分子遗传学第8章--原核生物基因表达调控.ppt

*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1,基因表达的调控水平,基因组,转录,转录后,翻译,翻译后,中心法则(central dogma),2,8.1.1 基因表达调控是生命的必需,基因表达(gene expression)是指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。典型的基因表达是基因经过转录、翻译，产生有生物活性的蛋白质的过程,既然从DNA到蛋白质的过程称为基因表达，对这个过程的调节就称为基因表达调控（gene regulation或gene control）。基因表达调控是现阶段分子生物学研究的中心课题,8.1 概述(introduction),3,按功能需要，某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生，称之为基因表达的,时间特异性(temporal specificity),。,在个体生长全过程，某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现，,称之为基因表达的,空间特异性(spatial specificity),。,6,结构基因,（structural gene）是编码,蛋白质,或,RNA,的任何基因。结构基因编码大量的功能各异的蛋白质，如组成细胞和组织的结构蛋白和酶等。,调节基因,（regulator gene）仅指参与其他基因表达调控的RNA和蛋白质的编码基因。,调节基因编码的调节物通过与DNA上的特定位点结合而控制受调节基因的转录,是基因表达调控的关键。,7,基因表达的产物(蛋白质)从合成的场所扩散到目标场所而发挥作用的过程称为,反式作用,（trans-acting），此基因表达产物被称为,反式作用因子,（trans-acting factor）。,反式作用因子通常为蛋白质，其特征为可以从合成地扩散到目标场所发挥作用,。,8,顺式作用元件（cis-acting factor）,是指对基因表达有调节活性的DNA序列，其活性只影响与其自身同处在一个DNA分子上的基因。顺式作用元件通常不编码蛋白质，多位于基因旁侧或内含子中。,顺式作用（cis-acting）,的概念用于任一不转变为任何其他形式的DNA序列，它只在原位发挥DNA序列的作用，仅影响与其物理上相连的DNA序列的活性。,基因活性的调控主要通过,反式作用因子,（通常是蛋白质）和,顺式作用元件,（通常在DNA上）相互作用而实现,。,9,8.1.2 基因表达适应环境的变化,生物体内的基因调控各不相同，根据基因表达随环境变化的情况，大致把基因表达分成两类：,组成型表达（constitutive expression）：指不易受环境变动而变化的一类基因表达。,其中某些基因表达产物是细胞或生物体整个生命过程中都持续需要而必不可少的，这类基因称为看家基因（housekeeping gene）,组成型基因表达也不是一成不变的，其表达强弱也受一定机制调控,10,bcl-2,-actin,1 2,11,1,2,3,GhUBI,图,15,GhGST,基因在棉花根，茎和叶中的表达分析。泳道1，2和3分别是根，茎和叶的,表达产物。内参为,GhUBI,基因,1,2,1,2,GhUBI,actin,A B,图,16,黄萎病菌胁迫处理下的,GhGST,基因的表达量分析。,(A),泳道,1,：接菌处理，泳道,2,：对照，,actin,基因作为内参。(B)泳道,1,：接菌处理，泳道,2,：对照，,GhUBI,基因作为内参,8h,8hCK,12h,24h,12hCK,24hCK,48h,48hCK,GhUBI,图17,棉苗根部在黄萎病菌胁迫处理不同时间的,GhGST,基因的特异性表达,12,3.2.3,GhNiR,基因表达特异性分析,NiR,Uibiquitin,RNA,胚状体 胚性愈伤 非胚性愈伤,GhNiR,在胚性愈伤组织和胚状体中的表达量要明显高于非胚性愈伤组织，但,GhNiR,基因在胚性愈伤组织和胚状体中的表达量几乎相同，没有明显的差异。,13,2.纤维不同发育时期的半定量RT-PCR,14,3.