分子生物学-第五讲-细胞周期调控.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,第五讲 细胞周期调控,沈 晗,一、细胞周期的基本概念,细胞周期（,cell cycle),是指细胞从第一次分裂结束产生新细胞到第二次分裂结束所经历的全过程，分为,间期,与,分裂期,两个阶段。,间期,又分为三期、即,DNA,合成前期（,G1,期）、,DNA,合成期（,S,期）与,DNA,合成后期（,G2,期）,分裂期,又称,M,期，是细胞分裂期,细胞周期示意图,从增殖的角度来看，可将高等动物的细胞分为三类：,连续分裂细胞,，在细胞周期中连续运转因而又称为周期细胞，如表皮生发层细胞、部分骨髓细胞。,休眠细胞暂不分裂,，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期，称,G,0,期细胞，如淋巴细胞、肝细胞等。,不分裂细胞,，指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞，如神经、肌肉、多形核细胞等等。,当细胞中,DNA,损伤时，激活凋亡基因，使进入增殖周期的细胞停留在,G,1,S,期，容许细胞修复,DNA,避免突变。如果损伤严重时，细胞则走向凋亡。,流式细胞术可以检测细胞周期,不同细胞的细胞周期长短不同,细胞周期的时间长短与细胞类型有关，如：小鼠十二指肠上皮细胞的周期为,10,小时，人类胃上皮细胞,24,小时，骨髓细胞,18,小时，培养的人成纤维细胞,18,小时，,CHO,细胞,14,小时，,HeLa,细胞,21,小时。不同类型细胞的,G,1,长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。,二、细胞周期研究的历史进程,1841,年，柏林大学的波兰神经内科学家和生物学家罗伯特,里麦克（,Robert Remak,，,1815-1865,）就报道了细胞分裂现象，并得出结论，细胞分裂是细胞增殖的方式，也是机体生长发育的“根本动力”，当时认为细胞的增殖活动主要发生在形态变化明显的有丝分裂期。,1953,年，,Howard,和,Pelc,发现蚕豆根尖细胞分裂中遗传物质,DNA,的复制发生于静止期中的一个时期，这一时期与有丝分裂期在时间上存在前后两个间隙。由此，,他们第一次明确的提出了细胞周期的概念,，并将细胞周期划分为上述的,4,个时期，其中的,S,期即是,DNA,合成的时期。,MPF,的发现及其作用,1960s,，,Yoshio Masui(,吉雄升井,),发现成熟蛙卵的提取物能促进未成熟卵的胚胞破裂,(Germinal Vesicle Breakdown,，,GVBD),Yoshio Masui,C.L.M.(1971).Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes.Journal of Experimental Biology 177,129-145.,1979,年，,Sunkara,后来将不同时期,Hela,细胞的提取液注射到蛙卵母细胞中，发现,G1,和,S,期的抽取物不能诱导,GVBD,，而,G2,和,M,期的则具有促进胚胞破裂的功能，它将这种诱导物质称为有丝分裂因子,(MF),。,Sunkara,P.S.,Wright,D.A.,and Rao,P.N.(1979).Mitotic Factors from Mammalian Cells Induce Germinal Vesicle Breakdown and Chromosome Condensation in Amphibian Oocytes.Proceedings of the National Academy of Sciences 76,2799-2802,.,Johnson,和,Rao(1970),将,Hela,细胞同步于不同阶段，然后与,M,期细胞混合，在灭活仙台病毒介导下，诱导细胞融合，发现与,M,期细胞融合的间期细胞产生了形态各异的,早熟凝集染色体,(prematurely condensed chromosome,，,PCC),。