基因工程w.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,专题,1,基因工程,基因工程的概念和实质,1,.,概念：,指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过,_,等技术，赋予生物以,_,，从而创造出更符合人们需要的新生物类型和生物产品。由于基因工程是在,_,水平上进行设计和施工的，因此又叫做,_,_,。,体外,DNA,重组和转基因,DNA,分子,DNA,重组技术,新的遗传特性,基因拼接技术或,DNA,重组技术,生物体外,基因,DNA,分子水平,定向地改造生物的遗传性状,，产生人类需要的新的生物类型和生物产品,基因重组,特别说明：,基因工程引起变异的实质是,基因重组,，打破不同物种之间的生殖隔离，,定向地改变生物的性状,。,2,.,基因工程的实质：,将,一种生物的基因转移到另一种生物体内,，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状。,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,体外含有抗虫基因的,DNA,分子,切割,、改造、修饰、,拼接,导入,重组,DNA,在细胞中表达,棉花体细胞（有,抗虫基因,）,棉花植株,(,有,抗虫特性,),1.1 DNA,重组技术的基本工具,DNA,重组技术的基本工具,“分子手术刀”,“,分子缝合针,”,“,分子运输车,”,限制性核酸内切酶,DNA,连接酶,载体,准确切割,DNA,的工具,DNA,片段的连接工具,基因转移工具,Eco,RI,限制酶的切割：,中轴线,黏性末端,黏性末端,在,G,与,A,之间切割,大肠杆菌的一种限制酶,(,Eco,R),只能识别,GAATTC,序列,，并在,G,和,A,之间切开。,C C C G,G G,G G G C C C,中轴线,Sma,I,限制酶的切割：,C C C,G,G G,G,G G,C C C,平末端,平末端,只能识别,CCCGGG,序列,，并在,C,和,G,之间切开。,切割位点,和之间,和之间,末端类型,平末端,黏性末端,人过大佛寺 僧游云隐寺,寺佛大过人 寺隐云游僧,想一想,下列对联用了什么修辞手法？,回文,限制酶所识别的序列，无论是几个碱基，大都可以找到一条,中心轴线,（如图），中轴线两侧的双链,DNA,上的碱基是,反向、对称、重复,排列的。,想一想,限制酶所识别的序列有什么特点？,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性,(,平,),末端？,要切两个切口，产生四个黏性,(,平,),末端。,如果把两种来源不同的,DNA,用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性,(,平,),末端，然后让两者的黏性,(,平,),末端黏合起来，就可以合成重组的,DNA,分子了。,思考,?,2,、联系你已有的知识，想一想，为什么限制酶不剪切细菌本身的,DNA,？,细菌中限制酶之所以不切断自身,DNA,，是因为在长期进化过程中形了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的,DNA,降解。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其,DNA,分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别的序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。,这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的,DNA,切断，被并且可以防止外源,DNA,的入侵。,1.,作用,:,2.,作用原理：,催化双链,DNA,磷酸二酯键形成,把切下来的,DNA,片段拼接成新的,DNA,，即将,脱氧核糖和磷酸,连接起来,.,二、“分子缝合针”,DNA,连接酶,3.,种类：,E.coliDNA,连接酶：,T,4,DNA,连接酶：,连接黏性末端,连接黏性末端和平末端,化学键,第,7,题 例二,2,和,7,能连接形成,ACGT,TGCA,；,4,和,8,能连接形成,GAATTC,CTTAAG,；,3,和,6,能连接形成,GCGC,CGCG,；,1,和,5,能连接形成,CTGCAG,GACGTC,。,P,7,思考与探究,1,、参考答案：,将,外源基因送入受体细胞。,三,、,基因进入受体细胞的载体,“,分子运输车,”,1.,载体的作用,：,质粒,噬菌体的衍生物,动植物病毒等,2.,载体的种类：,质粒,：,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别。,是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核,DNA,之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状,DNA,分子。,能在受体细胞中进行,自我复制,，或与染色体,DNA,整合后进行同步复制,有,一个或多个限制酶切割位点,，供目的基因插入其中,具有某些,标记基因,，供重组,DNA,的鉴定和选择,对受体细胞,无害,且易分离,3.,载体应具备的条件：,在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。,基因表达载体的构建,1,）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。,2,）用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。