology of DNA Replication,第二节,参与,DNA,复制的物质,底物,(,substrate,),:,d,ATP,dGTP,dCTP,dTTP,聚合酶,(polymerase):,依赖,DNA,的,DNA,聚合酶，简写 为,DNA-pol,模板,(template):,解开成单链的,DNA,母链,引物,(primer):,提供,3,-OH,末端使,dNTP,可以依次聚合,其他的酶和蛋白质因子,一、复制的化学反应,(dNMP),n,+,dNTP (dNMP),n+1,+,PPi,目 录,5,3,5,end,3,end,C,G,A,聚合反应的特点,DNA,新链生成需,引物,和,模板,；,新链的延长只可沿,5,3,方向进行。,二、,DNA,聚合酶,全称：,依赖,DNA,的,DNA,聚合酶,(DNA-dependent DNA polymerase),简称：,DNA-pol,活性：,1,.,5,3,的聚合活性,2.,核酸外切酶活性,5,A G C T T C A G G A T,A,3,|,3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5,3,5,外切酶活性,5,3,外切酶活性,?,能切除突变的,DNA,片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性,目 录,首先发现,DNA,聚合酶的,A.Kornberg,A.Kornberg,在端详,DNA,聚合酶模型,(,摄于,1965,年，斯坦福大学生物化学系,),A.Kornberg1959,年获得诺贝尔奖后全家福，摄于斯德哥尔摩。,各种,DNA,聚合酶的共同三维结构示意图,聚合酶活性中心,外切酶活性中心,（一）原核生物的,DNA,聚合酶,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,（一）原核生物的,DNA,聚合酶,功能,：,对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。,DNA-pol ,（,109kD,）,323,个氨基酸,小片段,5,核酸外切酶活性,大片段,/Klenow,片段,604,个氨基酸,DNA,聚合酶活性,5,核酸外切酶活性,N,端,C,端,木瓜蛋白酶,DNA-pol ,Klenow,片段是实验室合成,DNA,，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,DNA-pol,（,120kD,）,DNA-pol II,基因发生突变，细菌依然能存活。,它参与,DNA,损伤的应急状态修复。,功能,是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,DNA-pol ,(250kD),四个功能部分：,核心酶,-,催化核苷酸聚合和校正,亚基,-,套环，套住,DNA,复合体,-,加载,亚基,亚基,-,连接，具柔韧性,DNA-pol ,空间结构模型,（二）真核生物的,DNA,聚合酶,DNA-pol,起始引发，有引物酶活性。,延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在,线粒体,DNA,复制中起催化作用。,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,（二）真核生物的,DNA,聚合酶,三、复制保真性的酶学依据,复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。,复制保真性的酶学机制：,（一）复制的保真性和碱基选择,（二）,DNA-pol,的核酸外切酶活性和及时校读,（一）,DNA-pol,的聚合活性中心可以选择核苷酸,与新进入的正确核苷酸形成氢键，否则聚合活性大大降低。,一旦错配，,DNA,将掉入外切活性中心,聚合酶活性中心,外切酶活性中心,（二）,DNA-pol,的核酸外切酶活性和及时校读,A,：,DNA-pol,的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。,B,：碱基配对正确，,DNA-pol,不表现外切活性。,1.,遵守严格的碱基配对规律；,2.,聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；,3.,复制出错时,DNA-pol,的及时校读功能。,DNA,复制的保真性至少要依赖三种机制,四、复制中的分子解链及,DNA,分子拓扑学变化,DNA,分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把,DNA,解成单链，它才能起模板作用。,（一）解螺旋酶、引物酶和单链,DNA,结合蛋白,E.Coli,基因图,目 录,解螺旋酶,(,helicase),利用,ATP,供能，作用于氢键，使,DNA,双链解开成为两条单链,引物酶,(primase),复制起始时催化生成,RNA,引物的酶,单链,DNA,结合蛋白,(single stranded DNA binding protein,SSB),在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整,10,8,局部解链后,（二）,DNA,拓扑异构酶,(DNA topoisomerase),解链过程中正超螺旋的形成,目 录,拓扑异构酶作用特点,既能水解、又能连接磷酸二酯键,拓扑异构酶,拓扑异构酶,分 类,拓扑异构酶,切断,DNA,双链中,一股,链，使,DNA,解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，,DNA,变为松弛状态,。,反应,不需,ATP,。,拓扑异构酶,切断,DNA,分子,两股,链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。,利用,ATP,供能，连接断端，,DNA,分子进入负超螺旋状态。