,G,1,期,PCC,为单线状，因,DNA,未复制；,S,期,PCC,为粉末状，因,DNA,由多个部位开始复制；,G,2,期,PCC,为双线染色体，说明,DNA,复制已完成。,不仅同类,M,期细胞可以诱导,PCC,，不同类的,M,期细胞也可以诱导,PCC,产生，如人和蟾蜍的细胞融合时同样有这种效果，这就意味着,M,期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子。,注射实验表明：孕酮诱导卵母细胞成熟；成熟卵细胞质中，含有卵母细胞成熟的因子，称做,MPF,人,M,期细胞与袋鼠（,Ptk,）,G1,、,S,、,G2,期细胞融合诱导,PCC,：提示,M,期细胞存在诱导,PCC,的因子；,不同形态的,PCC,人们猜测，在,M,期的细胞中存在着某种物质，它能够促进染色体的凝聚和细胞的分裂。后来，人们在不同类型的,M,期细胞中分别提取出了能够促进细胞分裂的的因子，统称为,成熟促进因子,(maturation promoting factor,，,MPF),。,当时还不清楚,MPF,具体的组成和性质，但为人们寻找细胞周期调控机制提供了新的方向。,1960s LelandHartwell,芽殖酵母,1970s Paul Nurse,裂殖酵母,利用温度敏感突变株，发现许多与细胞分裂有关的基因,(cell division cycle gene,CDC),。,例：,芽殖酵母,cdc28,、裂殖酵母,cdc2,突变型在限制温度下无法分裂,wee1,突变型则提早分裂，,cdc25,突变型细胞体积增大而不分裂,cdc28,和,cdc2,都编码一个,34KD,的蛋白激酶，促进细胞周期的进行,其产物分别为,p34,cdc28,(G,2,/S,或,G,2,/M),和,p34,cdc2,（,G,2,/M,）,weel,和,cdc25,分别表现为抑制和促进,CDC2,的活性。,P34cdc2,激酶的发现及其与,MPF,的关系,Hartwell,还通过研究酵母菌细胞对放射线的感受性，提出了,checkpoint,（细胞周期检验点）的概念，意指当,DNA,受到损伤时，细胞周期会停下来。,budding yeast,（芽殖酵母）,Fission yeast,（裂殖酵母）,Cdc 25&Wee1 mutant,Cdc25,表达不足，细胞长得过长而不分裂；,Wee1,表达不足，细胞很小就开始分裂了,1983,年，,Tim Hunt,首次发现海胆卵受精后，在其卵裂过程中两种蛋白质的含量随细胞周期剧烈振荡，在每一轮间期开始合成，,G2/M,时达到高峰，,M,结束后突然消失，下轮间期又重新合成，故命名为周期蛋白,(cyclin),。,1987年，,Paul,Nurse,又在人的细胞中分离出,cdc2,同源的,cdk1,1988,年，,M.J.Lohka,纯化了爪蟾的,MPF,，经鉴定由,32KD,和,45KD,两种蛋白组成，二者结合可使多种蛋白质磷酸化。,1990,年，,PaulNurse,进一步的实验证明,P32,实际上是,cdc2,的同源物，而,P45,是,cyclinB,的同源物，从而将细胞周期三个领域的研究联系在一起。,实际上，,cdc2,跟调节它的,cyclin,组成的复合物就是成熟促进因子,MPF。,1988,年,M.J.Lohka,纯化了爪蟾的,MPF,，经鉴定由,32KD,和,45KD,两种蛋白组成，二者结合可使多种蛋白质磷酸化。,MPF,、,Cdc,和,Cyclin,的关系,Structure,of,MPF,MPF,的生化成分：含有两个亚单位,MPF,=Cdc2+cyclinB,（催化亚单位,+,调节亚单位）,MPF regulation,Demonstration of regulation of MPF,Nurse,在,1990,年提出：从酵母到无脊椎动物一直到人类，其所有真核细胞中存在一个共同的,M,期启动调节机制,“M,期启动调节的普遍机制”。,Hartwell,作为微生物学家，最先找到了用于研究真核细胞周期的合适模型,酵母细胞，同时他率先发现了,cdc,基因，为其后,20,年间细胞周期研究指明了方向,虽然他的这一工作的意义在,10,年后才真正显得尤为重要,并通过大量的研究为细胞周期理论的大厦奠定了基础。