基因工程-1章--基因工程概述.ppt

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,联系方式,电子信箱,：,chengshunfeng,手机:[phone],基因工程课程教学体系,“一主线、二基础”理论教学体系,一主线：,指基因工程操作技术路线。,二基础：,指基因工程原理基础知识及基因工程应用基础知识。,基因工程原理基础知识：,包括基因工程概念，工具酶，分子克隆载体结构、特点与应用，目的基因与载体重组以及重组体转化与筛选鉴定，外源基因表达，基因工程常用技术原理等基础知识，构架起基因工程的上游和下游知识的完整结合，让学生全面掌握基因工程的基本操作原理。,基因工程应用基础知识：,包括基因工程药物、转基因植物、转基因动物、基因治疗、酵母基因工程、大肠杆菌基因工程、病毒基因工程等基因工程应用基础知识，唤起学生学习兴趣和探索未知领域的欲望。,参考期刊,Gene,Microbiology and Molecular Biology,生物工程学报,中国生物工程杂志,中国生物化学与分子生物学杂志,生物化学与生物物理研究进展,第一章 基因工程概述,1 基因工程概况,2 基因工程研究内容,第一节 基因工程概况,1.1 基因工程概念,基因工程就是通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作。,基因工程的重要特征:,1、打破了物种的界限，实现了跨物种的基因转移。,2、通过已知功能基因的遗传转化，可进行物种的定向改良。,3、可以创造出自然界中原本没有的生物,1.2 基因工程理论依据,不同基因具有相同的物质基础,基因是可以切割的,基因是可以转移的,多肽与基因之间存在对应关系,遗传密码是通用的,基因通过复制把遗传信息传给下代,1.3 基因工程与生物工程的关系,生物工程所包括的门类极广，从学科领域人们将它归并为六类：,即基因工程、蛋白质工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、生化工程。,1.4基因工程的技术流程,General process of gene engineering,1.4基因工程的技术流程,General process of gene engineering,1、目的基因的克隆,从特定的生物基因组或cDNA中通过各种方法分离和扩大繁殖获得足够量的目的基因或cDNA序列。,2、载体的准备,选择合适的载体，并对载体DNA进行克隆，制备足够量的达到一定纯度的载体DNA.,3、目的基因与载体的连接,选择适当的克隆策略，将目的基因连接与载体的多克隆位点或启动子和终止子之间，实现DNA重组。,4、重组DNA转化/转染,通过各种方法，将重组DNA转化/转染进大肠肝菌、酵母细胞、动植物细胞。,5、重组体的筛选与鉴定,利用载体上提供的选择标记基因进行抗性筛选，获得大肠肝菌、酵母细胞等抗性细胞系，或通过植株再生、胚移植等手段获得转基因动物。对获得的转化细胞、转基因植株或转基因动物进行分子鉴定。,6、重组体的大量培养、外源基因表达效应分析与开发应用,将经筛选鉴定出来的大肠杆菌、酵母细胞进行大量繁殖，对外源基因的表达蛋白进行分离与纯化并进行后续结构与功能的研究；分析外源基因表达对植物和动物性状的影响。,1.5 基因工程的基本条件,1、目的基因,2、载体,3、工具酶,4、宿主细胞,1.6 基因工程的支撑技术系统,1、基本仪器,加样枪、电子天平、离心机、PH计、凝胶成像分析仪、PCR仪、超净工作台。,2、基因工程的主要技术,DNA和RNA的分离和检测技术、凝胶电泳分析技术、DNA的酶切、连接和细菌转化与转染技术、聚合酶链式反应技术、核苷酸合成技术、细胞培养和再生技术、基因定点突变技术等,1.7 基因工程研究发展史,基因工程准备阶段,1944年美国微生物学家 Avery及其同事通过转化实验，证实遗传物质是DNA基因载体。,1953年，Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构模型,DNA双螺旋中两条链的碱基具有互补的特点，预示了DNA复制是半保留复制,同时指出遗传信息储存在DNA分子碱基序列之中。,Francis Crick&James Watson,1958年Crick在DNA双螺旋学说基础上提出分子生物学,“中心法则”，,即通过DNA自我复制，生物体遗传信息由父代传给子代，通过转录,遗传信息传给RNA,再通过翻译传给蛋白质，从而决定了生物的表型,这是生物学最基本的规律,。,1961年Nirenberg用人工合成mRNA破译出 第一个遗传密码到1969年Crick-Nirenberg确定全部遗传密码，人们了解了多数生物遗传信息表达的规律。从遗传密码表中我们可以看到mRNA中每3个核苷酸组成一个密码子，体现一个氨基酸的信息。,在64个密码子中，其中61个分别代表各种氨基酸，剩余的3个密码子(,UAA、UAG、UGA,)为肽链的终止信号,不代表任何氨基酸,这套密码从细菌到人都可通用。,1986年报道UGA代表selenocysteine(硒代半胱氨酸)。2002年报道在Archaea(产甲烷菌的甲胺甲基转移酶中发现,)和真菌中发现UAG可能是编码第22种氨基酸pyrrolysine(吡咯赖氨酸）的密码子。,以上所有研究成果为基因工程问世提供了理论准备。,20世纪60年代末至70年代初，,限制性核酸内切酶和连接酶,等陆续被发现,有了进行DNA操作基本工具,使DNA进行体外切割和连接成为可能。