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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,维生素D临床知识,&产品培训,目录,博晖维生素D试剂盒介绍,1,2,3,维生素D检测临床意义,维生素D检测指南与方法,一、维生素D检测临床意义,1,、维生素,D,简介,2,、维生素,D,生理功能,3,、维生素,D,与疾病,（,1,）理化性质,（,2,）代谢过程,4,1、维生素D简介,维生素,D,是一种,脂溶性维生素,，,维生素,D,与动物骨骼的钙化有关,故又称为钙化醇。,也被看作是一种作用于钙、磷代谢的,激素前体,，它与阳光有密切关系，所以又叫“,阳光维生素,”。维生素,D,是一族,A,、,B,、,C,、,D,环结构相同，但侧链不同的一类复合物的总称，目前已知的维生素,D,至少有,10,种，但,最重要的是维生素,D,2,（麦角骨化醇）和维生素,D,3,（胆钙化醇）,。,维生素,D,易被紫外光破坏，因此，含维生素,D,的试剂均应避光保存,。,（,1,）理化性质,维生素,D,2,是紫外线照射植物中的麦角固醇产生，在自然界存在较少。,维生素,D,3,则由大多数高级动物的表皮和真皮内含有的,7-,脱氢胆固醇经紫外线照射转变而成。,维生素,D,2,维生素,D,3,（,1,）理化性质,机体主要的,调节因子,：,1,25(OH),2,D,3,本身,甲状旁腺激素,血清钙和磷的浓度,维生素D的,分解代谢,主要在肝脏，代谢物进入胆汁入肠，随粪便排出。,在体内，维生素D主要,储存,在脂肪组织与骨骼肌中，肝脏、大脑、肺、脾、骨骼和皮肤中也存在少量。,（2）代谢过程,维生素,D,肝脏,25-,羟化酶,25,（,OH,）,D,肾脏,1-,羟化酶,1,，,25,（,OH,）,2,D,血,P,（,）,（,）,血,Ca,（,）,（,）,（,+,）,血,P,PTH,（,+,）,血,Ca,(),CT,（,+,）,(+),（2）代谢过程,（,1,）,调节钙磷代谢,（,2,）调节细胞分化,（,3,）调节免疫力,11,2、生理功能,调节钙磷代谢：,维生素D与甲状旁腺素共同作用，维持血钙水平稳定。这对,正常骨骼的矿化、肌肉收缩、神经传导以及体内所有细胞的功能都是必需的,。,生理循环圈起点为甲状旁腺内钙受体对钙的识别。当血钙水平下降时，甲状旁腺分泌PTH，刺激肾25-OH-D-12-氧化酶从25-OH-D,3,储存池中转化更多的1,25-(OH),2,D,3,。,随PTH水平的升高，1,25-(OH),2,D,3,增加，导致肠、骨和肾中钙转运增多，促进钙在肾小管的重吸收，将钙从骨骼中动员出来，在小肠促进结合蛋白质的合成，增加钙吸收，最终使血钙恢复正常水平。,（1）调节钙磷代谢,调节钙磷代谢：,这个过程均由甲状旁腺的钙受体进行识别。,PTH分泌减少不仅是由钙活性反馈，也可由与,1,25-(OH),2,D,3,有关短反馈环路直接抑制甲状旁腺分泌PTH,。,当血钙过高时，促进甲状旁腺产生降钙素，阻止钙从骨髓中的动员，增加钙磷经尿中排出。,维生素D缺乏将导致25-(OH)D,3,和,1,25-(OH),2,D,3,的合成减少，钙内环境出现失衡,并且要不断地提高PTH的水平，表现为继发性甲状旁腺功能亢进,。,（1）调节钙磷代谢,与细胞生长和分化的关系：,近年来的研究资料表明，正常皮肤成纤维细胞和表皮细胞都有VD受体，VD缺乏大鼠的皮肤颗粒细胞层变薄，角蛋白改变和细胞内酸性磷酸酶活性降低等。,VD,3,可抑制培养的小鼠角化细胞和正常人表皮细胞的增殖，并诱导其分化,。也有资料表明VD3有抑制白血病细胞株M1增殖并诱导使之分化为成熟的单核细胞，延长动物存活时间的作用。,VD,3,对其他肿瘤细胞也有明显的抗增殖和诱导分化的作用,。,（2）调节细胞生长和分化,对免疫系统功能的调节：,单核/巨噬细胞是非特异性免疫反应的主要防御机制。