而,Tim Hunt,和,Paul Nurse,在完全不同的方向上进行的工作揭示了细胞周期中的关键分子及其作用，最终这些工作与,Hartwell,的研究相整和，使人们得到了有关细胞分裂的主要概念框架。,1998,年拉斯克医学奖授予,Lee Hartwell,，,Yoshio Masui,和,Paul Nurse,，表彰在细胞分裂调控机制研究中的开创性工作。,利兰哈特韦尔,Leland H.Hartwell,美国,弗雷德哈钦森癌症研究中心,美国西雅图,b 1939,年,蒂莫西亨特,R.Timothy(Tim)Hunt,英国,帝国癌症研究基金,英国伦敦,b 1943,年,保罗纳斯,Sir Paul M.Nurse,英国,帝国癌症研究基金,英国伦敦,b 1949,年,2001,年,10,月,8,日,LelandHartwell,、,Paul Nurse,和,TimothyHunt,因对细胞周期调控机理的研究而获诺贝尔生理医学奖。,诺贝尔颁奖时对三人贡献的描述,利兰,哈特韦尔的贡献,是发现了大量控制细胞周期的基因，其中一种被称为“,START”,的基因对控制各个细胞周期的最初阶段具有决定性的作用。,保罗,纳斯的贡献,是，在哈特韦尔的基础上，通过基因与分子法发现了调节细胞周期的一种关键物质,CDK,（细胞周期蛋白依赖激酶），,CDK,是通过对其他蛋白质的化学作用来驱动细胞周期的。,蒂莫西,亨特的贡献,是首次发现了调节,CDK,功能的物质,CYCLIN,（细胞周期蛋白）。,哈特韦尔、纳斯和亨特三人的发现对研究细胞的发育有重大的影响，特别是对开辟治疗癌症新途径将具有极其深远的意义。,细胞周期的内源性调控主要是通过“,Cyclins-CDKs-CKIs”,这一调控网络,三、细胞周期的主要调控因子,细胞周期,内源性调控,Cyclins CDKs-CKIs,正性,调控,核心,负性,调控,CDKs,（,cyclin-dependent kinase,，,细胞周期蛋白依赖性激酶）是调控网络的核心,Cyclins,（细胞周期蛋白）对,CDKs,具有正性调控作用,CKIs,（,CDK inhibitor,，,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子）具有负性调控作用。,CDK,是一类重要的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸蛋白激酶，激活的,CDK1,可将靶蛋白磷酸化而产生相应的生理效应，如将核纤层蛋白磷酸化导致核纤层解体、核膜消失，将,H1,磷酸化导致染色体的凝缩等等。这些效应的最终结果是细胞周期的不断运行。因此，,CDK,激酶和其调节因子又被称作,细胞周期引擎,。,已知哺乳动物有,7,种,CDK,，即,CDK1-CDK7,，它们都含有一段保守氨基酸序列,PSTAIRE,与周期蛋白的结合有关,CDK,激酶与可能结合的周期蛋白,CDK1,激酶催化不同的底物（主要是磷酸化丝氨酸和苏氨酸），参与细胞的多种功能。,Cyclins,不仅起激活,CDK,的作用，还决定了,CDK,何时、何处、将何种底物磷酸化。,目前从芽殖酵母、裂殖酵母和各类动物中分离出的周期蛋白有,30,余种，在脊椎动物中为,A1-2,、,B1-3,、,C,、,D1-3,、,E1-2,、,F,、,G,、,H,等。分为,G1,型、,G1/S,型,S,型和,M,型,4,类（见表,13-1,）。各类周期蛋白均含有一段约,100,个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白框，介导周期蛋白与,CDK,结合。,周期蛋白分子结构特征,不同类型的,CDK/cyclin,复合体,*包括,D1-3,，各亚型,cyclin D,在不同细胞中的表达量不同，但具有相同的功效。,M,期周期蛋白,N,端有一段序列与其降解有关，称,破坏框,(destruction box),，其降解依赖于,泛素途径。,泛素由,76,个氨基酸组成，高度保守。