根、茎、叶不同器官半定量RT-PCR,15,常用的管家基因,中文名称 英文缩写,Beta肌动蛋白,-actin,甘油醛3-磷酸脱氢酶 GAPDH,TATA Box结合蛋白 TBP,18s 核糖体核糖核酸 18s rRNA,微管蛋白,-Tubulin,16,适应型表达(adaptive expression)指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达,应环境条件变化，基因表达水平增高的现象称为诱导(induction)，这类基因被称为,可诱导的基因(inducible gene),相反，随环境条件变化基因表达水平降低的现象称为阻遏(repression)，相应的基因被称为,可阻遏的基因(repressible gene),Luxury gene：,细胞分化、生物的发育以及生物适应环境所需要的基因,17,在一定机制控制下，功能上相关的一组基因，无论其为何种表达方式，均需协调一致、共同表达，即为,协调表达,(coordinate expression),，,这种调节称为协调调节(coordinate regulation),。,18,改变基因表达的情况以适应环境，在原核生物、单细胞生物中尤其显得突出和重要，因为细胞的生存环境经常会有剧烈的变化，,例如：周围有充足的葡萄糖，细菌就可以利用葡萄糖作能源和碳源，不必更多去合成利用其它糖类的酶类，当外界没有葡萄糖时，细菌就要适应环境中存在的其它糖类(如乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等)，开放能利用这些糖的酶类基因，以满足生长的需要,即使是内环境保持稳定的高等哺乳类，也经常要变动基因的表达来适应环境，例如与适宜温度下生活相比较，在冷或热环境下适应生活的动物，其肝脏合成的蛋白质图谱就有明显的不同,所以，基因表达调控是生物适应环境生存的必需,19,原核生物对环境的适应，相关的应答。,真核生物的细胞分化、组织特化、个体发育及环境对个体表型的影响都是基因表达的结果。,原核生物中，,营养状况和环境因素,对基因表达起着举足轻重,的影响。,高等真核生物中，,激素水平和发育阶段,是基因表达调控的最主要手段，营养和环境因素的影响大为下降。,基因表达的调控涉及,RNA转录的开/关，数量，选择性加工；,蛋白质翻译速率，数量，加工与 降解和分泌,8.1.3 原核生物与真核生物表达调控的异同,20,原核生物与真核生物基因表达调控机制具有惊人的相似性,共同的起源与共同的分子基础,调控机理上,调控层次上,核酸分子间的互作,核酸与蛋白质分子间的互作,蛋白质分子间的互作,transcriptional level,post-transcriptional level,translational level,post-translational level,21,转录水平上的调控是最为经济,灵活，又是最为重要的、复杂的调控,在复杂的基因组内，确定需要基因转录的起始位点,精细调节基因表达的水平，以保证生物体对环境的适应,cis factor&trans factor 间严格而又灵活的互作,保证RNA polymerase 的进行式转录（不中断，准确终止）,22,e)遗传信息表达的方式,组成型表达（,constitutive expression,）,Housekeeping gene,诱导型表达,（,inducible expression by signaling molecular,）,Luxury gene,顺、反因子间互作方式的基因表达调控,Epistasis effect,23,上位性效应,（,Epistasis effect,）：含意是指某一基因受不同位点上别的基因抑制而不能表达的现象。如果b基因存在时A与a的表型效果难以区别，此时b基因便是A基因的上位（epistatic），A基因是b基因的下位。,24,8.2 转录水平上的调控,Prok.,8.2.1 操纵子（operon）,8.2.2 严谨反应（stringent response）,8.2.3 衰减子（attenuator）,8.2.4 转座子（transposon）,25,原核生物,蛋白质因子,操纵子(operon),机制,特异DNA序列,编码序列,启动序列,操纵序列,其他调节序列,(,promoter,),(,operator,),26,法国巴斯德研究院的Francois Jacob与Jacques Monod于1960年在法国科学院院报上发表了一篇论文，提出乳糖代谢中的两个基因被一靠近它们的遗传因子所调节。