体外实验证明,VD3可促使白血病细胞、骨髓干细胞和外周血单核细胞向巨噬细胞转化，并增强单核细胞和巨噬细胞的吞噬活性及杀菌能力,。,VD缺乏,的,人和动物对非特异性炎症刺激的反应能力有明显的降低,，而且有吞噬活性和趋化功能障碍。,（3）调节免疫,维生素,D,的各种功效都是由其受体调节的。维生素,D,受体除了在肠和骨中表达外，还在脑、前列腺、乳房、结肠、免疫细胞、血管平滑肌和心肌细胞中表达。,参考文献,1)Holick MF.Vitamin D deficiency.N Engl J Med 2007;357;266-81,2)Wang T J et al.Vitamin D deficiency and risk of cardiovascular disease.circulation 2008;117;503-511,体内维生素,D,水平不足与非骨骼性疾病的风险增加有相关性，包括：心血管疾病、高血压、癌症、糖尿病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、传染性疾病等。,参考文献,1)Holick MF.Vitamin D deficiency.N Engl J Med 2007;357;266-81,2)Wang T J et al.Vitamin D deficiency and risk of cardiovascular disease.circulation 2008;117;503-511,3、维生素D与疾病,（1）佝偻病、手足搐搦症,（2）骨软化病,（3）骨质疏松,（4）维生素,D,中毒,病 因,1,、,日光照射不足,主要病因,2,、,VitD摄入不足,3,、,生长速度快,4,、,药物等,5,药物影响,（1）佝偻病、手足抽搐症,20,VitD,CaP ,骨样组织钙化障碍且继续增殖,骨骺端钙化障碍,骺线参差不齐,钙化带增厚,或,毛刷样、杯口样改变,骨样组织堆积,骨骺端膨出,肋骨串珠,手镯、脚镯,骨干钙化障碍,骨质疏松,弯曲变形,（,郝氏沟、“,O”,、“,X”,腿,）,病理性骨折,扁平骨钙化障碍,颅骨软化,骨样组织堆积,方颅,病,理,（1）佝偻病、手足抽搐症,胸部：多见于,1,岁左右小儿,.,肋骨串珠,鸡胸,郝氏沟,漏斗胸,上述畸形均使胸腔变小，影响呼吸功能,.,临床表现,（1）佝偻病、手足抽搐症,四 肢,腕踝,6,个月以上小儿,手镯、脚镯,下肢,1,岁以上小儿,“O”“X”,型腿,（1）佝偻病、手足抽搐症,（1）佝偻病、手足抽搐症,全身肌张力下降，骨骼肌：（坐、站、走晚）,腹肌肌张力下降，呈,蛙腹,（1）佝偻病、手足抽搐症,神经兴奋性改变：,脑皮层功能减低的表现,条件反射形成慢,表情淡漠,语言发育落后,免疫力低下：,易合并感染、且易迁延、反复,（1）佝偻病、手足抽搐症,血生化改变明显,血,Ca,稍下降,血,P,明显下降,25,（,OH,）,D,3,1,，,25,（,OH),2,D,3,X,线改变,：,长骨,骨骺软骨明显增宽,2mm,干骺端钙化带消失，呈,毛刷样、杯口样改变,骨质普遍稀疏，密度减低,骨干可有弯曲,或骨折,CaP,明显下降,AKP,明显升高,辅,助,检,查,（1）佝偻病、手足抽搐症,辅助检查,（1）佝偻病、手足抽搐症,治,疗,（一）维生素,D,制剂：,口服法,维生素,D 20004000 IU/d,（,50100 ug/d,),1,25(OH),2,D,3,(,罗钙全,)0.52.0 ug/d,（,2080 IU/d,）,一个月,后改为预防量,(,400 IU/d,),肌注法：适合重症、不能口服者,VitD,3,：,2030,万,IU,初期：,1,次,激期：,23,次，间隔,24,周,23,月后,给预防量。