共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别和降解，这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径。,26S,蛋白酶体是一个大型的蛋白酶，可将泛素化的蛋白质分解成短肽。,Destruction Box in Cyclins,不同周期蛋白的表达时期不同，与不同的,CDK,结合，调节不同,CDK,激酶的活性。,部分哺乳动物和酵母细胞周期蛋白在细胞周期中的积累及其与,CDK,激酶活性的关系。,细胞周期调控示意图,CKI,是,CDK,抑制剂，可阻止细胞通过检验点，其作用方式是直接与,CDK,或,cyclin-CDK,复合物结合，已发现的,CKI,有,p16,家族和,p21,家族,P16,P15,P18,P19,特异性抑制,cdk4cyclin D1,cdk6cyclin D1,复合物,P21,P27,P57,抑制大多数,CDK,的激酶活性，,P21cip1,还能与,DNA,聚合酶,的辅助因子,PCNA,（,proliferatingcellnuclearantigen,）结合，直接抑制,DNA,的合成,P21cip1,抑制,CDK,和,PCNA,1,、,G1,期,Cyclin,D,表达，并与,CDK 4,、,CDK6,结合，使下游的蛋白质如,Rb,磷酸化，然后释放出转录因子,E2F,，促进其他,Cyclin,和,CDK,的转录；,四、,CDK-cyclin,的变化情况与细胞周期进程,2,、在,G1/S,期，,cyclinE,与,CDK2,结合，促进细胞进入,S,期。,3,、进入,S,期后，,Cyclin E,降解，,CDK2,转而与,CyclinA,结合，推进细胞进入,G2,期,。,4,、在,G,2,-M,期,cyclinA,、,cyclinB,与,CDK1,结合，,CDK1,使底物蛋白磷酸化、如将组蛋白,H,1,磷酸化导致染色体凝缩，核纤层蛋白磷酸化使核膜解体等下游细胞周期事件。,5,、在,M,期，当,MPF,活性达到最高时，激活后期蛋白复合体,-,APC,，将遍在蛋白连接在,cyclinB,上，导致,cyclinB,被蛋白酶体（,proteasome,）降解，完成一个细胞周期,M,期,CDK,的激活起始于分裂期,cyclin,的积累。,结合,cyclin B,的,CDK1,被,Wee1,将,Thr14,和,Tyr15,磷酸化而不具有活性，使,CDK/cyclin,不断积累。,在,M,期，,Wee1,的活性下降，,CDC25,使,CDK,去磷酸化，去除了,CDK,活化的障碍。,CDK,的激活需要,Thr161,的磷酸化，它是在,CDK,激酶,(CDK activating kinase CAK),的作用下完成的。,M,期,CDK,的激活,细胞中,CDK,激酶的活性受到多种因素的调控,CDK1,的激活需要,Thr14,和,Tyr15,的去磷酸化,Tyr161,的磷酸化,Weel1,可以促进,Thr14,和,Tyr15,的磷酸化,Cdc25,可以促进,Thr14,和,Tyr15,的去磷酸化,DNA,的复制是由起始复制点（,origins of replication,）,开始的，起始复制点是一种自主复制序列，散布在染色体上。在整个细胞周期中，起始复制点上结合有,复制起始点识别复合体（,Origin recognition complex,Orc,），,其作用就象一个停泊点，供其它调节因子停靠。,Cdc6,是其中的一个调节因子，在,G,1,期,Cdc6,含量瞬间提高，,Cdc6,结合在,Orc,上，在,ATP,供能下，促进,6,个亚单位构成的,MCM,复合体和其他一些蛋白结合到,ORC,上，形成前复制复合体（,pre-,replicative,complex,，,pre-RC,）,DNA,复制执照因子学说；,MCM,实际上就是,DNA,解旋酶。,DNA,复制的控制,五、细胞周期检验点,checkpoint,细胞要分裂，必须正确复制,DNA,和达到一定的体积，在获得足够物质支持分裂以前，细胞不可能进行分裂。细胞周期的运行，是在一系列称为检验点（,check point,）的严格检控下进行的，当,DNA,发生损伤，复制不完全或纺锤体形成不正常，周期将被阻断。