,作用机制,目 录,五、,DNA,连接酶,连接,DNA,链,3,-OH,末端和相邻,DNA,链,5,-P,末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的,DNA,链连接成一条完整的链。,DNA,连接酶,(DNA ligase),作用方式,HO,5,3,3,5,DNA,连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,目 录,DNA,连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。,在,DNA,修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。,也是基因工程的重要工具酶之一。,功能,DNA,生物合成过程,The Process of DNA Replication,第三节,（一）复制的起始,需要解决两个问题：,1,.,DNA,解开成单链，提供模板。,2.,合成引物，提供,3,-OH,末端。,一、原核生物的,DNA,生物合成,E.coli,复制起始点,oriC,GATTNTTTATTT,GATCTNTTNTATT,GATCTCTTATTAG,1 13 17 29 32 44,TGTGGATTA-,-TTATACACA-,-,TTTGGATAA-,-,TTATCCACA,58 66 166 174 201 209 237 245,串联重复序列,反向重复序列,5,3,5,3,DNA,解链,起始点,(oriC),的特殊序列,(1)DnaA,蛋白首先解链,DnaA,蛋白,结合,反向重复序列,更多的,DnaA,蛋白结合，引起,DNA,缠绕,DnaA,蛋白作用串联重复序列，引起,解链,(2)DnaB,蛋白解旋,DnaB,蛋白解旋,SSB,结合，保持单链,Dna A,Dna B,、,Dna C,DNA,拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,2,.,引发体和引物,含有解螺旋酶、,DnaC,蛋白、引物酶和,DNA,复制起始区域的复合结构称为引发体。,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链,RNA,分子。,引物,3,HO,5,引物酶,（二）复制的延长,复制的延长指在,DNA-pol,催化下，,dNTP,以,dNMP,的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,5,3,5,dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dTTP,dGTP,dATP,dCTP,OH 3,3,DNA-pol,目 录,复制过程简图,目 录,目 录,一个,DNA-poly,同时,指导两条子链合成,辛勤工作中的,DNA-poly,模式图,原核生物基因是环状,DNA,，双向复制的复制片段在复制的终止点,(ter),处汇合。,ori,ter,E.coli,82,32,ori,ter,SV40,50,0,（三）复制的终止,5,5,5,RNA,酶,OH,P,5,DNA-pol,dNTP,5,5,P,ATP,ADP+Pi,5,5,DNA,连接酶,随从链上不连续性片段的连接,目 录,哺乳动物的细胞周期,DNA,合成期,G,1,G,2,S,M,二、真核生物的,DNA,生物合成,细胞能否分裂，决定于进入,S,期及,M,期这两个关键点。,G1S,及,G2M,的调节，与蛋白激酶活性有关。,蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。,复制有时序性,，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。,复制的起始需要,DNA-pol,（引物酶活性）和,pol,（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子,(replication factor,RF),。,增殖细胞核抗原,(proliferation cell nuclear antigen,PCNA),在复制起始和延长中起关键作用。,（一）复制的起始,3,5,5,3,领头链,3,5,3,5,亲代,DNA,随从链,引物,核小体,（二）复制的延长,染色体,DNA,呈线状，复制在末端停止。,复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。,染色体两端,DNA,子链上最后复制的,RNA,引物，去除后留下空隙。,（三）复制的终止,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,目 录,目 录,切除引物的两种机制,目 录,端粒,(telomere),指真核生物染色体线性,DNA,分子末端的结构。,功能,维持染色体的稳定性,维持,DNA,复制的完整性,结构特点,由末端单链,DNA,序列和蛋白质构成。,末端,DNA,序列是多次重复的富含,G,、,C,碱基的短 序列。