,注意同时用钙剂,（1）佝偻病、手足抽搐症,（二）钙剂治疗,肌注,VitD,时,有搐搦者,食物中钙量不足者,适应症,（三）矫形治疗,治,疗,（1）佝偻病、手足抽搐症,3,、,婴儿期：,口服,400800 IU/d,（不可间断）,4,、幼儿期：,夏季增加户外活动，可不用,VitD,冬季（,10,月中旬）,南方：,1020,万,IU,（肌注）,北方：,2040,万,IU,（肌注）,（1）佝偻病、手足抽搐症,31,（2）骨软化病,骨软化病,由于成人缺乏维生素,D,及钙质引起,骨基质矿化障碍,，以,骨质软化和骨骼畸形为特征。病人多为女性,。,临床表现,骨痛,活动常受限，步态摇摆、步行困难，,病理性骨折，长骨、肋骨、骨盆和脊柱骨均可发生,胸廓两侧内陷，胸腔缩小,两侧肋缘可及髂嵴或其间距明显缩短。,骨盆三叶畸形，,身高缩短，可达cm以上。,（2）骨软化病,骨质软化症,X,线表现,早期普遍性,骨质疏松，密度减低，骨皮质变薄，严重者呈线条状,。,髓腔透亮度增加,。骨小梁先是模糊，最终消失，可出现多个囊状透光区。,（2）骨软化病,2.假骨折是骨质软化症的X线特点（称为,Looser带,）。表现为,横越骨皮质的透明线,，其边缘密度略高，,常呈对称而多发,。多见于肩胛骨、肋骨、坐骨、耻骨等。骨折处无骨痂形成和错位，日久可出现骨骼弯曲畸形。,（2）骨软化病,骨质软化症,X,线表现,骨质软化症,X,线表现,假骨折，,Looser,带,（2）骨软化病,双凹征,骨质软化症,X,线表现,（2）骨软化病,治疗,维生素D缺乏,补充维生素D,维生素D,3,400800IU,一般不超过每日4000IU,增加钙磷摄入,（2）骨软化病,VDDRI,1,25,双羟维生素,D,3,（罗钙全）,1.0g/,日,维生素,D,2,20,000-100,000U/,日或,25,羟维生素,D,（,0.1-1.0mg/,日）,增加钙磷摄入：钙剂,1-1.5,克,/,日,（2）骨软化病,正常骨 骨质疏松骨,以骨强度受损,导致骨折危险性升高为特征的骨骼疾病。骨强度主要反映了骨密度和骨质量两个方面的综合特征。,NIH Consensus Development Panel on Osteoporosis.,JAMA,285(2001):785-95,（3）骨质疏松,40,（3）骨质疏松,（3）骨质疏松,临床表现,骨痛（腰背酸疼痛）,骨折,身高缩短，骨骼畸形,功能障碍（活动受限）,（3）骨质疏松,骨质疏松常见骨折,椎体骨折,桡骨远端骨折,髋部骨折,肱骨外科颈骨折,38%,19%,19%,（3）骨质疏松,防治药物,骨吸收抑制剂 骨形成促进剂,钙剂 氟化物,维生素D 甲状旁腺素,二膦酸盐 维生素D,降钙素 合成类固醇,雌激素,选择性雌激素受体调节剂,（3）骨质疏松,发病机理：血浆中25（OH）D,3,水平过高，而不是1,25（OH）,2,D,3,水平升高造成。高维生素D血症病人血中25（OH）D浓度可比正常个体高15倍，但是他们的1,25（OH）,2,D,3,水平没有显著变化。,短期多次大剂量维生素D治疗,维生素D预防剂量过大,误诊佝偻病错误治疗,45,（4）维生素D中毒,诊断：,维生素D过量病史,早期血钙升高：高于3mmol/L,X线检查：软组织钙化,46,（4）维生素D中毒,二、维生素D检测指南与方法,1、维生素D检测指南,2、维生素D检测方法,1、维生素D检测指南,（1）维生素D缺乏诊断程序,（2）建议维生素D缺乏危险人群饮食补充维生素D,（3）维生素D治疗和预防策略,内分泌学会2011年6月6日发表,维生素D缺乏评估、治疗和预防的临床实践指南,全文见Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism与,内分泌学,该指南针对不同年龄段、不同疾病背景的维生素,D,缺乏高危、低危人群，进一步明确了维生素,D,缺乏的有效评估、饮食补充和药物预防治疗的具体实施方法，指明了维生素,D,在非血钙受益上的不确定性，旨在达到维生素,D,缺乏防治的最优化,内分泌学会2011年6月6日发表,维生素D缺乏评估、治疗和预防的临床实践指南,指南认为。维生素D缺乏的高危人群（例如西班牙裔、黑种人、,妊娠妇女和肥胖个体,等）应当接受维生素D水平筛查。