毛细管电泳法.ppt

,*,毛细管电泳法,在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为,电泳.,由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。,193,0,年，,Tiselins,(,瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，,第一次,将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和,、,、,球蛋白；发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；,1948年，,获诺贝尔化学奖,；,经典电泳分析,traditional electrophoresis,利用,电泳,现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。,按,形状分类,：,U,型管电泳、柱状电泳、板电泳；,按,载体分类,：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳；,传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。,1981年，,Jorgenson,和,Luckas，,用75,m,内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/,m，,促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与,GC、HPLC,相媲美的崭新的分离分析技术,高效毛细管电泳（,HPCE,）,。,高效毛细管电泳,high performance capillary electrophoresis,高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：,一是采用了0.05,mm,内径的毛细管柱；,二是采用了高达数千伏的电压。,毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。,电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加，,高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。,高效毛细管电泳的特点,1.仪器简单、易自动化,电源、毛细管、检测器、溶液瓶,2.分析速度快、分离效率高,在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1,min,内分离了24种阳离子；分离柱效：10,5,10,7,/,m,理论塔板数；,3.操作方便、消耗少,进样量极少，水介质中进行；,4.应用范围极广,有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；,分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；,毛细管电泳基础理论,电泳,是在电场作用下带电粒子在缓冲液中的定向移动,电泳淌度,：,带电离子在单位电场下的迁移速度；,淌度不同是电泳分离的基础。,HPCE,中的电渗现象与电渗流,石英毛细管柱，内充液,pH3,时，表面电离成-,SiO,-,管内壁带负电荷，形成双电层。,在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度,u,os,。,电渗流的大小,电渗流的大小用电渗流速度,u,os,表示，取决于电渗淌度,o,s,和电场强度,E。,即,u,os,=,o,s,E,电渗淌度取决于电泳介质及双电层的,Zeta,电势，即,o,s,=,0,0,真空介电常数；,介电常数；,毛细管壁的,Zeta,电势。,电渗流的方向,电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：,内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；,内表面带正负电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；,石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；,改变电渗流方向的方法：,（1）毛细管改性,表面键合阳离子基团；,（2）加电渗流反转剂,内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。,HPCE,中影响电渗流的因素,1.电场强度的影响,电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。,2.毛细管材料的影响,不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；,（1）溶液,pH,的影响,对于石英毛细管，溶液,pH,增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁,zeta,电势增大，电渗流增大，,pH=7，,达到最大,；,pH,电泳,时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于,差速迁移,被相互分离。,最基本、应用广的分离模式；,操作条件,1.,电压,2.,缓冲液的种类,较好的缓冲能力,在检测波长的吸收低,自身的淌度低，即分子大而荷电小,合适的,pH,与被测无的等电点相差,1,个,pH,单位,尽量使用酸性缓冲液，减少吸附和电渗流,4.,缓冲液的,pH,5.,添加剂,3.,缓冲液的浓度,1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带电的胶束。,在电场力的作用下，胶束在柱中移动。,胶束电动毛细管色谱,2.电泳流和电渗流的方向相反，且,u,电渗流,u,电泳,，负电胶束以较慢的速度向负极移动；,4.可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；,5.色谱与电泳分离模式的结合。,3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；,毛细管凝胶电泳,将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。,其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。,蛋白质、,DNA,等的电荷/质量比与分子大小无关，,CZE,模式很难分离，采用,CGE,能获得良好分离，,DAN,排序的重要手段。,特点,：抗对流性好，散热性好，分离度极高。,无胶筛分技术,：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。,毛细管电色谱,整合了毛细管电泳与微径液相色谱的优点，大大提高了样品的分离能力，,代表了分析学界高效微分离的趋势，尤其适用于复杂生物及化学体系的研究,样品在毛细管柱中的保留行为同时受到,电泳,及其在流动相与固定相之间,分配系数,的影响,pCEC,对被分离样品细微之处的分辩能力得到极大的提高,毛细管电泳仪,电压：030,kV；,分离柱不涂敷任何固定液；,紫外或激光诱导荧光检测器；,（可检测到：10,-19,10,-21,mol/L,）,仪器流程与主要部件,1.高压电源,（1）030,kV,稳定、连续可调的直流电源；,（2）具有恒压、恒流、恒功率输出；,（3）电场强度程序控制系统；,（4）电压稳定性：0.1%；,（5）电源极性易转换；,2.毛细管柱,（1）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机械性能差；,（2）规格：内径2075,m，,外径350400,m；,长度=1,m,3.缓冲液池,化学惰性，机械稳定性好；,4.检测器,要求：具有极高灵敏度，可柱端检测；,检测器、数据采集与计算机数据处理一体化；,类型 检测限/,mol,特点,紫外-可见 10,-13,10,-15,加二极管阵列，光谱信息,荧光 10,-15,10,-17,灵敏度高，样品需衍生,激光诱导荧光 10,-18,10,-20,灵敏度极高，样品需衍生,电导 10,-18,10,-19,离子灵敏，需专用的装置；,毛细管电泳的进样方式,1.流体力学进样方式,（1）进样端加压,（2）出口端抽真空,（3）虹吸进样,进样量：毛细管长度的1%-2%；纳升级、非常小,毛细管一端插入样品瓶，加电压；,2.电动进样方式,进样不均,：电歧视现象，淌度大的离子比淌度大的进样量大；,离子丢失,：淌度大且与电渗流方向相反的离子可能进不去；,特别适合黏度大的试样,；,3.扩散进样 试样通过扩散作用进入分离柱端口处。,应用,离子分析,阳离子分析,迁移方向和电渗流方向一致；,4.5,min,内分离了24种金属离子；,阳极进样，阴极检测；,具有很高的灵敏度；,阴离子分析,阴离子电泳方向和电渗流方向相反、速度接近，分析时间长、效率低；,质量小、电荷密度大的离子如：,SO,4,-2,、Cl,-,、F,-,等，电泳速率大于电渗流，阳极端流出，在阴极端无法检测；,加入电渗流改性剂，十六烷基三甲基溴化胺等，使电泳方向和电渗流方向一致，可在3.1,min,内分离36种阴离子；阴极进样，阳极检测；,离子价态及存在形态分析；,药物分析,检测体液或细胞中某些代谢产物的分析；,尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病的辅助手段；,采用毛细管区带电泳方式，在11,min,内分离17种药物；,氨基酸与蛋白质分析,采用,MEKC,模式，在25分钟内分离了23种丹酰化氨基酸；,HPCE,可取代传统的氨基酸分析仪；,问题：吸附和检测；,