发酵工艺条件确定.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第六章 发酵工艺的控制,第一节 发酵过程的主要控制参数,第二节 培养条件的确定,第三节 菌体浓度的影响及其控制,第四节 基质的影响及其控制,第五节 温度的影响及其控制,第六节 pH的影响及控制,第七节 溶氧的影响和控制,第八节 二氧化碳的影响及其控制,第九节 补料的作用和控制,第十节 泡沫的作用和控制,第十一节 染菌的防治,发酵工艺过程，不同于化学反应过程，它既涉及生物细胞的生长、生理和繁殖等生命过程，又涉及生物细胞分泌的各种酶所催化的生化反应过程。,发酵工程是生物应用工程学科，是微生物学在工业生产领域的大规模应用，是化学工程在生物技术领域的延伸，是生物、化学和工程等学科的综合利用。,第一节 发酵过程的主要控制参数,1.物理参数,（1）温度,（）,直接影响发酵过程的酶反应速率，氧的溶解度和传递速率，菌体生长速率和合成速率。,（2）压力,（Pa）,影响发酵过程氧和CO,2,的溶解度，正压防止外界杂菌污染。罐压一般控制在0.2,10,5,0.510,5,Pa。,（3）搅拌速度,（r/min）,搅拌器在发酵过程中的转动速度。,其大小影响发酵过程氧的传递速率，受醪液的流变学性质影响，还受发酵罐的容积限制（见下表）,发酵罐容积(L),搅拌转速范（r/min）,备注,3,2002000,实验室研究,10,1501000,实验室，小试,50,100800,中试,200,50400,中试或生产,10000,25200,生产,50000,25160,生产,（4）搅拌功率,（kW）,搅拌器搅拌时所消耗的功率（kW/m,3,），在发酵过程中的转动速度。,其大小与液相体积氧传递系数有关。,（5）空气流量,（,m,3,空气,/（m,3,发酵液,min）,）,单位时间内单位体积发酵液里通入空气的体积，一般控制在0.51.0（,m,3,空气,/（m,3,发酵液,min,）,（6）粘度,（Pas）,细胞生长或细胞形态的一种标志，反映发酵罐中的菌丝分裂情况，表示菌体的浓度。,（7）浊度,（）,反映应单细胞生长情况,（8）料液流量,（L/min）,进料参数,（5）产物浓度,（g（u）/ml）,检验发酵是否正常与否的重要参数，,是决定发酵周期长短的根据.,（6）废气中的氧浓度,（Pa）,废气中的氧浓度与发酵微生物的摄氧率和K,L,a有关，以此确定发的供氧能力。,（7）废气中的CO,2,浓度,（%）,根据废气中的氧浓度和CO,2,浓度，以此计算产生菌的呼吸商，了解产生菌的呼吸代谢规律。,3.生物参数,（1）菌丝形态,菌丝形态是衡量种子质量、区分发酵阶段、控制发酵过程的代谢变化和决定发酵周期的依据之一。,（2）菌体浓度,菌体浓度是控制微生物发酵的重要参数之一。生产上，常常根据菌体浓度来决定补料量和供氧量，以保证生产达到预期水平。,根据菌体浓度研究菌体比生长率，基质比消耗率等动力学参数，以此确定最佳发酵工艺。,第二节发酵过程中的代谢变化,代谢变化反映了菌体生长、发酵参数和产物生成速度的关系。,Gaden把微生物发酵过程分为三种类型：,型，生长产物合成偶联型：,微生物的生长和糖的利用与产物合成直接相关连，产物的形成与生长是平行的，产物合成速度与微生物生长速度呈线性关系，而且生长与营养物的消耗成准定量关系。产物直接来源于产能的初级代谢。,如酒精、葡萄糖酸、乳酸发酵就属于此类型,型，生长产物合成半偶联类型：,产物的合成来自次级代谢，存在着与生长相联和不相联两个部分，先是基质消耗和菌体生长高峰，后是菌体进入生长静止期，出现产物形成高峰。,如柠檬酸、谷氨酸、赖氨酸、依康酸、丙酮、丁醇发酵,型，生产与产物合成非偶联类型：,菌体生长和产物合成完全分开的，如各种抗生素和微生物毒素等物质的生产速率很难与生长相联系。产物合成速度与碳源利用也不存在定量关系。,产物的合成是在菌体的浓度达到最高之后才开始的，,如青霉素、链霉素、核黄素、糖化酶的发酵。,型，生长产物合成偶联型：,型，生长产物合成半偶联类型：,型，生产与产物合成非偶联类型：,1.初级代谢的代谢变化,初级代谢是生物细胞在生命活动中进行的代谢活动，初级代谢产物是菌体生长繁殖所必需的。,初级代谢菌体生长过程呈现延滞期、对数期、静止期和死亡期。除对数期的微生物外，其他时期的微生物作为发酵种子均会出现延滞期。,延滞期的长短还会受菌体的生理状态和发酵条件的影响。,初级代谢,型发酵产物与菌体生长成平行关系；,型发酵产物受基质成分、温度、溶氧、菌株影响较大。,下面以谷氨酸发酵为例加以说明,型发酵产物乳酸的生长速率与产物的比生产速率Q,p,几乎同时达到峰值。