,3,）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量,DNA,连接酶，形成了一个重组,DNA,分子（重组质粒）,目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。,1.,基因工程的实质是？优点？,2.,三大基本工具？,3.,4.,常用的载体？作用？作为载体的条件？,5.,质粒的本质？,6.,限制酶切割位点的作用？标记基因的作用？,比较下列酶：（,A,磷酸二酯键，,B,氢键）,DNA,片段,连接,DNA,片段,形成,A,合成,DNA,（复制）,合成,RNA,（转录）,脱氧核糖,核苷酸,形成,A,断开特定,的,A,断开,A,断开,B,DNA,使,DNA,解旋,DNA,将,DNA,切,成片段,DNA,将,DNA,水解成脱氧核苷酸,核糖核苷酸,形成,A,练习题答案,CCDAC ACCDCD,12.,（,1,）自我复制 限,制,酶切割位点 标记基因,（,2,）,细菌拟核,DNA,限,制,酶切割位点 标记基因,基因工程的基本操作程序,1.2,基因工程的基本操作程序,1.,目的基因的获取,2.,基因表达载体的构建,3.,将目的基因导入受体细胞,4.,目的基因的检测与鉴定,基因操作的基本步骤,一、目的基因的获取,基因来源：,从自然界已有的生物中分离出来,用人工的方法合成。,供体生物细胞,取出,DNA,用限制酶剪去多余部分,目的基因,限制酶,主要是编码蛋白质的结构基因。,获取目的基因的方法,从基因文库中获取目的基因,利用,PCR,技术扩增目的基因,用,DNA,合成仪人工合成：基因较小，核苷酸,序列已知,1.,从基因文库中获取目的基因：,基因文库,:,将含有某种生物不同基因的许多,DNA,片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库,(gene library),基因组文库,:,基因文库中包含了一种生物,所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库,.,部分基因文库,:,基因文库中包含了一种生物的,一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库,.,如：,cDNA,文库,基因文库的构建模式图,通过对,受体菌的,培养而,储存基因,基因组,DNA,文库,c,DNA,文库,2.PCR,扩增技术,PCR,聚合酶链式反应,是一项在生物,体外复制,特定,DNA,片段的核酸合成技术。,原理：,前提：,DNA,复制,一段已知目的基因的核苷酸序列,，以便根据这一序列合成,引物,PCR,技术（聚合酶链式反应）,DNA,引物,热稳定,DNA,聚,合酶（,Taq,酶）,PCR,技术,过程：,PCR,扩增仪,目的基因,DNA,受热变性，,解链,；,引物与单链互补结合（,退火,）；,合成链在热稳定,DNA,聚合酶作用下进行,延伸,。,变性,90,95C,延伸,70,75,C,退火,55,60,C,模板：模板,DNA,原料：,dNTP(,d,A,TP d,T,TP d,C,TP d,G,TP),酶,:,热稳定,DNA,聚合酶,(,Taq,酶,),能量,引物,PCR,基本条件,二、基因表达载体的构建,基因工程的,核心,目的：,使目的基因在受体细胞中,稳定存在,，并且可以,遗传,给下一代，同时使目的基因能够,表达和发挥作用,。,步骤,1,）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，,露出黏性末端。,2,）用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏,性末端。,3,）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量,DNA,连接酶，形成了一个重组,DNA,分子（重组质粒）,质粒,目的基因,限制酶,DNA,连接酶,重组,DNA,基因表达载体的构建,核心,基因表达载体,总结：表达载体需由哪几部分组成,1.,目的基因 （编码蛋白质）,2.,启动子（位于目的基因的,首端,，是,RNA,聚合酶,识别和结合的部位，启动,转录,）,3.,终止子（位于目的基因的,尾端,，使转录,终止,）,4.,标记基因（,鉴别,受体细胞中是否含有目的基因，并,筛选,）,5.,复制原点（驱动复制开始）,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,步骤三：目的基因导入受体细胞,转化：目的基因进入受体细胞内,维持稳定和表达,的过程,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,常用的转化方法有哪些？,农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法,显微注射技术,感受态细胞吸收,DNA,分子,1.,将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法,农杆菌是一种生活在土壤中的微生物，能在自然状态下,感染双子叶植物和裸子植物，,但对单子叶植物没有感染能力。,基因枪法,单子叶植物常用,花粉管通道法,是我国科学家独创的一种方法。,花粉管通道法就是在植物授粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前减去柱头；然后，滴加,DNA,（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,我国转基因抗虫棉的培育。,2.,将目的基因导入动物细胞,显微注射技术,2.,微生物作受体细胞原因：,3.,将目的基因导入微生物细胞,3.,转化方法：,大肠杆菌,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,处理细胞,细胞表达载体与感受态细胞混合,_,细胞吸收,DNA,分子。