这二个基因为-半乳糖苷酶(-galactosidase)和半乳糖苷透过酶(galactoside permease),首先提出了,操纵子(operon)和操作子(operator)的概念,，该学说使人们得以从分子水平认识基因表达的调控，是一个划时代的突破，1965年荣获诺贝尔生理学奖,8.2.1.1 operon theory,8.2.1 Operon control,27,外周胞质,乳糖,细胞内面,乳糖,透(性)酶,透(性)酶,半乳糖苷酶,葡萄糖,半乳糖,内膜,28,是RNA聚合酶结合并启动转录的特异DNA序列。,1,),启动序列,RNA转录起始,-35区,-10区,TTGACA,TTAACT,TTTACA,TATGAT,TTTACA,TATGTT,TTGATA,TATAAT,CTGACG,TACTGT,N,17,N,16,N,17,N,16,N,16,N,7,N,7,N,6,N,7,N,6,A,A,A,A,A,trp,tRNA,Tyr,lac,rec,A,Ara,BAD,TTGACA,TATAAT,共有序列,29,2,操纵序列,阻遏蛋白,(repressor),的结合位点,当操纵序列结合有,阻遏蛋白,时，会阻碍RNA聚合酶与启动序列的结合，或是RNA聚合酶不能沿DNA向前移动，阻碍转录。,启动序列,编码序列,操纵序列,pol,阻遏蛋白,30,3)其他调节序列、调节蛋白,例如,激活蛋白(activator),可结合启动序列邻近的DNA序列，促进RNA聚合酶与启动序列的结合，增强RNA聚合酶活性。,有些基因在没有激活蛋白存在时，RNA聚合酶很少或完全不能结合启动序列。,31,8.2.1.2 operon 调控类型,Positive,&,Negative,正负调控的区分是按照,没有,调节蛋白质存在的情况下操纵子对于新加入的调节蛋白质的响应情况定义的,负调控：,在没有调节蛋白质存在时基因是表达的，加入调节蛋白质后基因表达活性被关闭。,该调节蛋白称为阻遏蛋白(repressor),正调控：,在没有调节蛋白质存在时基因是关闭的，加入调节蛋白质后基因表达活性被开启。,该调节蛋白称为无辅基诱导蛋白(apoinducer)或激活蛋白,32,I gene,Neg.,Pos.,i,-,or 不加入I基因产物 operon on,I,+,or 加入I基因产物 operon off,i,-,or 不加入I基因产物 operon off,I,+,or 加入I基因产物 operon on,repressor,Negative,Positive,activator,(apoinducer),无辅基诱导物,33,Repressor binding on O site,Operon off,Negative control 是广泛保险的机制,（自然选择使 Prok.获得选择优势）,Positive control 是灵活、严格、经济的调控机制,Expressor binding front P site,意味转录效率极低,阻止转录启动,激活转录启动,34,辅阻遏物(corepressor)：,能够与失活的阻遏蛋白结合，并恢复阻遏蛋白与操纵基因结合能力的物质,。,8.2.1.3 operon调控模型,无论是在正控制系统中，还是在负控制系统中，操纵子的开启与关闭均受到环境因子的诱导，这种因子能与调控蛋白结合，改变调控蛋白的空间构象，从而改变其对基因转录的影响，因此称这种因子为,效应物,。,凡能诱导操纵子开启的效应物称为,诱导物（inducer）,35,Signal molecular,be needed for both types,Add,signal mol.,Operon,on,Add,signal mol.,Operon,off,Co-repressor,Inducer,(inducible operon),(repressible operon),根据操纵子对于能调节它们表达的小分子应答反应的性质，将操纵子分为可诱导的操纵子(inducible operon)和可阻遏的操纵子(repressible operon),36,Operon control model,负控制的诱导模型,负控制的阻遏模型,正控制的诱导模型,正控制的阻遏模型,37,（1）可诱导的负调控操纵子,例(分解酶类 lactose operon),I gene,active repressor,I,binding on Operator,38 kd/monomer,tetramer 152 kd,repressor,inducer,inactive repressor,38,大肠杆菌能以乳糖为唯一碳源生长，这是由于它能产生一套利用乳糖的酶，这些酶受,乳糖操纵子,的控制,大肠杆菌乳糖操纵子是大肠杆菌DNA的一个特定区段，由,调节基因I、启动子P、操作子O和结构基因Z、Y、A组成,P区是转录起始时RNA聚合酶的结合部位,O区是阻遏蛋白的结合部位，其功能是控制结构基因的转录,I基因经常进行转录和翻译，产生有活性阻遏蛋白,39,乳糖操纵子(lac