,型发酵产物谷氨酸,生长速率比产物的比生产速率Q,p,几稍快些。,2.次级代谢产物的代谢变化,次级代谢产物包括大多数抗生素、生物碱、微生物毒素等,属于,型,发酵,，即生产与产物合成非偶联类型。,发酵分为完全分开的菌体生长阶段，产物合成阶段，和菌体自溶三个阶段。,（1）菌体生长阶段,（发酵前期或平衡期）,碳源和氮源等进行分解代谢，基质不断被消耗，菌体不断繁殖，菌浓不断增加；,菌体摄氧率增加，溶解氧浓度下降，菌体达到临界浓度时，氧浓度达最小；,pH发生一些变化，或先升后降，或先降后升；,发酵体系出现某一限制因子，菌体生长速率下降，中间代谢产物大量积累；,菌体生理发生变化，与次级代谢相关的酶被解除控制，菌体进入产物合成阶段。,（2）产物合成阶段,（分泌期或发酵中期）,发酵过程中代谢变化如下：,菌体达到临界浓度，菌体基本不繁殖，但细胞内含物仍在增加，菌体干重增加；总DNA含量达定值；,基质继续被消耗，产物不断被合成，代谢仍然包括基质的分解代谢和产物合成代谢；但菌体的呼吸强度不变；,环境条件对产物合成很敏感，需严加控制温度，pH/，基质浓度和溶解氧浓度；,基质浓度不能过高或过低，过高则会引起菌体繁殖，过低会加速菌体老化；,（3）菌体自溶阶段,（自溶期或发酵后期）,发酵过程中代谢变化如下：,菌体细胞衰老，细胞开始自溶；,氨氮含量增加，pH上升；,产物合成能力衰退，生产速率下降；,发酵一旦进入自溶阶段必须结束，否则产物会被破坏，还会给后续工艺带来困难。,第三节 菌体浓度的影响及其控制,菌体细胞浓度,（cell concentration）,是指单位体积醪液中菌体的含量，反映菌体细胞的多少、菌体的分化阶段，与菌体的生长速率有密切关系。,1.影响菌浓的因素,（1）微生物种类,菌体的繁殖速率与微生物的自身遗传特性有关，取决于细胞结构的复杂性和生长机制。典型的细菌、酵母、霉菌和原生动物的倍增时间为：,细菌45分钟,酵母90分钟,霉菌3小时,原生动物6小时,（2）基质浓度,由Monod关系式 得出，生长速率取决于基质浓度。,当基质浓度S10,K,s,时，比生长速率就接近最大值。,基质抑制效应,：,所有营养物质均存在一个上限浓度，在此限度内，菌体的比生长速率随浓度增加而增加，但超过此浓度，浓度继续增加会引起生长速率下降的现象（可能时基质浓度过高，形成高渗透压，引起细胞脱水而抑制微生物生长）。,一些营养物质的上限浓度为：,NH,4,+,5g/L，,PO,4,3-,10g/L，,葡萄糖 100g/L,（3）其他环境条件,温度,pH值,渗透压,水分活度,2.菌浓度对发酵的影响,（1）对代谢产物得率的影响,初级代谢发酵产物与菌浓成正比关系，,R,p,=Q,pm,X，,如氨基酸、维生素，菌浓越大，产率越高；,（2）对溶解氧的影响,菌浓越大，能提高摄氧率,（OUR），,使摄氧率按比例增加（,OURQ,O2,X,），,菌浓越大，表观粘度增加，降低氧传递速率（,OTR,），使溶解氧减少。,3,.菌浓的控制,控制基质浓度，,调节基质组成；,中间不料控制（补加磷酸盐提高菌浓）。,第四节 基质的影响及其控制,基质即培养微生物的营养物质，供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质混合物。,基质的种类和浓度与发酵代谢有着密切关系，控制基质的种类和浓度是提高代谢产物的重要方法。,1.碳源的种类和浓度,快速利用碳源,能迅速参与代谢、菌体繁殖、产生能量，并产生分解代谢产物（如丙酮酸），有利于菌体生长。,缓慢利用碳源,多为聚合物，为菌体缓慢利用，有利于延长产物合成，特别有利于延长抗生素发酵的分泌期，,乳糖（青霉素发酵），蔗糖（头孢菌素C发酵），麦芽糖（盐霉素发酵），玉米油（核黄素发酵），半乳糖（生物碱碱发酵）。,糖对青霉素生物合成的影响,糖的缓慢利用是青霉素合成的关键因素，缓慢滴加葡萄糖可以代替乳糖，这里的乳糖是青霉素合成缓慢利用碳源，并非前体物质。,生产实践中,，通过动力学研究方法或经验性方法 确定补糖时间，补糖量，补糖方式，提高产率；通常采用速效碳源和缓慢利用碳源混合碳源。,2.氮源的影响和控制,氮源构成微生物细胞和代谢产物中氮素的营养物质，可补充碳源，是发酵的主要原料之一。也有迅速利用氮源和缓慢利用氮源。,缓慢利用氮源,：主要为有机氮源，黄豆饼粉，玉米浆，棉籽饼粉，蛋白胨，酵母粉，鱼粉，菌丝体，酒糟,。具有延长次级代谢产物分泌期，提高产量的作用。,迅速利用氮源：,主要为无机氮源，氨水，硫酸铵，氯化铵，硝酸盐，具有调节pH值的作用；速效氮源容易被菌体吸收利用，促进菌体生长，但对产物合成具有调节作用，影响产量。