外周血血清,25-,羟基维生素,D,水平,低于,20ng/ml,者应被诊断为维生素,D,缺乏。,全文见Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism与,内分泌学,内分泌学会2011年6月6日发表,维生素D缺乏评估、治疗和预防的临床实践指南,全文见Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism与,内分泌学,指南中写道，现有的所有证据均表明，儿童和成人预防佝偻病或骨软化的最低血,25-,羟维生素,D,水平应为,20 ng/ml,，但为了增强维生素,D,对钙、骨骼以及肌肉代谢的积极影响，血,25-,羟维生素,D,的水平应高于,30 ng/ml,。,指南推荐的维生素D缺乏的诊断程序：,推荐对于有维生素D缺乏危险者，采用,可靠方法检测其血清循环25-羟维生素D25（OH）D水平，以评价患者体内的维生素D状况,。,维生素D缺乏,定义为25（OH）D水平低于20 ng/ml（50nmol/L）,。,不推荐使用血清1，25二羟维生素D,1，25（OH）,2,D检测评价维生素D缺乏，仅在监测特定情况如获得性和遗传性维生素D和磷酸盐代谢紊乱时应用,52,（1）维生素D缺乏诊断程序,25,（,OH,）,D,是血液循环中维生素,D,最主要的存在形式,，半衰期,23,周，是监测维生素,D,状态的最佳指标。,1,25,（,OH,）,2D,在血液中浓度比,25,（,OH,）,D,低,1000,倍,，,半衰期约,4,小时，且对,PTH,、钙、磷的调控非常敏感，,1,25,（,OH,）,2D,不能反映维生素,D,的储备水平,，血清,1,25,（,OH,）,2,D,在维生素,D,缺乏时经常是正常的甚至升高，因此检测其浓度对于监测病人的维生素,D,的状态没有帮助。,（1）维生素D缺乏诊断程序,维生素D缺乏评估、治疗和预防的临床实践指南,建议维生素,D,缺乏危险人群饮食补充维生素,D,（2）建议补充维生素,D,维生素D缺乏评估、治疗和预防的临床实践指南,建议维生素,D,缺乏危险人群饮食补充维生素,D,（2）建议补充维生素,D,维生素D缺乏评估、治疗和预防的临床实践指南,建议维生素,D,缺乏危险人群饮食补充维生素,D,（2）建议补充维生素,D,建议维生素,D,缺乏危险人群饮食补充维生素,D,（2）建议补充维生素,D,每IU=25ng,建议维生素,D,缺乏危险人群饮食补充维生素,D,（2）建议补充维生素,D,维生素D可耐受维持量的,上限：,-即除医生建议外均不可超过的限量,维生素D缺乏评估、治疗和预防的临床实践指南,治疗和预防策略,（3）治疗和预防策略,维生素D缺乏评估、治疗和预防的临床实践指南,治疗和预防策略,（3）治疗和预防策略,维生素D缺乏评估、治疗和预防的临床实践指南,治疗和预防策略,（3）治疗和预防策略,（3）治疗和预防策略,2、维生素D检测方法,（1）体内维,D,水平含量与意义,（2）检测维生素D的方法,64,体内血中,25-,羟维生素,D,水平,含量与意义,据估计，全世界大约10亿人未达到维生素D足量浓度的最低限30,ng/ml,（1）体内维,D,水平含量与意义,临床常见方法,几种方法学对比,ELISA,的两种产品对比,65,检测维生素D的方法,（2）检测维生素D的方法,（1）酶联免疫法（ELISA）：IDS、BH,（2）化学放光免疫法（CLIA）：雅培、索灵、贝克曼等,（3）电化学发光法（ECLI）：罗氏,66,1、临床常见方法,（2）检测维生素D的方法,酶联免疫法,使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。,使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。,用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。