operon)的结构,调控区,CAP结合位点,启动序列,操纵序列,结构基因,Z：,-,半乳糖苷酶,Y：透酶,A：乙酰基转移酶,Z,Y,A,O,P,DNA,40,-半乳糖苷酶是一种-半乳糖苷键的专一性酶，能将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖,-半乳糖苷透过酶：使外界的-半乳糖苷（如乳糖）能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内,-半乳糖苷乙酰基转移酶：把乙酰辅酶A上的乙酰基转到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖,41,LacI,LacI,与结构基因相邻，但不与结构基因属同一转录单位，有自己独立的转录单位；,含有自己的启动子和终止子,阻遏蛋白具有二重性：,含有与O结合的位点 阻止转录,含有诱导物结合位点 识别小分子诱导物,阻遏蛋白与O结合时，能阻止RNA聚合酶在启动子上的转录起始,一个大肠杆菌细胞中有大约10个阻遏蛋白分子，组成型转录,42,TGT,TGTGTG,G,AATTGT,GAGCGGATAACAATTTCACACA,ACAACACACCTTAACACTCGCCTAT,TGTTAA,A,GTGTGT,LacO,LacO,是mRNA起始点上游-5bp至转录单位内+21bp的序列，与启动子的末端重叠,具有对称性，以+11为轴，每边为两段各6bp的对称序列TGTGTG和AATTGT,+1,+11,O&P overlap,repressor&RNA polymerase bind at sites that overlap around the start point of,Lac,operon,repressor&RNA polymerase,对重叠位点竞争,43,RNA聚合酶结合部位,阻遏物结合部位,44,-调控机理,Inducer(lactose),与,repressor,特异结合,tetramer 变构,特异结合力下降1000X,作用于 O位点上的,repressor,变构,脱离O位,作用于游离的,repressor,operon on,repessor tetramer,与,operator,发生特异结合,operon off,变构,失去结合于O位的能力,45,Lac operon 调控机理,当细胞内无诱导物时，阻遏蛋白与操作子O结合，由于O与P之间有一定程度的重叠，因而妨碍了RNA Pol在-10序列上形成开放型启动子复合物，从而妨碍了Z、Y、A基因的转录。(实验表明:RNA聚合酶和LacI阻遏蛋白对操纵基因序列的结合是相互排斥的),当细胞内有诱导物时，诱导物以极高的速度与阻遏蛋白迅速结合，从而改变阻遏蛋白的构象，使之迅速从O上解离下来。RNA Pol就能与启动子牢固结合并形成开放型启动子复合物，从而开始转录Z、Y、A基因,46,47,Beta半乳糖苷酶,半乳糖苷透性酶,乙酰基转移酶,48,Lac operon诱导物,乳糖：能被-半乳糖苷酶分解，形成别乳糖,别乳糖是Lac操纵子转录的活性诱导物,IPTG：异丙基-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-D-thiogalactoside）能被-半乳糖苷酶识别但不能被-半乳糖苷酶水解的半乳糖苷化合物。IPTG具有极强的诱导效应，而本身不被分解，又称为,安慰诱导物(gratuitous inducer),所以IPTG常用于诱导含有lac启动子的质粒载体在细菌中的重组蛋白的表达,49,50,诱导物如何进入细胞开始诱导过程,因为诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合，而运转诱导物需要透过酶。在非诱导状态下有少量（1-5个mRNA分子）lac mRNA合成本底水平永久型合成,两方面机制保证了细胞内总有少量的蛋白足以开始诱导：,一是操纵子有一基础水平的表达，即使不被诱导时，操纵子也有少量表达（诱导水平的0.1）,二是一些诱导物通过其他系统进入细胞内,51,w.t.(I,+,O,+,P,+,)诱导型,add inducer,operon on,no inducer,operon off,O,C,失去与repressor特异结合的能力,O,C,mut.,(,I,+,O,C,P,+,),constitutive mut.