,生产上发酵培养基一般选用含有快速和慢速利用混合氮源，如链霉素发酵采用硫酸铵和黄豆饼粉。方法有：,（1）补加有机氮源,，如尿素，既可做氮源也可做pH调节剂。,（2）补加无机氮源,，最常用的是氨水和硫酸铵，前者为碱性，后者为生理酸性盐。,3.磷酸盐浓度的影响和控制,磷,是构成核酸，蛋白质等细胞物质的组成成分，是许多辅酶和高能磷酸键的成分，氧化磷酸化的必需元素。,微生物可生长的磷酸盐浓度为0.32300mmol/L；,微生物次级代谢合成最高的磷酸盐浓度为1mmol/L；,金霉素炼霉菌四环素发酵最适菌体生长磷浓度6570g/L；最适合成四环素磷浓度2530g/L；,青霉素发酵以0.01磷酸二氢钾最佳；,另外，其他成分也会影响发酵得率，可根据各菌种生理特性因地制宜的控制。,第五节 温度的影响及其控制,1.温度的影响,（1）影响微生物各种酶催化反应的速度和蛋白质的性质；,微生物可生长的温度范围较广，总体说在-1095。在生物学范围内温度每升高10，生长速度通常就加快一倍；温度每升高10酶反应速度增加23倍；,菌体生长的酶反应和产物合成酶反应温度往往是不同的，因而发酵过程的温度直接影响产率；,金霉素链霉菌四环素发酵时，30一下时金霉素增多，35时只生产四环素；,（2）影响发酵液的物理性质,如粘度，基质和氧在发酵液中的溶解度和传递速率，基质的分解和吸收速率，进而影响产物合成。,2.影响发酵温度的因素,发酵液的温度变化受生物热、搅拌热、蒸发热、辐射热 和显热的影响，用公式表示为,Q,发酵,Q,生物,+Q,搅拌,Q,蒸发,Q,辐射,Q,显,（,1）生物热,生物热是菌体在生长繁殖过程中产生的热能，来自菌体的分解代谢，生物热的大小域菌种、培养基成分和菌体的呼吸强度有关。,培养基愈丰富，生物热愈大；,细胞数量愈多，生物热愈大；,呼吸强度愈高，生物热愈大。,（2）搅拌热,搅拌器转动引起的液体之间和液体与设备之间的摩擦所产生的热量，用公式表示,Q,搅拌,=3600（P/V）,P/V是通气条件下单位体积发酵液所消耗的功率（kW/m,3,）,3600为热功当量（kJ/（kWh）,（3）蒸发热、显热和辐射热,空气进入发酵罐，与醪液充分混合，引起水分蒸所需的热能为,蒸发热,水分蒸发、进气和废气排出因温度差异所带走的部分热能为,显热,发酵罐外壁与大气间的温度差异使发酵罐中的部分热能通过罐体向大气辐射的热能为,辐射热,3.温度的控制,（1）最适温度的选择,最适发酵温度使既适合菌体生长，有适合代谢产物合成的温度。,最适菌体生长温度和最适产物合成的温度往往不一致。如,乳酸链霉菌发酵生产乳酸，最适菌体生长温度为34，最适产物合成温度为30；,青霉素发酵，产黄青霉最适菌体生长温度为30，最适产物合成温度为24.7；,最适发酵温度随菌种、基质成分、培养条件和菌体生长阶段而；,理论上讲，发酵过程可以设置不同的发酵温度时段，包括菌体生长发酵温度和产物合成发酵温度等。,生产上，由于发酵液体积大，少则几十立方米，多则上百上千立方米，升降温度时间长，难度大，通常采用一个发酵温度。,（2）温度的控制,发酵罐在发酵过程中一般不需加热，选用微生物能承受稍高一些的温度进行生长和繁殖，这对生产有很大的好处，即可减少污染杂菌的机会和夏季培养所需降温的辅助设备，因此培养耐高温的菌种有一定的现实意义。,生产中，温度的控制是采用冷却水通入发酵罐的蛇管或夹套中，热交换保持恒温发酵的。,第六节 pH的影响及控制,pH的影响,培养基中的pH值与微生物生命活动有着密切关系，各种微生物有其可以生长的和最适生长和最适生产的pH范围。一般微生物的最适生长pH范围为：,细菌：pH7.08.0,放线菌：pH7.58.5,酵母菌：pH3.86.0,霉菌：pH4.05.8,藻类：pH6.07.0,原生动物：pH6.08.0,pH是微生物代谢的综合反映，又影响代谢的进行，所以是十分重要的参数。,发酵过程中pH是不断变化的，通过观察pH变化规律可以了解发酵的正常与否,发酵过程的pH控制,一、发酵过程pH变化的原因,1、基质代谢,（1）糖代谢 特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一,（2）氮代谢 当氨基酸中的-NH,2,被利用后pH会下降；尿素被分解成NH,3,，pH上升，NH,3,利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。,（3）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降,2,、,产物形成,某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液,pH,变化。