,加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。,由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。,67,2、几种方法学对比,（2）检测维生素D的方法,化学发光标记免疫分析：,又称化学发光免疫分析(CLIA),是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物acridinium ester(AE),其通过起动发光试剂作用而发光,强烈的直接发光在一秒钟内完成,为快速的闪烁发光。,灵敏度和精确度比酶免法、荧光法高几个数量级，可以完全替代放射免疫分析、彻底淘汰酶联免疫分析。主要具有灵敏度高、特异性强、试剂价格低廉、试剂稳定且有效期（6-18个月）、方法稳定快速、检测范围宽、操作简单自动化程度高等优点。,68,2、几种方法学对比,（2）检测维生素D的方法,电化学发光技术：在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，用电化学发光剂三联吡啶钌Ru(bpy),3,2+,标记Ab，通过Ag-Ab反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度对待测的Ag或Ab进行定量/定性。,高度敏感，可达pgml或pmol水平；,特异性强，重复性好，CV5。,测定范围宽，可达7个数量级。,试剂稳定，无毒害，无污染，有效期长，达数月至数年。,操作简单，耗时短，易于自动化。,在对环保很重视的国家，CLIA成了取代RIA的首选方法。,69,2、几种方法学对比,（2）检测维生素D的方法,70,免疫标记检测技术对比,（2）检测维生素D的方法,IDSvsBH：.exl,重复性：批内、批间,时间：,71,3、ELISA的两种产品对比,（2）检测维生素D的方法,三、博晖维生素D试剂盒介绍,博晖公司维生素,D,3,检测原理,维生素,D,3,检测试验准备与流程,维生素,D,3,检测试验步骤与数据分析,维生素,D,3,检测操作规范及注意事项,（,1,）,ELISA,简介,（,2,）维生素,D,3,检测中竞争法应用原理,73,1、,博晖公司维生素D,3,检测原理,定义与原理,ELISA,又叫酶联反应，是一种免疫测定。基础,:,抗原或抗体的固相化,及,抗原或抗体的酶标记,。加入酶反应的底物后，,底物被酶催化成为有色产物,，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。,ELISA,可用于测定抗原，也可用于测定抗体。,（,1,）酶联反应简介,在这种测定方法中有三个必要的试剂：,1,、固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）,2,、酶标记的抗原或抗体（标记物）,3,、酶作用的底物（显示计）,可设计出各种不同类型的检测方法,ELISA,检测法必要试剂,（,1,）酶联反应简介,常用,ELISA,类型,夹心法,竞争法,双抗体夹心法,双抗原夹心法,BH100,检测原理为：双抗体夹心法,25-OH-,维生素,D,3,检测：竞争法,（,1,）酶联反应简介,竞争法：是利用待测抗原和酶标抗原与特异性抗体竞争结合，或待测抗体和酶标抗体与特异性抗原竞争结合而进行测定的一种方法,竞争法示意图,（,2,）维生素,D,3,检测中竞争法应用原理,25-OH-VD,3,试剂盒（酶联免疫法,-,竞争法），定量测定人体血清中的,25,羟基维生素,D,3,，校准品、质控品、样品均被样品稀释液稀释，稀释后的样品和辣根标记的,25,羟基维生素,D,3,抗原在包被了鼠单克隆抗体的微孔中温育,1,小时后洗版，然后利用,TMB,显色。终止反应后利用酶标仪读取吸光度值。颜色的强度和,25-OH-VD,3,的浓度成反比。