（组成型）,不可诱导的突变：使操纵子在任何情况下总不能表达的突变,组成型突变：不受调控物影响的连续表达的突变,Lac operon突变,52,i,C,mut.,(,i,C,O,+,P,+,),constitutive mut.（组成型）,i,C,gene产物repressor丧失与O位点结合的能力,i,S,mut.,(,i,S,O,+,P,+,),super-repression mut.（超阻型）,i,S,gene 产物repressor 不能与inducer结合,等位基因间的显隐关系,53,i,c,p o Z Y A,i,c,I,+,i,c,tetramer,Non binding repressor,tetramer,tetramer,tetramer,Lactose,变构,i,C,gene产物,repressor,丧失与O位点结合的能力,I,+,i,C,等位基因间的显隐关系,I,+,/,I,C,54,i,S,p o,mut,repressor,I,+,tetramer,lactose,等位基因间的显隐关系,i,S,gene 产物repessor,不能与 inducer 结合,i,S,I,+,I,S,/,I,+,i,S,i,C,55,O,C,失去与repressor特异结合的能力,cis-dominat,O,C,O,+,I,+,O,C,Z Y A,lactose,等位基因间的显隐关系,I,+,O,+,mRNA,操作子控制着邻近的基因，而对细胞内存在的其他等位基因没有作用，此位点的突变（O,c,）称为顺式显性突变,56,57,原核生物基因表达的调控,乳糖代谢基因表达调控图解：(没有乳糖时),lac,Z,lac,Y,lac,A,调节基因,启动子,操纵基因,结构基因,RNA聚合酶,信使RNA,转录,翻译,阻抑物与,操纵基因,结合，结,构基因转,录受阻,阻抑物,58,原核生物基因表达的调控,乳糖代谢基因表达调控图解：(有乳糖时),lac,Z,lac,Y,lac,A,调节基因,启动子,操纵基因,结构基因,RNA聚合酶,信使RNA,转录,翻译,阻抑物与乳糖结合后构象发生了改变，,因而不能与操纵基因结合，使得结构,基因进行转录。,阻抑物,乳糖,转录,半乳糖苷酶,酶,酶,乳糖分解代,谢调控过程,是一个自我,调控过程,59,inactive,activator,active,activator,（2）可诱导的正调控操纵子(多为分解酶类),I,无活性激活物,operon off,(apoinducer),inducer,有活性激活物,结合在启动子前面,激活RNA polymerase启动,操纵子学说的核心是使基因从表达抑制状态中解脱出来进行转录，是从负调节的角度来考虑基因表达调控的。,那么，有没有从相反的角度进行正调节以提高基因的转录水平？,60,e.g.乳糖操纵子的正调控cAMP control,降解物对基因活性的调节,(universal controlling system),Glucose,Lactose,E.coli,葡萄糖优先被利用，乳糖不被利用，why?,通过阻止包括乳糖操纵子、半乳糖操纵子和阿拉伯糖操纵子等的表达来实现，,这种现象称为葡萄糖效应或称为降解物抑制作用。,61,I基因,CAP分解代谢物激活蛋白,(catabolite activator protein),只有cAMP 存在时，CAP才有活性，cAMP为小分子诱导物,62,63,为什么会产生这种效应呢？因为添加葡萄糖后，细菌所需要的能量可从葡萄糖得到满足，葡萄糖是最方便的能源，细菌无需开动一些不常用的基因去利用这些稀有的糖类。,葡萄糖的存在会抑制细菌的腺苷酸环化酶活性，减少环腺苷酸（cAMP）的合成，与它相结合的蛋白质，即,环腺苷酸受体蛋白CRP,又称分解代谢物激活蛋白CAP，,因找不到配体而不能形成复合物,降解物抑制作用是通过提高转录强度来调节基因表达的，是一种积极的调节方式,64,在有乳糖存在，而且葡萄糖水平低时，CAP可以激活象lac操纵子那样的操纵子的转录,当葡萄糖和乳糖都存在时，即使阻遏物不结合，转录也非常弱,当葡萄糖浓度降低，而乳糖仍然存在时，转录激烈增加。这是由于CAP是lac操纵子的一个激活剂，并且起始了正调控转录。cAMP的作用象个调节器，它与CAP结合正向调控CAP的DNA结合活性,65,E.coli,中葡萄糖转运将导致腺苷酸环化酶的去活化（作用），使得细胞内cAMP处于低水平,因此当葡萄糖存在时，cAMP水平低，而CAP无活性。