如有机酸类产生使,pH,下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使,pH,上升。,3、,菌体自溶,，,pH,上升，发酵后期，,pH,上升。,二、pH,对发酵的影响,例,pH,对林可霉素发酵的影响,林可霉素发酵开始，葡萄糖转化为有机酸类中间产物，发酵液pH下降，待有机酸被生产菌利用，pH上升。若不及时补糖、(NH,4,),2,SO,4,或酸，发酵液pH可迅速升到8.0以上，阻碍或抑制某些酶系，使林可霉素增长缓慢，甚至停止。对照罐发酵66小时pH达7.93，以后维持在8.0以上至115小时，菌丝浓度降低，NH,2,-N升高，发酵不再继续。,发酵15小时左右，pH值可以从消后的6.5左右下降到5.3，调节这一段的pH值至7.0左右，以后自控pH，可提高发酵单位。,1、实例,pH,7.0,t,不调pH,调pH,效价,pH,发酵过程的pH控制,例：,培养基初始pH值对漆酶分泌的影响,pH在47范围内产酶最高,2、pH对发酵的影响,（1）pH影响酶的活性。当pH值抑制菌体某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻,（2）pH,值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行,（3）pH,值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用,（4）pH影响代谢方向,pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。例如黑曲霉在pH23时发酵产生柠檬酸，在pH近中性时，则产生草酸。,谷氨酸发酵，在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺,3、pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响,生长,合成,pH对菌体生长影响比产物合成影响小,例,青霉素：菌体生长最适pH3.56.0,产物合成最适pH7.27.4,四环素：菌体生长最适pH6.06.8，产物合成最适pH5.86.0,X,pH,四环素,4,、,最佳pH的确定,配制不同初始pH的培养基，摇瓶考察发酵情况,pH对产海藻酸裂解酶的影响,pH对海藻糖水解酶产生的影响,pH,菌浓,pH,酶活,pH对谷氨酰胺转氨酶活力的影响,三、pH的控制,1、调节好基础料的pH,。,基础料中若含有玉米浆，pH呈酸性，必须调节pH。若要控制消后pH在6.0，消前pH往往要调到6.56.8,2、在基础料中加入维持pH的物质,，,如,CaCO,3,，或,具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等,3、通过补料调节pH,在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料。在补料与调pH没有矛盾时采用补料调pH,如（1）调节补糖速率，调节空气流量来调节pH,(2)当NH,2,-N低，pH低时补氨水；,当NH,2,-N低，pH高时补(NH,4,),2,SO,4,4、当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH,分别在4种缓冲介质中，于pH 650一950测定天冬酰胺酶酶活力,1 甘氨酸介质pH 8.00时酶活力最高；,2 硼酸在pH 850，酶反应最快,3 磷酸,在pH 850，酶反应最快,4 Tris,在pH 850，酶反应最快,酶活1243,5、不同调pH方法的影响,天冬酰胺酶,不同pH控制方式对目的突变株ISw330异亮氨酸摇瓶发酵的影响，结果如图所示。“1”表示只加CaC0,3,控制pH值，“2”表示只加尿素控制，“3”表示CaC0,3,和尿素联合控制pH值,。,异亮氨酸发酵,例,：pH对L-异亮氨酸发酵的影响,（天津科技大学）,菌株最适生长pH控制在6.87.0,6、发酵的不同阶段采取不同的pH值,不同pH值对菌体的形态影响很大，当pH值高于75时，菌体易于老化，呈现球状；当pH值低于65时菌体同样受抑制，易于老化。而在72左右时，菌体是处于产酸期，呈现长的椭圆形；在69左右时，菌体处于生长期，呈“八”字形状并占有绝对的优势。,pH69时，菌体生长旺盛，pH715时，对菌体的产酸有利。因此，在发酵的产酸期产酸较高。