,北京博晖公司研发的,25-OH-VD,3,试剂盒原理概述,（,2,）维生素,D,3,检测中竞争法应用原理,79,2、,维生素D,3,检测试验准备与流程,（,1,）,BH,公司,VD,3,检测试剂盒,（,2,）自备材料与设备,（,3,）试剂准备,（,4,）维生素,D,3,检测实验流程,25-,羟基维生素,D,3,检测试剂盒包含内容,注：试剂盒在,2-8,摄氏度，有效期一年,（,1,）,BH,公司,VD,3,检测试剂盒,0.5ml,及以上的玻璃或聚丙烯微量离心管；,注意：聚苯乙烯试管不适合，不要重复使用试管。,高精度加样器（10,ul,、,和,200ul,）以及对应枪头,旋涡震荡器；,自动洗板机（可选择）；,酶标仪和数据分析装置；,适用于具有,450nm,、,630nm,波长的所有全自动和半自动酶标仪,恒温培养箱或恒温水浴箱。,（,2,）自备材料与设备,定标血清和质控血清：定标血清和质控血清以冻干品的形式提供，使用前复溶于,500ul,蒸馏水,中。盖紧瓶盖，室温下放置,10-15min,，期间颠倒摇晃几次，使其充分溶解，保存于,2-8,一周。,工作洗涤液：,将浓缩洗涤液用蒸馏水稀释,20,倍后备用,。,其他试剂直接使用,-,所有试剂使用之前应该平衡至,室温,并反复颠倒混匀。,（,3,）试剂准备,1-6-,试剂与样本配制与准备；,7-13-,实验操作步骤,14-15-,数据检测,（,4,）维生素,D,3,检测实验流程,样品,N,孔，质控,2,孔，定标血清,5,孔,6,：酶标板排版,5,：标准品五系列配制,10uL,样品血清,+,400稀释液（,4,1倍稀释）,4,：样品配制,10uL,复溶质控血清,+,400稀释液（,4,1倍稀释）,3,：质控品配制,25,uL,复溶定标血清,+1,000,uL,稀释液。（,4,1倍稀释）,2,：标准品母液配制,复溶,：,定标血清、质控高、中值血清干粉,+,500ul,蒸馏,水,1,：复溶干粉,（,4,）维生素,D,3,检测实验流程,（,4,）维生素,D,3,检测实验流程,86,3、维生素D,3,检测试验步骤与数据分析,（,1,）维生素,D3,检测实验步骤,（,2,）维生素,D3,检测数据分析,试剂的复溶或准备见“试剂准备,”,。,1,）准备玻璃管或聚丙烯管并做好标记，每个定标血清、质控血清和样本对应一个管。,a,定标血清的稀释：将对应的试管中加入,1000,ul,样本稀释液，然后加入,25ul,复溶的定标血清（浓度,100ug/L,），即用样本稀释液,4,1,倍稀释，置于旋涡混合器上混合,10,秒。,其余,4,个定标点,80ug/L,、,40ug/L,、,20ug/L,、,0ug/L,用,40,倍稀释好的,100ug/L,的定标血清按表,1,进行稀释：,（,1,）检测试验操作步骤,质控血清和样本的稀释：用样本稀释液分别将质控血清和样本,4,1,倍稀释，例如每个试管中加入,400,ul,的样本稀释液，然后分别加入对应编号的,10ul,质控血清和样本，置于旋涡混合器上混合,10,秒。如稀释的总量不同，可参照表,2,进行稀释：,（,1,）检测试验操作步骤,2,）于相应的酶标板微孔中加入,50ul,已稀释好的定标血清、质控血清或样本，再加入,50ul,的酶工作液。贴上封口胶，于,37,条件下孵育,1,小时。,（粉色）,（,1,）检测试验操作步骤,图示：加酶后显色,（,1,）检测试验操作步骤,3,）用工作洗涤液洗板,5,次，,a,手动洗版：迅速将板颠倒倒出孔内物，每孔加入,300ul,工作洗涤液，,b,自动洗版：设置洗板机分配每孔至少,300ul,工作洗涤液。,注：在进入下一步前，于吸水纸上用力拍打倒置的板以除去多余的工作洗涤液,（,1,）检测试验操作步骤,洗板机 清洗包被板 示意图,（,1,）检测试验操作步骤,4,）每孔加入,50ul,的底物液,A,和,50ul,的底物液,B,，贴上封口胶，于,37,下孵育，恒温水浴箱中反应时间为,10,分钟，恒温培养箱或恒温鼓风干燥箱中反应时间为,15,分钟。,图示：加底物液后颜色变为蓝色,（,1,）检测试验操作步骤,图示：酶标仪检测读数,5,）每孔加入,50ul,终止液。