生物分离工程电泳1.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Electrophoresis,1,电泳在生化分离中的应用,分离和纯化手段（实验室）,蛋白、酶、核酸纯化,基础理论研究,醋酸纤维薄膜电泳,分析血清蛋白,琼脂对流免疫电泳,分析病人血清，早期诊断肝癌,高压电泳,分离肽段，研究蛋白质一级结构；,凝胶电泳,技术分离分析酶，蛋白质，核酸,2,电泳原理,指,带电粒子,在,电场,中朝与自身带,相反电荷,的电极移动的现象,CATHODE,ANODE,+,-,-,+,3,带电颗粒,小离子：,Cl,-,甘氨酸离子,生物大分子：,蛋白质、核酸等,蛋白质,分子是由,氨基酸,组成的，而氨基酸带有可解离的,氨基,和,羧基,，是典型的两性电解质，在一定的,pH,条件下就会解离而带电,4,用支持体的电泳技术,1.,滤纸电泳,2.醋酸纤维薄膜电泳,3.薄层电泳,4.非凝胶性支持体区带电泳(淀粉，纤维素粉，玻璃粉，硅胶等),5.凝胶支持体区带电泳,(聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶),不用支持体的电泳技术,Tiselius或微量电泳,操作形式,：,1.,区带电泳,2.,等速电泳,3.,等电点电泳,电泳形式分类,5,电泳速度,v=EZe/(6r),+,-,-,Z，r,E,f,f,E:,电场强度,V/cm,Z:,溶质的荷电荷数,：,溶液粘度,e:1.6,10,-19,C,1.粒子在电场中所受的力:,f=EZe,2.粒子在液体中泳动所受的阻力：,根据,Stoke,定律,f=6rv,平衡时：,f=f,恒定泳动速度:,溶质的迁移率：,u,0,=v/E=Ze/(6r),6,影响泳动速度的因素-,1,带电,颗粒,的性质,所带,净电荷,的数量,颗粒,大小,形状,v,=EZe/,(6r),恒定泳动速度:,9,影响泳动速度的因素-,2,粒子的,pI,和溶液,pH,值,protein,白蛋白,2,球蛋白,球蛋白,球蛋白,pI,4.0,5.06,5.1,7.1,白蛋白,2,球蛋白,球蛋白,球蛋白,血清中的四种蛋白,pH8.6,的电泳缓冲液中电泳，泳动速度：,10,影响泳动速度的因素-,3,外加电流电压,U,，,E,，,v,(1),常压电泳:,U=100500V,，,E=210V,/,cm t=,几小时至数天 适合于分离,蛋白质等,大分子物质,(2),高压电泳：,U=5001000V,，,E=50200V,/,cm t=,几分钟 分离氨基酸，肽，核苷酸，糖类等,小分子物质,由于电压升高，电流也随之增大，故需冷却装置,v,=EZe/,(6r),恒定泳动速度:,11,影响泳动速度的因素-,4,溶液的离子强度,I=(c,i,z,i,2,)/2,保持足够,缓冲能力,前提下，,离子强度要最小,溶液的离子强度越高，带电颗粒泳动速度越,慢，反之越快,最适离子强度,0.02 0.2,12,影响泳动速度的因素-,5,电渗作用,在电场中液体对固体支持物的相对移动,滤纸电泳,Cellulose,pH=8.6,电泳血清蛋白,+,-,球蛋白,-,滤纸的纤维间,具有大量孔隙,带有负电荷,与带电颗粒一样可以,吸引正离子,介质向,阴极,移动,球蛋白:,颗粒大，净电荷少,13,电渗作用,石英毛细管电泳,Capillary Electrophoresis,pH3,内表面带负电,毛细管管壁分布有大量的硅烷醇（Si-OH）,阳离子被吸附在管壁而形成了双电层,V=V(,电渗流,)V(,电泳,),V(,正,)V(,中,)V(,负,),14,影响泳动速度的因素-,6,对支持物的选择,支持物均匀,，吸附力小，否则电场强度不均匀，影响区带的分离,琼脂糖和淀粉,在电场作用下易电离带负电荷，产生,电渗,流，应用范围受限制。,聚丙烯酰胺凝胶,常用。