,Ca2+,感受态,感受态,1.,常用菌：,步骤四：目的基因的检测与鉴定,四环素,抗性基因,氨苄青霉,素抗性基因,初选：检测目的基因是否导入受体细胞,再次检测,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的,DNA,上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了,mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA,分子杂交,分子杂交,抗原,抗体杂交,DNA,分子杂交技术,基因探针：带有放射性标记的单链目的基因片段。,（,1,）必须是单链，,（,2,）带有容易被检测出来的标记物。,不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。,受体细胞摄入,DNA,分子后就说明目的基因完成了表达吗？（个体生物学水平的鉴定）,重组,DNA,技术操作的主要步骤,载体,质粒,噬菌体,病毒,目的基因（外源基因）,基因组,DNA,cDNA,人工合成,PCR,产物,限制酶消化,开环载体,DNA,目的基因,DNA,连接酶,重组体,转化,体外包装,带重组体的宿主,筛选,表型筛选,DNA,分子杂交鉴定,个体水平,抗原抗体反应,前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得到有效利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。,无表达产物,无表达产物,有表达产物,无表达产物,细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。,多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,1,）不属于质粒被选为基因载体的理由是（）,A,、能复制,B,、有多个限制酶切点,C,、具有标记基因,D,、它是环状,DNA,D,练习,2,、关于限制酶说法中，正确的是（）,A,限制酶是一种酶，只识别,GAATTC,碱基序列,B,EcoRI,切割的是,GA,之间的氢键,C,限制酶一般不切割自身的,DNA,分子，只切割外源,DNA,D,限制酶只存在于原核生物中,C,2,和,7,能连接形成,ACGT,TGCA,；,4,和,8,能连接形成,GAATTC,CTTAAG,；,3,和,6,能连接形成,GCGC,CGCG,；,1,和,5,能连接形成,CTGCAG,GACGTC,。,P,7,思考与探究,1,、参考答案：,2,、联系你已有的知识，想一想，为什么限制酶不剪切细菌本身的,DNA,？,迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断,DNA,上特定的碱基序列。,细菌中限制酶之所以不切断自身,DNA,，是因为在长期进化过程中形了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的,DNA,降解。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其,DNA,分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别的序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。,这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的,DNA,切断，被并且可以防止外源,DNA,的入侵。,3,、天然的,DNA,分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？,1,）能够在宿主细胞中,复制,并稳定地,保存,，或整合到染色体的,DNA,上去，随染色体,DNA,进行同步的复制。,2,）载体,DNA,必须有,一个或多个限制酶切点,，以便目的基因插入到载体上去。,3,）具有某些,标记基因,，便于进行筛选。,如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。,载体,DNA,必须是,安全,的,不会对受体细胞有害,或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去,;,5),载体,DNA,分子,大小应适合,以便提取和在体外进行操作,太大就不便操作,.,作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：,实际上自然存在的质粒,DNA,分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。,4,、网上查询：,DNA,连接酶有连接单链,DNA,的本领吗？,迄今为止，所发现的,DNA,连接酶都不具有连接单链,DNA,的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链,DNA,的酶。,3.,已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因，,现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么,？请设计实验、预期实验结果，并得出相应的实验结论。,对照组：,不添加,抗生素,实验组,1,：添加一定浓度的,四环素,实验组,2,：添加一定浓度的,氨苄青霉素,实验组,3,：添加一定浓度的,四环素,和,氨苄青霉素,对照组：,不添加,抗生素,实验组,1,：添加一定浓度的,四环素,实验组,2,：添加一定浓度的,氨苄青霉素,实验组,3,：添加一定浓度的,四环素,和,氨苄青霉素,既,含有抗四环素基因,也,含有抗氨苄青霉素基因,只含有抗四环素基因,只含有抗氨苄青霉素基因,既,不含有,抗四环素基因也,不含有,抗氨苄青霉素基因,