然而当葡萄糖水平低时，腺苷环化酶有活性，细胞内cAMP水平增加，导致CAP的激活，结果促进RNA聚合酶与启动子结合，使转录增强,（下图）概括了在葡萄糖和乳糖水平低和高的条件下lac操纵子的转录活性。只有当,葡萄糖水平低，而乳糖存在时,，lac操纵子才被最大程度地转录。,当葡萄糖和乳糖的水平都很低时,会出现什么现象呢？实验表明，尽管有激活的CAP存在，lac阻遏物与lac操纵基因结合仍然能够阻止RNA聚合酶与启动子结合,66,67,68,调控机理,当细胞内,缺少葡萄糖,时，位于细胞膜上的,腺苷酸环化酶,将,ATP转变为cAMP,，cAMP与其受体蛋白CAP结合成复合物，此复合物再与启动子上的CAP结合位点结合，然后启动子上的RNA Pol进入位点才能与RNA Pol结合，转录即可进行,当细胞内含,有葡萄糖时,，细胞内,cAMP不能形成,，从而也不能形成cAMP-CAP复合物，复合物不能与启动子上的CAP位点结合，启动子上的RNA Pol进入位点虽能结合RNA Pol，,但不能形成开放型复合物，,转录起始区内的双螺旋不能解链，转录无法进行,69,+,转录,无葡萄糖，cAMP浓度高时,有葡萄糖，cAMP浓度低时,CAP的正性调节,Z,Y,A,O,P,DNA,CAP,CAP,CAP,CAP,CAP,CAP,70,cAMPCAP,具有广泛生理效应的正控制系统,存在于多种基因表达调控体系中,Lac operon 表达,cAMP,(Positive-inducible),lactose,(Negative-inducible),71,Lac operon的协调调控,正调控与负调控协调合作,阻遏蛋白封闭转录时，CAP不发挥作用,如没有CAP加强转录，即使阻遏蛋白从P上解离仍无转录活性,葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌优先利用葡萄糖,葡萄糖可降低,cAMP浓度，阻碍其与CAP结合从而抑制转录,结论：,lac操纵子强的诱导作用既需要乳糖又需缺乏葡萄糖,72,wt,wt,mt,mt,cis-dominant（顺式显性）,：,cis acting factor,对与其紧密连锁基因的控制效应不受其等位基因的影响。,隐性突变,73,wt,mt,74,Interallelic complementation,I,c,Z,+,/,I,+,Z,+,O,+,Z,+,/,O,C,Z,+,O,C,Z,+,/,I,c,Z,+,I,+,Z,+,/,I,c,Z,+,O,C,Z,-,/,O,+,Z,+,O,C,Z,+,/,O,+,Z,+,O,C,Z,+,/,O,+,Z,-,Gene types,Constitutive,Inducible,-,+,+,+,-,-,-,-,+,+,-,+,+,-,75,（3）可阻遏的负调控操纵子(合成酶类),e.g.色氨酸合成酶操纵子,I gene,inactive,repressor,Co-repressor,(,色氨酸,),76,lac 和ara操纵子是编码,分解代谢,途径酶系的操纵子，负责碳源（例如乳糖和阿拉伯糖等）的分解利用，这些操纵子的表达受相应碳源的诱导,在细菌中还有,负责一些物质合成代谢的操纵子,，例如色氨酸操纵子（tryptophan operon,trp operon）就是负责色氨酸合成的操纵子,trp操纵子是由一个启动子和一个操纵基因区组成，,该操纵基因区控制一个编码色氨酸生物合成需要的5种蛋白的多顺反子mRNA的表达,77,色氨酸是构成蛋白质的组分，一般的环境难以给细菌提供足够的色氨酸，细菌要生存繁殖通常需要自己经过许多步骤合成色氨酸，但是一旦环境能够提供色氨酸时，细菌就会充分利用外界的色氨酸、减少或停止合成色氨酸，以减轻自己的负担。细菌所以能做到这点是因为有色氨酸操纵元(trp operon)的调控。,78,由于trp体系参与生物合成而不是降解，,它不受葡萄糖或cAMP-CAP的调控,色氨酸的合成主要分5步完成，有7个基因参与整个合成过程。trpE和trpG编码邻氨基苯甲酸合酶，trpD编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶，trpF编码异构酶，trpC编码吲哚甘油磷酸合酶，trpA和trpB则分别编码色氨酸合酶的和亚基,79,合成色氨酸所需要酶类的基因E、D、C、B、A等头尾相接串连排列组成结构基因群，,受其上游的启动子Ptrp和操作子O的调控，,调控基因trpR的位置远离P-O-结构基因群，在其自身的启动子作用下，以组成型方式低水平表达分子量为47000的调控蛋白R,。