,1972年美国斯坦福大学,Berg,博士,领导的研究组用,Eco,RI在体外对猿猴病毒SV40的DNA和噬菌体DNA分别酶切,然后用T4 DNA连接酶将两种酶切片段连接，结果获得了SV40和噬菌体DNA的重组DNA分子，成功完成了世界上第一次DNA体外重组实验，,并因此与,Gilbert、Sanger,分享1980年度诺贝尔化学奖。,1972-Paul Berg,:,Produced first recombinant DNA using,Eco,RI,Eco,RI recognition sites,phage DNA,Eco,RI cuts DNA into fragments,Sticky end,SV40 DNA,The two fragments stick together by base pairing,DNA ligase,Recombinant DNA,基因工程问世,1973年，,Cohen,等人将编码Kan抗性基因质粒R6-5和编码Tet抗性基因质粒pSC101混合后，加入,Eco,RI进行酶切，用T4 DNA连接酶连接成重组DNA分子，最后转化大肠杆菌，结果某些转化菌落表现出既抗Kan又抗Tet的双重抗性特性。从这种双抗性转化菌落的大肠杆菌中分离出的重组质粒DNA带有完整pSC101分子和一个来自R6-5质粒编码Kan抗性基因DNA片段。,1973-Boyer,Cohen&Chang:,Transform,E.coli,with recombinant plasmid,Stanley Cohen&Annie Chan,Herbert Boyer,Kanamycin resistance gene,Plasmid pSC101,Tetracycline resistance gene,E.coli,transformed with recombinant plasmid,Transformed cells plated onto medium with kanamycin and tetracycline,Only cells with recombinant plasmid survive to produce colonies,基因工程的迅速发展阶段,自基因工程技术问世以来，这三十多年是基因工程迅速发展的阶段。不仅发展了一系列新的基因工程操作技术,而且构建了多种供转化原核生物和动物、植物细胞载体,获得大量转基因菌株。,1981年首次通过显微注射培育出世界上第一个转基因动物转基因小鼠。,1982年基因工程胰岛素商品在美国投放市场。同年采用农杆菌介导法培育出世界上第一例转基因植物转基因烟草。,1985年基因工程微生物杀虫剂通过美国环保署审批,1990年基因治疗开始进入临床试验。,如果说20世纪八九十年代是基因工程基础研究趋向成熟，应用研究初露锋芒的阶段，那么21世纪初将是基因工程应用研究的鼎盛时期，农、林、牧、渔、医等的很多产品都会打上基因工程的标记,。,2.1 基础研究,基因工程问世以来，科技工作者始终十分重视基础研究，包括构建一系列克隆载体和相应的表达系统，建立不同物种的基因组文库和cDNA文库，开发新的工具酶，探索新的操作方法等，各方面取得了丰硕的研究成果，使基因工程技术不断趋向成熟。,第二节 基因工程研究内容,基因工程克隆载体的研究,基因工程受体系统的研究,目的基因研究,第一类是与医药相关的基因；,第二类是抗病虫害和恶劣生境的基因；,第三类是编码具有特殊营养价值的蛋白或多肽的基因。至1998年完成基因组测序的生物有 11种，如幽门螺旋杆菌(1667867bp，1590个基因)等。,1990年开始，先后由美国、英国、日本、德国、法国、中国等国实施“人类基因组计划”。2003年完成全部序列测定，共编码约3-3.5万个基因。,基因工程工具酶的研究,基因工程新技术研究,2.2 应用研究,尽管基因工程出现后的一段时间内带给人们的是猜疑和恐惧，但实践表明，基因工程已经给人类带来了难以估量的经济和社会效益。特别是对人类所面临的,能源、粮食、人口、环境和疾病,等日趋严重的社会问题，基因工程正在并且将要发挥越来越大的作用。,(1),基因工程与农业,光合作用,固氮作用,转基因植物,转基因动物,产生次生代谢产物,(2),基因工程与工业,纤维素的开发利用,酿酒工业,食品工业,制药工业,新型蛋白质的生产,(3),基因工程与环境保护,环境监测,环境污染净化,(4),基因工程与医学,基因工程疫苗的研制与生产,基因诊断,基因治疗,主要基因工程产品的研制、开发、上市时间,产品,时间,国家,用途,上市时间,国家,人生长激素释放抑制素(SRM),1977,日本,巨人症,人胰岛素,1978,美国,糖尿病,1982,欧洲,人生长激素（HGH）,1979,美国,侏儒症,1985,美国,人,-干扰素（IFN）,1980,美国,病毒,1985,欧洲,乙肝疫苗（HBsAgV）,1983,美国,乙肝,1986,欧洲,人白细胞介素,1984,美国,肿瘤,1989,欧洲,人促红细胞生成素（EPO）,日本,贫血,1988,欧洲,人粒细胞集落刺激因子(G-CSF),白血病,1991,美国,人组织纤溶酶原激活剂（t-PA）,血栓症,1987,美国,2.3,基因工程技术的意义,基因工程技术跨越生物种属间不可逾越鸿沟,基因工程技术缩短了进化时间,基因工程技术使人能对生物进行定向改造,基因工程技术可以在体外大量扩增、纯化人们感兴趣的基因，研究其结构、功能及调控机制,从而拓宽了分子生物学的研究领域。,