在加入终止液后立即于,450nm,、,630nm,波长处读取吸光度。,（,1,）检测试验操作步骤,维生素,D,3,检测试验数据案例,浓度,=LN(OD,值,/3.3317)/-0.0165,（,2,）实验数据分析,数据记录和计算方法,数据处理软件,人工处理数据,人工数据处理步骤和方法,1,、,excel,抄录酶标仪数据,2,、选中全部数据，插入散点图,（,2,）实验数据分析,鼠标点击曲线,右键,-,选择添加趋势线,（,2,）实验数据分析,X=LN(Y/5.4619)/-0.4244,（,2,）实验数据分析,【,参考值（参考范围）,】,本公司采用的参考值范围：,19-57.6ug/l,（,47.5-144nmol/L,）,每个实验室应建立自己的参考范围,，本试剂盒检测结果仅作为辅助诊断手段之一，供临床医生参考。,（,2,）实验数据分析,【,检验结果的计算与解释,】,根据,5,个定标液数值，绘制标准曲线：以,OD,值为纵坐标，,25-OH-D,3,浓度为横坐标,，进行,指数曲线拟合,。,R,不小于,0.990,，,质控数值波动在正负,20%,。根据标准曲线和每个样本检测的,OD,值，在标准曲线上找到对应的,25-OH-D,3,浓度值（,ug/l,或,nmmol/L,）。,1,、,57.6ug/l,（,144nmmol/L,），说明,25-,羟基维生素,D,3,充足。,（,2,）实验数据分析,【,检验方法的局限性,】,1,、本试剂盒测定范围为,5-100ug/l,（,12.5-250nmmol/L,）。,超出试剂盒测定范围的测定结果,是通过校准品曲线外延得出的计算结果，,不作为准确定量数据,。使用前应先对样本进行稀释。诊断结果应结合患者的临床症状和医师其他的实验室检查进行分析。,2,、,加完终止液后应立即在酶标仪,450nm,、,630nm,处读数,（,2,）实验数据分析,（,1,）维生素,D,3,检测操作规范,（,2,）维生素,D,3,检测注意事项,4,、维生素,D,3,检测操作规范及注意事项,实验前,复温：将试剂及所需数量的微孔反应条和冻在冰箱内的血清标本置室温平衡（,20-25,）十分钟以上。,仪器准备：洗板机、酶标仪、,恒温设备开启（,37,度）,洗涤液准备：蒸馏水配制洗涤液,1,：,19,稀释,标本：血清或血浆（当天最好）,（,1,）维生素,D,3,检测操作规范,实验中,复温：将试剂及所需数量的微孔反应条置室温平衡，试剂样品使用前必须达到室温（,20-25,）后才能使用，未用完的板条应立即用封片封好，,避光冷藏保存,；,复溶：质控品、定标品冻干粉用,500ul,蒸馏水,复溶,五浓度标准品配制：五个系列定标品浓度的配制,(,见说明书,),4,1倍稀释：,4,1倍血清样本的稀释和质控品的稀释,微孔板上排序有序，设好标准位，样品位，质控位,加样：加稀释后的样品，质控品，定标品,50uL,（,1,）维生素,D,3,检测操作规范,实验中,加酶液：加入酶液,50,微升，加入酶液时,避免吸头接触孔壁及孔内样本,，即垂直而不碰避。,如有接触，请更换吸头,；最后并加贴封片,孵育：恒温培养箱或恒温水浴箱均为,1,小时,洗板：在第一步孵育结束后，小心将封片揭下并弃掉，,用洗板机洗涤,5,次，拍干,。或,手洗（手洗前先倒掉孔中液体，洗,5,次，每次放置,30,秒，每次倒掉液体后需拍干包被板）,（,1,）维生素,D,3,检测操作规范,实验中,加显色液：每孔中加入,50,微升显色液,A,，再每孔加入,50,微升显色液,B,。,恒温培养箱孵育,15,分钟或恒温水浴箱中,10,分钟，第二次孵育结束后，小心将封口胶揭开。,加入终止液：加液过程中避免碰到小孔边缘或其中的试剂，尽量避免污染。,在,5,分钟内,上机（酶标仪）检测,，时间太久，会有沉定生成，影响检测结果。,（,1,）维生素,D,3,检测操作规范,一、标本的采取和保存影响因素,血清：标本采集管选用，标本采用普通干燥管、普通生化管、速凝生化管，静脉穿刺法采集静脉血，,不能采用有分离胶的管,，因分离胶含某些蛋白质，干扰抗原抗体反应，引起假阳、假阴性结果。