采用阶段pH控制模式进行发酵，在发酵中前期控制pH6.9，到48h后pH值为715，到80h后pH值为725。产率2227g/L，产酸率提高1223。,例：,克拉维酸发酵中pH变换控制,问题的提出：,在pH低时菌体生长受抑制，在高pH时克拉维酸要分解,用2.5升罐进行的不控制pH的发酵发现，前期由于微生物产生的酸性副产物和有机酸使pH降至6.5。在达到最高细胞浓度后，pH开始从6.5升至8.3。CA产量达最高水平时，pH不再升高。在发酵终止时，pH再次升至8.5。随着pH升高，CA迅速分解。,研究不同pH对发酵的影响,分别配置pH为6.0，7.0，8.0的培养基测定菌的生长和产物合成,pH6.0时，生长受抑制，产物降解少,pH8.0时生长良好,产量低，产物降解,pH7.0时的状况,控制pH7.0和8.0时，最高细胞浓度接近相同(约16PMV)，但控制pH60时细胞生长受抑制。,在25升生物反应器内，,不控制pH时247g(m1h),控制pH7.0时的产率337g(m1h)最高,控制pH8.0时，产率202g(m1h),在控制pH60时，CA产生被抑制,但降解少,因此对细胞生长和CA产生最好将pH控制于7.0，但在控制pH7.0时，仍出现CA的迅速分解。,由于CA生产的最适pH和减少CA分解的pH各不相同，因此在分批发酵中应用了pH变换策略，使发酵pH由中性pH70变换为酸性pH6.0。,在发酵前期，在细胞生长和产生CA期间控制pH7.0，4d后，当CA产量达最高值时，变换pH为6.0，以减少CA分解。最高CA浓度可保持24h。由于改变pH，使CA分解速率明显降低。,pH控制是一项非常细致的工作，不仅考虑最佳pH值，而且要根据生长阶段考察对pH的要求。在pH控制中还要采用合适的调节方法。,总结,小 结,发酵过程pH会发生变化,变化原因,基质代谢,产物形成,菌体自溶,对发酵的影响,pH,pH影响酶的活性,pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变,pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离,pH影响代谢方向,pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响,pH的控制方式,基础培养基调节pH,在基础料中加入维持pH的物质,通过补料调节pH,当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH,发酵的不同阶段采取不同的pH值,选择合适的pH调节剂,微生物代谢产物的合成也有最适pH范围为，青霉素合成最适pH为6.56.8。,pH对发酵液或代谢产物产生影响，会影响产物的稳定性。,发酵过程中，控制发酵液的pH值是控制生产的指标之一，pH值过高、过低都会影响微生物的生长繁殖以及代谢产物的积累。,控制pH值不但可以保证微生物良好的生长，而且可以防止杂菌的污染。在发酵工业中，维持适宜的pH已成为生产成败的关键因素之一。,第七节 溶氧的影响和控制,溶氧(DO)是需氧微生物生长所必需。在发酵过程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成为,控制,因素。,在28氧在发酵液中的100的空气饱和浓度只有,0.25 mmol.L-1,左右，比糖的溶解度小,7000,倍。在对数生长期即使发酵液中的溶氧能达到100空气饱和度，若此时中止供氧，发酵液中溶氧可在,几秒（分）钟之内,便耗竭，使溶氧成为限制因素。,微生物对氧的需求,发酵液中氧的供给,影响,Kla,的,因素（供氧的调节）,与溶氧相关的参数测定,发酵过程中溶氧监控的意义,比耗氧速度或呼吸强度（QO2）：单位时间内单位重量的细胞所消耗的氧气，mmol O2g菌-1h-1,摄氧率(r)：单位时间内单位体积的发酵液所需要的氧量。mmol O2L-1h-1。,r=QO2.X,一、微生物对氧的需求,C,Cr,Q,O,2,C,L,C,Cr:,临界溶氧浓度,指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度,。,微生物对氧的需求,一般对于微生物：,C,Cr:,115%饱和浓度,例：,酵母 4.6*10,-3,mmol.L,-1,1.8%,产黄青霉 2.2*10,-2,mmol.L,-1,8.8%,定义：,氧饱和度发酵液中氧的浓度/临界溶氧溶度,所以对于微生物生长，只要控制发酵过程中氧饱和度1.,问题：,一般微生物的临界溶氧浓度很小，是不是发酵过程中,氧很容易满足。