,TTTT,GGGG,TTTT,GGGG,正常端粒,(telomere),有关端粒对寿命的争论,Dolly,死于,6,岁,第一个克隆生物母羊多莉,(1996-2003),多莉与自己的幼崽,端粒酶,(telomerase),端粒酶,RNA(human telomerase RNA,hTR),端粒酶协同蛋白,(human telomerase associated protein 1,hTP1),端粒酶逆转录酶,(human telomerase reverse transcriptase,hTRT),组成,发现端粒酶的,Elizabeth Blackburn,端粒酶的工作方式,爬行模型,不同细胞中端粒的长短不同,干细胞,永生细胞,和癌细胞,衰老细胞,成熟细胞,逆转录和其他复制方式,Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways,第四节,逆转录酶,(reverse transcriptase),逆转录,(reverse transcription),RNA,DNA,逆转录,酶,一、逆转录病毒和逆转录酶,逆转录病毒细胞内的逆转录现象,RNA,模板,逆转录酶,DNA,-RNA,杂化双链,RNA,酶,单链,DNA,逆转录酶,双链,DNA,典型的逆转录病毒,HIV1,HIV1,由跨膜糖蛋白、病毒脂质膜、膜辅助蛋白、内核壳蛋白、,RNA,、逆转录酶组成,病毒感染过程,逆转录酶,A AA A,T T T T,AAAA,SI,核酸酶,DNA,聚合酶,碱水解,T T T T,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为,cDNA,法。,以,mRNA,为模板，经逆转录合成的与,mRNA,碱基序列互补的,DNA,链。,试管内合成,cDNA,cDNA,complementary DNA,二、逆转录研究的意义,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。,逆转录现象说明：至少在某些生物，,RNA,同样兼有遗传信息传代与表达功能。,对逆转录病毒的研究，拓宽了,20,世纪初已注意到的病毒致癌理论。,滚环复制,(rolling circle replication),三、滚环复制和,D,环复制,是某些低等生物的复制形式，如,X,174,和,M13,噬菌体等。,3,-OH,5,-P,5,5,5,3,3,3,3,5,滚环复制,5,5,3,3,5,目 录,dNTP,DNA-pol,D,环复制,(D-loop replication),是线粒体,DNA(mitochondrial DNA,，,mtDNA),的复制形式。,DNA,损伤（突变）与修复,DNA Damage(Mutation)and Repair,第五节,遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为,突变。,在复制过程中发生的,DNA,突变称为,DNA,损伤,(DNA damage),。,从分子水平来看，突变就是,DNA,分子上碱基的改变。,一、突变的意义,（一）突变是进化、分化的分子基础,（二）突变导致基因型改变,（三）突变导致死亡,（四）突变是某些疾病的发病基础,二、引发突变的因素,物理因素,紫外线,(ultra violet,UV),、各种辐射,UV,化学因素,目 录,三、突变的分子改变类型,错配,(mismatch),缺失,(deletion),插入,(insertion),重排,(rearrangement),框移,(frame-shift),DNA,分子上的碱基错配称,点突变,(point mutation),。,发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。,1,.,转换,发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。,2.,颠换,（一）错配,镰刀型红细胞贫血是一种点突变,血液中有大量镰刀型红细胞,血红蛋白彼此联结成纤维状,镰形红细胞贫血病人,Hb(HbS),亚基,N,-val,his,leu,thr,pro,val,glu,C,肽链,C,A,C G,T,G,基因,正常成人,Hb(HbA),亚基,N,-val,his,leu,thr,pro,glu,glu,C,肽链,C,T,C G,A,G,基因,镰刀型红细胞贫血其实是一种自然选择,疟疾在欧亚大陆的分布,镰刀型贫血在欧亚大陆的分布,（二）缺失,、,插入,和框移,缺失：,一个碱基或一段核苷酸链从,DNA,大分子上消失。,插入：,原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到,DNA,大分子中间。,框移突变,是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。,缺失或插入都可导致,框移突变,。,谷 酪 蛋 丝,5 ,G,C,A,G U A,C A U,G U C,丙 缬 组 缬,正常,5 ,G A G,U A C,A U G,U C,缺失,C,缺失引起框移突变,（三）重排,DNA,分子内较大片段的交换，称为重组或重排。,减数分裂时发生正常重组,重组错误引起的地中海贫血的基因型,目 录,四、,DNA,损伤的修复,修复,(repairing,),是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。,光修复,(light repairing),切除修复,(excision repairing),重组修复,(recombination repairing),SOS,修复,修复的主要类型,（一）光修复,光修复酶,(photolyase),UV,UvrA,UvrB,UvrC,OH,P,DNA,聚合酶,OH,P,（二）切除修复,是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由,DNA-pol,和连接酶完成。,DNA,连接酶,ATP,E.coli,的切除修复机制,目 录,（三）重组修复,(1),（三）重组修复,(2),（四）,SOS,修复,当,DNA,损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。,在,E.coli,，各种与修复有关的基因，组成一个称为,调节子,(regulon),的网络式调控系统。,这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过,SOS,修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而,DNA,保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。,本章完,