,15,Example 1,计划在,0.82,v/cm,的电位梯度下，用,凝胶电泳,的方法将,两种胞外蛋白质,分离开来，这两种蛋白质的,迁移率,分别为4.1,10,-5,和5.1 10,-5,cm,2,/V.s。,如果开始时混合物在凝胶上宽度为0.2,cm，,估计把这两种蛋白质,分开需多长时间,？在估算时，可忽略扩散的影响。,u,0,=v/E=eZ/（6r）,解：溶质的迁移率为：,16,凝胶电泳,17,凝胶电泳法,铸 胶,电 泳,染色,脱色,凝胶电泳,样本处理,Trypsin,浓缩层胶体,分,离层胶体,取出,胶体,染 色,脫 色,18,Pierce,商品供应预铸胶片,梯度或固定浓度胶体,10,12.15,样本槽,中性 pH,缓冲液,拋弃式塑料外壳,胶体,1 mm 厚,度,19,不连续凝胶电泳系统组成,1,电泳系统,pH,胶体浓度,缓冲液,上,层,(,负极,),缓冲液,2,样本溶液,3,浓缩层胶体,6.8,4,分,离层胶体,胶,体,5,下,层,(正,极,),缓冲液,Tris-,HCl,Tris-,HCl,Tris-,glycine,Tris-,glycine,Tris-,glycine,8.3,8.3,8.3,8.3,5%,7.520%,-,-,-,胶体不连续性有浓缩样品的作用,20,浓缩层内的等速电泳,21,浓缩层胶体中的三个主要作用角色,Glycine:,Negative charged,No net charge,Chloride ion:,Proteins:,小分子,大分子,22,SDS Gel Elecrtophoresis,23,SDS-PAGE,测定蛋白质相对分子量,PAGE,凝胶电泳分离、检测蛋白质,根据蛋白质分子大小、形状及净电荷,在,PAGE,中加入一定量的,SDS,蛋白质分子的迁移速度主要取决于分子量大小,24,SDS-PAGE,测定蛋白质相对分子量,SDS,：阴离子去污剂、水溶液中以单体和分子团存在。,能破坏蛋白质分子之间及与其他分子间的非共价键，形成带负电荷的蛋白质,-SDS,复合物，使蛋白质丧失了原有电荷状态，形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团。,25,SDS-PAGE,测定蛋白质相对分子量,操作：,分离胶,12%,浓缩胶,5%,加样,电泳,染色、脱色,凝胶干燥,确定分子量,26,样品分子量的确定,M,为蛋白质分子量、,m,相对迁移率、,b,为斜率、,K,为截距。,一定条件下,K,和,b,为常数，根据迁移率可求得分子量。,lgM,w,=b*m,R,+K,蛋白质分子量在,15000-200000,之间时，电泳迁移率与分子量的对手呈线性关系：,27,样品分子量的确定,相对迁移距离,=,蛋白质迁移距离,/,燃料迁移距离,以标准蛋白质相对分子量的对数,(lgM,r,),为纵座标，相对迁移距离为横座标作图，得到标准曲线。,28,三种不同性质蛋白质的电泳比较,Molecular,Weight,pI,Native,PAGE,SDS-,PAGE,Mobility,Protein,Quaternary,Structure,X,Y,Z,Tetramer,(40,000)x4,Monomer,88,000,Monomer,60,000,5.8,5.2,9.3,Fast,Slow,Medium,Slow,Upward,Fast,X,Y,Z,-,-,+,29,单元体分子量的测定：,SDS-PAGE,0.5 1.0,kD,330,220,67,60,36,18.5,kD,94,67,43,30,20.1,14.4,Mol mass,kD,300,200,100,80,60,50,40,30,20,10,Migration(R,f,),Pharmacia:Molecular Markers for electrophoresis,30,