R并没有与O结合的活性，当环境能提供足够浓度的色氨酸时，R与色氨酸结合后构象变化而活化，就能够与O特异性亲和结合，阻遏结构基因的转录，因此这是属于一种负性调控的、可阻遏的操纵元(repressible operon)，即这操纵元通常是开放转录的，当有效应物(色氨酸为阻遏剂)作用时，则阻遏关闭转录。细菌不少生物合成系统的操纵元都属于这种类型，其调控可使细菌处在生存繁殖最经济最节省的状态,。,80,162,P具有正常的-10和-35序列，-10序列完全位于O内,阻遏蛋白以四聚体的形式起作用。每个细胞约有20个四聚体。,衰减子,81,trpR P O E D C B A,trpR P O E D C B A,色氨酸,调控机理,Operator,operon off,operon on,repressor+trp,active,repressor,阻遏蛋白,(inactive),不能与O结合,(色氨酸缺乏),82,w.t.(I,+,O,+,P,+,)阻遏型,i,C,mut.,(,i,C,O,+,P,+,constitutive mut.),O,C,mut.,(I,+,O,C,P,+,constitutive mut.),O,C,O,+,(cis-dominant),I,+,i,C,i,C,无活性的阻遏蛋白不能被辅阻遏物激活,O,C,不能被有活性的阻遏蛋白结合,色氨酸操纵子突变体,83,e.g.2 精氨酸合成酶操纵子,调控元/调节子(regulon)：,受一个I 基因调控的若干,operon,所组成的表达调节系统,po A po G R poD po BCEH poF,repressor,Arg,84,active activator,corepressor,（4）可阻遏的正调控操纵子,I,active activator(apoinducer),operon on,Co-repressor,Inactive activator,operon off,85,e.g.阿拉伯糖操纵子(regulon),在大肠杆菌中，参与阿拉伯糖代谢的酶基因分为三个操纵子，即,araBAD,、,araE,和,araFG,araE,和,araFG,编码膜结合蛋白，与阿拉伯糖结合和转运有关,阿拉伯糖的降解需要,3,个基因：,araB,、,araA,和,araD,，,形成一个基因簇,，简写为,araBAD,。,分别编码,L,-,核酮糖激酶、,L,-,阿拉伯糖异构酶和,L,-,核酮糖,-5-,磷酸,-4-,表异构酶,三个操纵子由一个共同的,araC,基因产物,(,转录因子,AraC,),调控,86,araBAD,和,araC,基因的转录是分别在两条链上以相反的方向进行的,araBAD,基因簇从启动子P,BAD,开始向右进行转录，而,araC,基因则是从P,c,向左转录,Cp,ind,结合位点，araBAD转录,Cp,rep,结合位点，阻遏 P,C,&P,BAD,87,ara操纵子的调控有三个特点：,第一，,araC,的表达受到自身产物AraC的自动调控,第二，AraC既可充当阻遏物，也可作为激活剂,AraC蛋白同时显示正、负调节因子的功能,第三，AraC与CAP结合可充分诱导ara操纵子,88,AraC蛋白作为P,BAD,活性正、负调节因子的双重功能是通过该蛋白的,两种异构体,实现的。,Pr是起阻遏作用,的形式，可以与现在尚未鉴定的类操纵区位点相结合，而,Pi是起诱导作用,的形式，它通过与P,BAD,启动子结合进行调节,在没有阿拉伯糖时，Pr形式占优势；一旦有阿拉伯糖存在，它就能够与AraC蛋白结合，使平衡趋向于Pi形式。这样，阿拉伯糖的诱导作用就可以解释为,阿拉伯糖与Pr的结合，使Pr离开它的结合位点，然后产生大量的Pi，并与启动子结合,89,阿拉伯糖的作用象AraC的一个调控器，可将AraC由一个阻遏物转换为一个激活剂。,阿拉伯糖与AraC结合改变了AraC同源二聚体化特性、,促进了AraC-CAP复合物的形成。此时，AraC阿拉伯糖的作用象是一个转录激活剂，这正是CAP-cAMP诱导araB、araA、araD转录所需要的,90,当由于araBAD编码的蛋白质的代谢使得阿拉伯糖水平下降时，AraC又转换成一个阻遏物，同时araBAD转录减少，此时尽管CAP-cAMP复合物仍然存在于细胞中,91,阿拉伯糖作为,E.coli,的碳源，可以诱导ara操纵子的转录。