,例：以微生物的摄氧率0.052 mmol O,2,L,-1,S,-1,计，,0.25/0.052=4.8秒,注意：由于产物的形成和菌体最适的生长条件，常常不一样,：,头孢菌素 卷须霉素,生长 5%(相对于饱和浓度）13%,产物 13%8%,品种,测定水温,窒息点（mmol/l),相当于,鲤鱼,29,0.09-0.01,4%,鲢鱼,27,0.01-0.02,4-8%,鲫鱼,29,0.004,2%,氧对鱼类的影响,胡隐昌，水产养殖,2003,影响需氧的因素,r=Q,O,2,.X,菌体浓度,Q,O,2,遗传因素,菌,龄,营养的成分与浓度,有害物质的积累,培养条件,二、反应器中氧的传递,（一）、发酵液中氧的传递方程,C,C,i,P,P,i,气膜,液膜,N：传氧速率 kmol/m,2,.h,k,g,:气膜传质系数 kmol/m,2,.h.atm,K,l,:液膜传质系数 m/h,C*P*H,与气相中氧分压相平衡的液体中氧的浓度,K,l,:以氧浓度为推动力的总传递系数(m/h),再令：单位体积的液体中所具有的氧的传递面积为 a(m,2,/m,3,),N,v,：体积传氧速率 kmol/m,3,.h,K,la,:以(C*-C)为推动力的体积溶氧系数 h,-1,（二）、发酵液中氧的平衡,发酵液中供氧和需氧始终处于一个动态的平衡中,传递：,消耗：,r=Q,O,2,.X,氧的平衡最终反映在发酵液中氧的浓度上面,（三）、供氧的调节,C有一定的工艺要求，所以可以通过Kla 和C*来调节,其中C*P*H,Nv,H,P,Kla,调节Kla是最常用的方法，,kla反映了设备的供氧能力,。,45升 1吨 10吨,搅拌速度 250 rpm 120 120,供氧速率 7.6 10.7 20.1,不同的设备供氧能力不一样,三 影响Kla的因素,Kla反映了设备的供氧能力。,发酵常用的设备为：摇瓶,发酵罐,（一）、影响摇瓶kla的因素,为装液量和摇瓶机的种类,摇瓶机,往复，频率80-120分/次，振幅8cm,旋转，偏心距25、12,转述250rpm,装液量，一般取1/10左右：,250ml 15-25 ml,500ml 30 ml,750ml 80 ml,例：,500 ml 摇瓶中生产蛋白酶，考察装液量对酶活的影响,装液量 30 ml 60ml 90ml 120ml,酶活力 713 734 253 92,（二）、影响发酵罐中Kla的因素,已知在通风搅拌发酵罐中，全挡板条件下：,1、理论上分析,KLa,n,d,通气量,提高搅拌，调节kla的效果显著,例,某一产品的发酵,d n p,0,/v c 产量,450 180 1.62 20%4978,450 280 2.12 40%5564,550 180 2.61 60%8455,例,黑曲霉生产糖化酶,n 230 230 270,通气比 1:0.8 1:1.2 1:0.8,产量 1812 2416 2846,提高d、n显著提高C,提高了产量,提高N,比提高Q有效,2、实际上：,对于转速的调节有时是有限度的,通风的增加也是有限的,蒸发量大,中间挥发性代谢产物带走,例：,红曲霉生产色素用于食品工业，静止培养改为通气培,养，比色法测定产量：,通气 静止 1.4 2.0 3.1 6.8 19.5,OD 0.28 0.7 8.3 15.6 14.3 6.2,提高,下降,所以这些因素的存在，发酵设备的供氧是有限的,3、小型发酵罐和大型发酵罐调节kla的特点,小型发酵罐，转速可调,大型发酵罐，转速往往不可调,大型反应器的合理设计,对现有设备一定要注意工艺配套,4、生物反应器放大的基本思想,小型反应器和大型反应器的差异：,传动,传热,传递,生物反应过程,剪切、混合、供氧,箭叶,平叶,不同搅拌浆对菌体浓度的影响,发酵过程中搅拌转速和溶氧的变化,平叶,箭叶,箭叶：在4h左右溶氧就从90的下降到14.8%，通过不,断提高转数DO水平始终维持在20%左右。,平叶：在8h左右才下降到23.43%;中后期DO水平则,一直在40%以上。,平叶,箭叶,庆大霉素的生产水平提高了40%以上,计算流体力学,发酵过程放大困难的原因就在放大时不可能同时做到几何相似、流体运动学相似和流体动力学相似，当在小试研究时某一个对生产产生影响的重要因素没有被观察到，而这个因素恰恰在放大时成为关键因子时，就会造成整个发酵过程的失败(供氧、混合、剪切）,。,根据,r,Kla,、,搅拌桨特性,搅拌功率,根据,r,、,菌体细胞剪切,搅拌器形式、转速等,;,搅拌器的混和计算流体力学的应用研究,;,大型发酵罐高功率搅拌器的加工与动平衡，,传动装置技术和整体罐结构设计研究,;,。