分子生物学与慢性粒细胞白血病.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,一、概述,慢性粒细胞白血病,(,chronic myeloid leukemia,，,CML,),简称慢粒。,概念：,是一种发生在早期多能造血干细胞上的恶性骨髓增殖性疾病（获得性造血干细胞恶性克隆性疾病,),。,Chronic myelogenous leukemia,chronic phase.,病因：,CML,的,病因比较复杂，较为公认的致病因素是,电离辐射,，如,X,射线,、,射线,等。暴露于辐射的人群有较高的,CML,发病率。日本广岛及长崎原子弹辐射后，慢粒的发病率较未照射人群高,17,倍。,主要特点：,本病病程发展缓慢，外周血粒细胞显著增多且不成熟，脾脏明显肿大。自然病程可经历慢性期、加速期和急变期，多因急性变而死亡。本病各年龄组均可发病，以中年最多见。,二、,CML,分子生物学发病机理,Ph,染色体与融合基因,90%,以上的慢粒患者中可发现有,Ph,染色体，即,t(9,；,22)(q34,；,q11),，,9,号染色体,q34,上的原癌基因,c-ABL,的片段易位至,22,号染色体,q11,上的断裂点簇集区（,breakpoint cluster region,，,BCR,），产生,BCR-ABL,融合基因。这也是人类在白血病染色体易位中发现的第一个融合基因。,Bcr/abl,融合基因的结构,Bcr/abl,融合蛋白与白血病,1.p210,BCR-ABL,见于绝大部分,CML,及,50%,以上成人,Ph,染色体阳性的,ALL,。,2.p190,BCR-ABL,常见于,50%Ph,染色体阳性的成人,ALL,和,80%Ph,染色体阳性的儿童,ALL,。,3.p230,BCR-ABL,which is associated with rare cases of Ph-positive CML.,Bcr-abl,融合基因致病的分子机制,Bcr/abl,融合基因的编码产物,p210,、,p230,等融合蛋白具有很强的酪氨酸蛋白激酶活性，可激活结构性酪氨酸激酶（,tyrosine kinase,TK,）。而酪氨酸激酶是一种催化,ATP-,磷酸酶转移到蛋白质酪氨酸残基上的激酶，能催化多种底物蛋白酪氨酸残基磷酸化，进而激活细胞中多种信号转到途径，促进细胞增殖，减少细胞凋亡，最终导致慢性粒细胞白血病的发生。,三、,BCR-ABL,融合基因,的分子生物学检测技术,1.RT-PCR,：,是以,mRNA,为模板反转录出,cDNA,，再以,cDNA,为模板进行,PCR,，是在,RNA,水平上检测,BCR-ABL,融合基因。该方法灵敏度高，可用于,MRD,的检测，但反转录,-PCR,是一种定性实验，不能对白血病患者的,BCR-ABL,融合基因给出定量分析，也可能会因,RNA,降解而出现假阴性。,2.,实时定量荧光,-PCR,：,是以荧光共振能量转移原理为基础，在,PCR,扩增的同时，加入引物的同时加入特异性的荧光探针,;,是通过实验检测过程中的荧光强度变化对,PCR,扩增产物进行的一种定量检测方法。实时定量荧光,PCR,由于其具灵敏度高,(10,5,10,6,),、可准确定量观察、迅速、重复性好等优点，在,MRD,检测中具有非常重要的优势。,3.CBA,法：,是指用已知大小及性质的磁珠与一组可溶的蛋白分析物结合，以检测人类血液样本的,BCR-ABL,融合蛋白。其检测试剂为一种结合藻红蛋白,(phycoerythrin,，,PE),的单克隆抗体，可对,BCR-ABL,蛋白的,ABL,特异性结合，当免疫磁珠与,BCR-ABL,融合蛋白共混时，则可形成三明治状的复合物，蛋白的,BCR,端为结合了抗体的微球，,ABL,端为结合了藻红蛋白的抗体。基于抗体的大小及性质，可使用流式细胞仪对该种复合物进行研究，从而检测出,BCR-ABL,融合蛋白。,BCR-ABL,融合基因可翻译产生融合蛋白可以被抗,BCR,的捕获磁珠及连接,PE,的抗,ABL,抗体结合。在流式细胞仪上对捕获磁珠的检测，可检测出,PE,的荧光信号。,4.FISH,法：,是利用标记的,DNA,或,RNA,探针直接在染色体、细胞或组织水平定位特定靶核酸序列的分子细胞遗传学技术，可同时分析分裂期和间期的多个细胞，并进行定量。主要应用于染色体易位形成的融合基因检测、基因缺失的检测及,MRD,检测等。具有快速、安全、经济、灵敏度高、特异性强等优点。对白血病临床疗效的判定及预测预后也具有重要意义。,5.Southern,印迹,(Southern Blot),法,可对,bcr-abl,融合基因,DNA,重排进行分子生物学检测。将待测基因组,DNA,片段经电泳分离后转移到固相杂交膜上，用取自,M-bcr3,和,5,端的,bcr,探针与之杂交，经放射自显影洗片后即可显示所要检测的条带，对于,CML,患者，除可见到一条与胚系,bcr,基因组,DNA,相对应的条带外，其他的条带说明存在重排的,bcr,等位基因。,Southen,印记法实验流程图,四、分子靶向治疗（,molecular targeting treatment,）,信号传导抑制剂,(Signal Transduction Inhibitor,STI),分子靶向药物,酪氨酸激酶抑制剂,甲磺酸伊马替尼（,imatinib mesylate,）,，商品名为格列卫，为治疗,CML,的常用分子靶向药物。属小分子化合物，是一种特异性很强的酪氨酸激酶抑制剂（,TKI,）。对体内众多酪氨酸激酶，它仅能抑制,BCR-ABL,融合基因产物,P210,和,P190,、,PDGFR,（血小板衍化生长因子）与,c-Kit,受体的酪氨酸激酶。,格列卫药理作用的分子机制,格列卫通过特异性地与,BCR/ABL,激酶结构域的,ATP,位点结合，抑制其酪氨酸激酶活性,使酪氨酸残基不能磷酸化，从而抑制其细胞信号传导途径,促使细胞凋亡和抑制,Ph,阳性白血病细胞的增殖。,格列卫是,CML,治疗史上的里程牌,并且对,CML,具有很好的疗效，可使患者达到遗传学或分子生物学缓解。,Mechanism of action of imatinib.,By occupying the ATP binding pocket of the ABL kinase domain,imatinib prevents substrate phosphorylation and downstream activation of signals,thus inhibiting the leukemogenic effects of BCR-ABL on cells in chronic myelogenous leukemia.P=phosphate group.,