,细胞周期的限制点有四个：,G,1,检验点,:,在酵母中称,start,点,，,在哺乳动物中称,R,点,(restriction point),，控制细胞由静止状态的,G,1,进入,DNA,合成期，相关的事件包括：,DNA,是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？,S,期检验点,：,DNA,复制是否完成？,G,2,检验点：,是决定细胞一分为二的控制点，相关的事件包括：,DNA,是否损伤？细胞体积是否足够大？,M,期检验点（纺锤体组装检验点）：,任何一个着丝点没有正确连接到纺锤体上，都会抑制,APC,的活性，引起细胞周期中断。,Four checkpoints,一、,G1,期检测点,G1,期检测点是最重要的检测点,。细胞在该检测点对各类生长因子、分裂原以及,DNA,损伤等复杂的细胞内外信号进行整合和传递,决定细胞是否进行分裂、发生凋亡或是进入,G0,期。,G1,期检测点中最重要的控制点是,G1,晚期的,START(,在动物细胞中称为,Restriction point),，,START,调节失灵，将导致细胞越过正常的程序限制进入,s,期，并允许细胞复制未修复的突变,DNA,，从而积累形成肿瘤表型的基因改变。,pRB,与,R,检测点的控制,二、,S,期检测点,控制,DNA,复制？,三、,G2,期检测点,控制进入,M,期的检测点,(G2,期检测点,),可防止受损的,DNA,和未完成复制的,DNA,进入有丝分裂。,p53,是,DNA,损伤诱导,G2,期阻滞的关键机制,因此,p53,缺失导致的,G2,期检测点缺陷与许多肿瘤的发生有关。,四、,M,期检测点,M,期检测点又叫纺锤体组装检测点。主要是阻止细胞分裂、阻止细胞两极形成纺锤体、阻止染色体附着到纺锤体上。,ATM(ataxia telangiectasia-mutated),and ATR(ATM-and Rad3-related)kinases,最早发现于毛细血管扩张性共济失调症患者，人类中大约有,1%,的人是,ATM,缺失的杂合子，表现出对电离辐射敏感和易患癌症。,ATM,编码一个蛋白激酶，结合在损伤的,DNA,上，其信号通路有两条。,激活,Chk1,（,checkpoint kinase,）,使,CDC25,的,Ser216,磷酸化失去活性，抑制,M-CDK,的活性，中断细胞周期。,激活,Chk2,，使,P53,被磷酸化而激活，然后,P53,作为转录因子，导致,P21,的表达，,P21,抑制,G1-S,期,CDK,的活性，中断细胞周期。,G1/S CHECKPOINTIN RESPONSE TO DAMAGE,strand,break,p53,p21,P-tyr15,cdk2,cyclin E,p21=CKI class(cyclin dependent kinase inhibitors),N-terminal of p21 forms complex with cyclin/cdk-inhibit kinase,X-rays,ATM,DNA Damage-Cell Cycle Arrest,damage dependent checkpoints,CELL,No.,DNA content,DNA content,asynchronous,X-ray treated,G1/S block,G2/M block,(6-9 hours),G1-S-G2,wild-type,loss of G1/S in,p53 deficient,cells,G1-S-G2,生长因子对细胞增殖的影响,单细胞生物的增殖取决于营养，多细胞生物细胞的增殖与信号途径有关。,生长因子：是与细胞增殖有关的信号物质，已知几十种，多数能促进细胞增殖，又称有丝分裂原（,mitogen,），如,EGF,、,NGF,。,作用方式：旁分泌。,信号通路：,ras,途径，,cAMP,途径、磷脂酰肌醇途径。,如通过,ras,途径，激活,MAPK,，,MAPK,进入细胞核内，激活,c-myc,，,myc,作为转录因子促进,cyclin D,、,SCF,、,E2F,等,G1-S,有关的基因表达，细胞进入,G1,期。,