,张嗣良，中国生物工程杂志，2005,根据,r,Kla,、,搅拌桨特性,搅拌功率,Kla,N,D(搅拌功率）,Q（通气量）,大 小,小 大,5、影响Kla的其它因素,空气分布器,液体的粘度,氧载体,通过在发酵液中引入一种新的液相，以减少气液传氧阻力，从而提高传氧效率(Menge et al.,2001;Lowe et al.,1998)。这种液相一般具有比水更高的溶氧能力，且与发酵液互不相溶，称为氧载体oxygen-vector)。通常使用的氧载体主要有:液态烷烃、油酸、甲苯、全氟化碳、豆油等。,溶氧水平提高，虾青素合成增加,四 溶氧浓度的变化及其控制,一、典型的分批发酵中氧浓度的变化规律（一定Kla下）：,r,X,Q,C,L,一般有一个低谷，在对数生长的末期,华东理工大学学报，2000,OUR=r：摄氧率 TEMP：温度,AGIT：搅拌转速 DO：溶氧浓度,结论：,当OUR(r)与DO反向变化时,表明其限制因素为细胞水平的菌体代谢问题,当OUR(r)与DO同向变化时,表明其限制因素为工程水平的氧传递问题。此时溶氧处于临界氧以下(这一结论)可客观地、动态地把握临界氧水平及氧平衡的制约因素。,1、溶氧控制的策略,微生物反应:,X,S P+X,=a+b,菌体生长期：,酶系统,酶系统,关键因子,开始的细胞,生长好后的细胞,产物合成,产物形成期：,底物,产物,酶系统,反应动力学问题,发酵过程的控制一般策略：,前期有利于菌体生长，中后期有利用产物的合成,溶氧控制的一般策略：,前期大于临溶氧浓度，中后期满足产物的形成,。,2、溶氧控制的实例,GA,X,DO,谷氨酸发酵,：,要求：氧饱和度1,控制：0-12小时 小通风,12小时后 增加通风,原因：0-12小时菌体量较小，采用小通风,12,一般认为，发酵初期较大的通风和搅拌而产生过大的剪切力，对菌体的生长有时会产生不利的影响，所以有时发酵初期采用小通风，停搅拌，不但有利于降低能耗，而且在工艺上也是必须的。但是通气增大的时间一定要把握好。,例：,生产肌苷酸：,通气量不变 17.15 mg/ml,24小时增加 22.55 mg/ml,30小时增加 18.25 mg/ml,36小时增加 12.34 mg/ml,初期 与 前期,例,：哈药青霉素发酵的工艺研究,*,杜文双，中国抗生素杂志，2002,三、发酵过程中溶氧浓度监控的意义,1、考察工艺控制是否满足要求,2、其它异常情况的表征,染菌、噬菌体、设备和操作故障,3、间接控制的措施,溶氧的影响和控制总结,1.溶氧的影响,溶氧是需氧发酵控制的重要参数之一，氧的溶解度很小，氧的溶解度仅为6.4mg/L，只能保证氧化8.3mg葡萄糖，仅相当于常用培养基葡萄糖浓度的1。,微生物对氧的需要不同，是由于依赖获得能量的代谢方面的差异。好气性菌主要是有氧呼吸或氧化代谢，厌气菌为厌气发酵(分子间呼吸)，兼性厌气菌则两者兼而有之。,溶氧大小对菌体生长和产物的性质和产量产生不同影响；例如，谷氨酸发酵时，通气不足会积累大量乳酸和琥珀酸；,不同微生物或同一微生物的不同生长阶段对通风量的要求也不相同。例如，天氡酰胺酶发酵，前期为好气培养，后期为厌氧培养，产酶能力会大大提高。,2.发酵过程的溶氧变化,发酵前期,（生长期），菌体繁殖迅速，菌体摄氧率增加，醪液粘度上升，需氧量增加，溶氧下降。,发酵中期,（静止期），需氧量在有所减少，菌体和发酵液粘度均达到峰值；溶氧在较低水平维持一段时间后，开始上升，菌体进入次生代谢物合成期；,发酵后期,，产物大量合成，呼吸强度比较稳定，溶氧增加，若此时补糖，可降低溶氧，否则，菌体衰老，菌体进入自溶阶段。,发酵过程中有时会发生溶氧异常情况（异常下降或升高）,异常下降原因可能有,：污染好氧菌；或菌体向好氧代谢途径迁移，或供氧设备发生故障等。,异常上升原因可能有,：污染噬菌体，菌体完全北裂解；或菌体向厌氧代谢途径迁移,3.溶氧的控制,溶氧浓度的控制可从供氧和需氧两方面着手，其中供氧时主要的：,需氧方面：,需氧量手菌体浓度，基质浓度和种类，培养条件有关。,供氧方面,：提高氧的传递推动力和液相体积氧的传递系数K,L,a速率；生产中常采用加大通气速率，或提高搅拌转速，或适当增加罐压；,通气,可以供给大量的氧：通气量与菌种、培养基性质、培养阶段有关。,通气量的多少，最好按氧溶解的多少来决定。只有氧溶解的速度大于菌体的吸氧量时，菌体才能正常地生长和合成酶。因此随着菌体繁殖，呼吸增强，必须按菌体的吸氧量加大通气量，以增加溶解氧的量。,搅拌,则能使新鲜氧气更好地与培养液混合，保证氧的最大限度溶解，并且搅拌有利于热交换，使培养液的温度一致，还有利于营养物质和代谢物的分散。