当细胞中葡萄糖水平高（导致cAMP处于低浓度）和阿拉伯糖水平低时，AraC阻遏,araB，araA，araD,的转录,当阿拉伯糖水平高，而葡萄糖水平低（cAMP高）时，CAP-cAMP复合物能够与ara操纵子中的CAP结合部位结合，使DNA突环打开,92,93,Arabinose operon open,BAD gene expression,阿拉伯糖存在,cAMP enough(no glucose),Cp present Cp,ind,94,细菌有时会碰到紧急状况，比如氨基酸饥饿时，就不是缺少一二种氨基酸，而是氨基酸的全面匮乏。为了紧缩开支，渡过难关，细菌将会产生一个应急反应，包括生产各种RNA、糖、脂肪和蛋白质在内的几乎全部生物化学反应过程均被停止,8.2.2 严谨反应调控,(stringent response control),（1）基本概念,原核生物（,w.t.,）,在氨基酸饥饿状态下，自动停止或降低,(10-20,倍,),rRNA,tRNA,转录，从而调节蛋白质合成速率的,严谨现象,stringent response,是对任何氨基酸饥饿时表现的 一种广泛的调节机制,95,（2）相关因子,严谨因子,(,焦磷酸转移酶,）,Rel,gene,编码（,relaxed),pppGpp（Magic spot II）,鸟苷-5-三磷酸-3-二磷酸,PPP-CH,2,G,MSII,PP,ppGpp（Magic spot I）,鸟苷-5-二磷酸-3-二磷酸,PP-CH,2,MSI,PP,G,鸟苷四磷酸(,ppGpp,),鸟苷五磷酸(,pppGpp,),信号分子,产生信号分子的诱导物是空载,tRNA,严紧反应导致两种特殊核苷酸积聚：,96,最初发现细菌在氨基酸饥饿时，出现两种特殊的核苷酸，其电泳的迁移率和一般的核酸不同，感到很奇怪，就称之为“魔斑”和“魔斑”，后来发现魔斑便是ppGpp，魔斑是pppGpp。,这些鸟苷是典型的小分子效应物，预期它们的功能是和靶蛋白结合改变它们的活性，有时它们被称为（p）ppGpp。（p）ppGpp的功能是调节细胞活性大分子的协调性。它们的产物是由两种途径来控制的。在严峻的条件下严谨反应可以触发(p)ppGpp的增加。一些未知因素的调节也会出现（p）ppGpp水平与细菌生长速度之间的反向协调。,97,pppG+ATP pppGpp+AMP,严谨因子,ppG+ATP ppGpp+AMP,p,i,严谨因子,次要途径,各种核糖体蛋白质，EF-Tu和EF-G,98,（3）stringent response 分子机理,Rel,+,stringent factor,A site的空载 tRNA,PPG,ATP AMP,ppGpp,pppGpp,Null tRNA,肽链不延伸，GTP不断消耗,10,up,Idling reaction,提纯的RelA酶它本身实际是没有活性的。而在核糖体存在时它才有活性。它的活性是由核糖体在合成蛋白中的状态所控制的。,99,调控机制：,当细菌处于氨基酸饥饿状态时，无负载的tRNA进入核糖体A位点后，无法形成新的肽键，而GTP却在不断消耗，即出现所谓的空转反应（idling reaction)。细胞内出现空转反应时促进了严谨因子的表达，从而产生魔斑，其浓度可增加10倍以上。,魔斑作为阻遏物特异性地与rDNA操纵子的起始位点结合关闭rDNA操纵子，同时阻止tRNA的转录延伸，以使细胞能适应有限的营养条件。,当细菌的生存条件恢复正常时，细胞中名为,spoT,的基因可编码降解ppGpp的酶，从而开放rRNA和tRNA的转录，保证核糖体的重新构建和蛋白质的合成。,100,trp操纵子转录的调控是通过,Trp阻遏物,实现的，它结合于,trp操作子序列,，但Trp阻遏物的DNA结合活性直接受色氨酸调控，色氨酸结合Trp阻遏物，并起着一个效应分子的作用（称之辅阻遏物）,在有,高浓度色氨酸,存在时，Trp阻遏物-色氨酸复合物形成一个同源二聚体，并且紧密结合于trp,操作子,序列，因此可以阻止转录。然而当,色氨酸水平低,时，缺少色氨酸的Trp阻遏物以一种非活性形式存在，不能结合DNA。在这样的条件下，trp操纵子被RNA聚合酶转录，同时色氨酸生物合成途径被激活,8.2.3 衰减子调控,(Attenuator control),101,102,trp操纵子的另一种转录调控是称之衰减作用（attenuation）的调控机制，这是一种将翻译与转录联系在一起的新的转录调控形式,在trp mRNA 5端trpE基因的起始密码前有一个长162bp的mRNA片段被称为前导区，研究发现，当mRNA合成起始以后，,除非培养基中完全没有色氨酸，否则,转录总是在这个区域终止，产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子，终止trp基因转录。,衰减子