,（,2,）维生素,D,3,检测,注意事项,一、标本的采取和保存影响因素,样品采集后应尽快分离血清，应注意避免溶血。一般说来，标本放置于,2-8,冰箱可保存,3,天,，,超过,3,天测定的需分离血清并,-20,低温冰存,。但反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装再冰存。,冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀、宜轻缓动作，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。,标本尽量是当天新鲜标本，尽量避免溶血，脂血，黄疸标本。放置几天的陈旧标本血清，因,D,3,分解，可能导致结果误差较大。,（,2,）维生素,D,3,检测,注意事项,二、常见标本性状影响因素,脂血，即高甘油三脂胆固醇的血，脂蛋白可以结合亲脂成分，对抗原抗体的结合产生屏蔽作用，从而干扰免疫检测结果。,溶血黄疸。尽量避免溶血和黄疸，这些标本会产生部分过氧化物酶，影响实验，造成假阴,某些药物也会影响检测结果，如：口服避孕药、本巴比妥、大仑丁、保泰松等,。,标本间的污染要尽量避免，尤其不应予生化试验用同一管标本，最起码应先做免疫后做生化。,样本存放应当避光,（,2,）维生素,D,3,检测,注意事项,三、试剂保存与使用方面影响因素,正确保存试剂盒，并在有效期内使用。按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。,ELISA,用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。,（,2,）维生素,D,3,检测,注意事项,四、实验过程中注意事项,（各项操作严格按照说明书进行）,准确配制洗涤液。,20,倍稀释浓缩洗涤液,，不能用原洗板机上其它厂家洗涤液,复溶干粉静置时间必须,10-15,分钟以上,，让其自然充分溶解，然后用手混匀，达到均一性,各项稀释严格按照说明书进行，稀释后的标本用,混匀器混匀或用手摇匀,。并一定用记号笔记下样本编号,（,2,）维生素,D,3,检测,注意事项,四、实验过程中注意事项,（各项操作严格按照说明书进行）,加样前，设计好定标品、质控品及样品位置并严格执行，酶联反应板存在边缘效应，定标品、质控品孔位设计上，尽量居中，尽量避开包被板四周边第一排,恒温箱或水浴箱,37,度必须稳定，用温度计测量确认温度适合并稳定，过高过低都将影响实验结果,注：必须保证包被板全部浸入水中孵育,（,2,）维生素,D,3,检测,注意事项,四、实验过程中注意事项,（各项操作严格按照说明书进行）,加标本：一般用精确的微量加样器，将所加物,贴壁加在板孔的底部,1/3,处,，避免加在孔壁上部，并注意加样用力的,均匀性,和手法的,统一性,，不可溅出，不可产生气泡。每次加标本应,更换吸嘴,，以免发生交叉污染；,干吸头预先在血清中抽吸二三次,（,2,）维生素,D,3,检测,注意事项,四、实验过程中注意事项,（各项操作严格按照说明书进行）,加酶标液与,TMB,时：为避免污染应,弃掉第一管,，加样时滴头应在微孔,中部的上方,，避免与微孔板边缘或其中的试剂接触即“垂直而不碰壁”,加显色液时，避免吸头接触孔避及孔内样本。如有，必须更换吸头，以防污染试济影响结果。并加贴封片。,加完终止液后，必须在,5,分钟内读取,OD,值，否则因反应孔内沉淀影响结果,（,2,）维生素,D,3,检测,注意事项,北京博晖创新光电技术股份有限公司,Beijing BoHui Innovation Technology Co.,Ltd.,网址：,www.bohui-,全国免费客服热线：,800-810-1294,地址：北京市海淀区北坞村路甲,25,号静芯园,G,座,谢谢！,