,此外，,挡板,则有助于搅拌，发酵液为湍流状态，使其效果更好。,罐压,方面，一般来说，若培养罐深，搅拌转速大，通气管开孔小或多，气泡在培养液内停留时间就长，氧的溶解速度就大，而且在这些因素确定下，培养基的粘度越小，氧的溶解速度也越大。,搅拌可以提高通气效果，但是过度地剧烈搅拌会导致培养液大量涌泡，容易增加杂菌污染的机会，液膜表层的酶容易氧化变性，微生物细胞也不宜剧烈搅拌。,第八节 二氧化碳的影响及其控制,1.二氧化碳的来源和影响,二氧化碳是微生物在生长繁殖过程中的代谢废物，也是某些合成代谢的基质，对微生物生长和发酵具有刺激或抑制作用；,（1）二氧化碳效应：,一些细菌发芽的孢子在开始生长时，需氧一定浓度二氧化碳才能生长良好的现象，如环状芽孢杆菌（,Bacillus circulus，E.coli,）,（2）二氧化碳抑制作用：,例如影响菌丝形态,CO,2,浓度为08时，产黄青霉呈丝状，,CO,2,浓度为1522时，产黄青霉丝粗短，,CO,2,分压为0.08,10,5,Pa时，产黄青霉呈球状，合成受阻,（3）二氧化碳对细胞的作用机制,CO,2,及HCO,3,-,影响细胞膜的结构，CO,2,影响细胞膜的脂质核心部位，影响细胞膜的膜蛋白，HCO,3,-,膜的流动性和表面电荷密度发生改变，基质运输受阻；,CO,2,对降低pH，或发生化学沉淀反应,反馈抑制某些前体物质的合成,2.二氧化碳浓度的控制,在相同条件下，二氧化碳的溶解度是氧的30倍，二氧化碳的浓度同样受呼吸强度，发酵液的流变学性质。通气搅拌，外界压力的影响，,控制方法可采用加大通气速率，或提高搅拌转速，或适当增加罐压；,增加通气速率，可增加溶氧浓度，降低二氧化碳浓度；,增加罐压或提高搅拌速率有利于溶氧提高，同时也使二氧化碳浓度增加。,第九节 补料的作用和控制,1.分批补料培养（fed-batch culture）的优点和应用,分批补料培养,是先投入一定量底物装入罐内，到发酵过程的适当时期，开始连续补加碳-能源或氮源或其他基质，使发酵过程中，限制性底物浓度在罐内保持一定；发酵液体积达到最大工作体积时，终止发酵，醪液一次全部取出的发酵方法；,介于分批发酵与相连续发酵之间的一种发酵技术，在发酵工业中普遍应用。,分批补料发酵的优点,（1）可以解除底物抑制，产物反馈抑制，分解代谢产物抑制；,（2）可避免菌体过量生长，能改善发酵液性质；,（3）能有效控制菌浓度，菌体细胞的质量,2.分批补料发酵的补料方式和控制,补料方式有单组分补料（限制性因子）和多组分补料；,反馈控制系统包括传感器、控制器、驱动器三个单元组成；既可以直接控制限制性因子（碳源、氮源或碳氮比）的浓度，也可以间接控制溶氧、pH、呼吸强度、CO,2,浓度、产物浓度,第十节 发酵过程泡沫的形成与控制,一、泡沫形成的基本理论,泡沫的定义：一般来说：,泡沫是气体在液体中的粗分散体，属于气液非均相体系,美国道康宁公司对泡沫这样定义：,体积密度接近气体，而不接近液体的“气/液”分散体。,发酵过程起泡的利弊：气体分散、增加气液接触面积，但过多的泡沫是有害的,（一）泡沫形成的原因,1、气液接触,因为泡沫是气体在液体中的粗分散体，产生泡沫的首要条件是气体和液体发生接触。而且只有气体与液体连续、充分地接触才会产生过量的泡沫。气液接触大致有以下两类情况：,（1）气体从外部进入液体，如搅拌液体时混入气体,（2）气体从液体内部产生。气体从液体内部产生时，形成的泡沫一般气泡较小、较稳定。,2、含助泡剂,在未加助泡剂，但并不纯净的水中产生的泡沫，其寿命在0.5秒之内，只能瞬间存在。摇荡纯溶剂不起泡，如蒸馏水，只有摇荡某种溶液才会起泡。,在纯净的气体、纯净的液体之外，必须存在第三种物质，才能产生气泡。对纯净液体来说，这第三种物质是助泡剂。,当形成气泡时，液体中出现气液界面，这些助泡剂就会形成定向吸附层。与液体亲和性弱的一端朝着气泡内部，与液体亲和性强的一端伸向液相，这样的定向吸附层起到稳定泡沫的作用。,3、起泡速度高于破泡速度,起泡的难易，取决于液体的成分及所经受的条件；破泡的难易取决于气泡和泡破灭后形成的液滴在表面自由能上的差别；同时还取决于泡沫破裂过程进行得多快这一速度因素。,高起泡的液体，产生的泡沫不一定稳定。体系的起泡程度是起泡难易和泡沫稳定性两个因素的综合效果。,泡沫产生速度小于泡沫破灭速度，则泡沫不断减少，最终呈不起泡状态；泡沫产生速度等于泡沫破灭速度，则泡沫数量将维持在某一平衡状态；泡沫产生速度高于泡沫破灭速度，泡沫量将不断增加。,4、发酵过程泡沫产生的原因,（1）通气搅拌的强烈程度,通气大、搅拌强烈可使泡沫增多，因此在发酵前期由于培养基营养成分消耗少，培养基成分丰富，易起泡。应先开小通气