基因工程基本原理简介.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一节 基因工程原理简介,一、基因工程的定义,本义：,根据人们的意愿，利用工程设计的方法，在体外将克隆获得的目的基因与适当的载体进行切割和连接，构建成正确的重组表达载体，再应用物理的、化学的或生物学的方法将该表达载体导入到细菌、动植物细胞或受精卵中，使目的基因在宿主体内以瞬时方式或稳定方式进行表达，借此研究目的,基因/DNA片段,的结构与功能，或获得该基因的表达产物。这一过程就是基因工程。,广义：,转基因动物；克隆；基因打靶；基因组计划等均属于基因工程的范畴。,目的基因获得,表达载体构建,基因的导入,表达的鉴定,核酸鉴定：PCR;Southern and Northern blot.,蛋白鉴定：SDS-PAGE;HPLC;Western blot.,功能检测：机体生理生化功能、性状的改变。,原核:包涵体,分泌型,真核:,文库,合成,PCR,基因组文库cDNA文库,细菌：氯化钙；电穿孔;,细胞：磷酸钙；脂质体；电穿孔；微注射；V;,动物：微注射；电穿孔；精子；,ESC,；RT-V,；,载体,质粒(,plasmid,),粘粒(,cosmid,),噬菌体(,),第二节 基因工程的基本步骤和方法,第三节 基因工程中的通用技术,一、核酸的提取纯化与定量,包括RNA、DNA及plasmid DNA的提取纯化技术,四、Western blot:,Protein,一、获得目的基因的方法,基因文库,（cDNA文库和基因组文库），化学合,成，PCR 等方法。还有,DD-PCR,以及,基因芯片,等技,术。,（一）,基因组文库,目的：,种质资源的保护；基因组测序；基因组,基因或调控序列的克隆等。,第四节 基因工程中的常用技术,家蝇部分基因组文库构建、卵黄蛋白基因启动子克隆与初步应用研究,Cloning and initial application of functional promoter of Musca domestica yolk protein gene,启动子克隆一般思路,启动子区,杂交,增强子,调控启动子,核心启动子,基因,3,5,转录起始点,探针,+50,-40,ATG,-4000,-500,功能 分析,克隆启动子,实验一、家蝇部分基因组文库的构建,1 材料与方法,1.1,家蝇基因组,DNA,的提取,2.1,基因组,DNA,的,部分酶切,3.1 EMBL3,载体臂的制备,4.1,连接与包装,5.1,基因组文库鉴定,Bcl I随机酶切,左臂 基因组DNA 右臂,left arm（20kb）,central stuff,14kb,right arm,9kb,EcoR I,BamH I,Sal I,BamH,Sal I,EcoR I,基因组DNA,BamH I+CIP,Bcl I,Bcl I,BamH I,BamH I,包,装,转化,KW251,噬菌斑,10,23kb,包装蛋白,实验一、技术路线图,重组噬菌体,收集,噬菌体液,基因组文库,1.Genomic DNA,2.Lamba DNA,Fig.1,electrophoresis of,genomic DNA,图1.基因组DNA电泳,1 2,48.5kb,实验一结果,2.1,基因组,DNA,的提取,提取的基因组,DNA,大于,50kb,Fig.2,Digestion of genomic,DNA by,Bcl,I,1.5U/ugDNA Bcl I，2.2.5U/ugDNA Bcl I,3.1.25 U/ugDNA Bcl I,4.Lamba DNA/Hind,Marker,图2.基因组DNA,Bcl,I 酶切电泳,23kb,9.4kb,1 2 3 4,Fig.3,Electrophoresis of recover,products of 1023kb DNA,fragments,1.,Bcl,I 酶切纯化片段,2.Lamba DNA/Hind Marker,图3.,10,23kb DNA片段回收产物电泳,23kb,9.4kb,1 2,实验一结果,2.2,家蝇基因组,DNA,酶切和纯化,纯化了1023kb的,Bcl,I酶切DNA片段,实验二、家蝇卵黄蛋白基因组基因的克隆,和序列分析,特异性探针,噬菌斑原位杂交,鉴定,可疑阳性克隆,亚克 隆,文库液,转化,KW251,噬菌斑,三次纯化,噬菌斑原位杂交,-DNA,提 取,阳性克隆,单酶切和双酶切,Southern Bl,ot,Hind III,XhoI,目的DNA片段,测序,序列分析,实验二、技术路线,实验二结果,GCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGATCGAA CAAGAAGTCA CCGTTTTCATCACCGGTCTG CCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTACATTCAACGTTACAGCAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTGAGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAAAAACCTGTGGGCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATCACCAATGTGGAACGTTATGCCACTTTGAATGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAAGACCTTGGCCGAGTTGGAGAGGGAAAGCAATGTCGATTTGGAAGATCTCCATGTCATTGGTCAGGGTATTGGTGCCAATGTTGCCGGTGCTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACATTACCACCCACAAATTGGATCGCATTACTGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGGCCAAGGATCCCAAAGTTTTGACCGGTTTGTCTCGTGGCAGTGCCAAATTCGTTGATGCCATCCACACCTCCGCCTTGGGTATGGGCACCACCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCCCAATGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGTAGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAGCTCGTGCCACACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGCCGTTGAGGCCAGCTCTTTGAAACAGTACCGCAACAATGATGGCTATGGCAAACGCACCTACATGGGCATTGCCACCCATCGTGACATCTCCGGTGACTACATGTTGGAGGTTAAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGC,卵黄蛋白基因部分DNA片段特异性探针序列,2.1,特异性探针制备,制备了大小为768bp的地高辛标记的DNA片段特异性探针，工作浓度为1：2000。,实验二结果,2.2,阳性克隆的筛选和纯化,1,#,positive clone,（about 2000 plaques/plate）,Fig.3 Screening result of 1st round situ hybridization,图3 第一次噬菌斑原位杂交筛选结果,YP1,2,#,positive clone,（about 200 plaques/plate）,Fig.4 Screening result of 2nd round situ hybridization,图4 第二次噬菌斑原位杂交筛选结果,Numbers：11 positive clone,（11 plaques/plate）,Fig.5 Screening result of 3rd round situ hybridization,图5 第三次噬菌斑原位杂交筛选结果,获得了含家蝇卵黄蛋白基因的阳性克隆,2.0,2.3,4.4,6.6,9.4,23,1.4,1.6,2.0,3.5,4.3,5.0,21,1 2 3 4 5 6,kb,kb,Fig.6,Digestion analysis of,recombinant,-DNA of positive plaque,图6 阳性克隆-DNA的酶切分析,实验二结果,2.3,mdYP,基因组基因的克隆,1:Lambda DNA/Hind Marker,2:,Xho,3:,Xho,/,Hin,d,4:,Hin,d,5:,Sal,6:,DNA/EcoR+,Hin,d Marker,3.5,kb,1 2 4,1:Xho I，2:Hind,3:Xho/Hind,Fig.7,Southern blot,of,recombinant,-DNA of positive plaque with,mdYP1 DNA probe DIG-labeled,图7 阳性克隆-DNA的 Southern blot,实验二结果,2.3,mdYP,基因组基因的克隆,1 ACAGAATTTGCTATTTAGGTCTTATATTTCTCAGAGCAAAGAGCTGGGCTGCAGAGAGATTTATGACAACGCCGTTGTGTGGTGTATGTATATAGAAAGA 100,101 ATAGAAGAATTACTTTNCTTAGTTGTTTTTTAAATAATCCTGTCCAACAAATGTGTCCAATCCAATTCTTGTTTTATTGGTTTTATCCCTCCTTAATATT 200,201 AATCTTTTTGGTCTTATTGAATAATTATTGATTGTGGTGATTGCTGTCTCTACTTCGTTTGGTTTGGTTTGGTTGTCAGTTGCGAACGTTGGAAACAAAA 300,301 ATGAAAAACGTCCCAACGAAACGAATATGAAGGCCACAAAGGAATACCCGATAAAAAATAAACAGAAAGCAAAGACTCCGGGTACTCTGTTGTTTACGAA 400,401 TGAGACATGAGAGAATTGAACATCTTCACTAAAGAGCTCGGAATTAGTTACAAATTAAATTGAATTCGACGGTGCGGTGGCGACATGACAGACGGACGGGT 500,501 TGATGGATAGATAACGGCGTTGAGAGTGAATGTGTTGGCGTCTTGTCTCTATTGCAGGGTGATTCATATATTAGAAAATTTACAATGGAAAAGTGGTTAT 600,601 TTTAAATAAGAAATAATATATATATGATATATATGATGTTTGGGGAAAAAATATGAAAAGATTACACTCTTACCTCATTATCTTTACTAAAAAAGGTATT 700,701 TTATGTATAAAAGGCTTGCAAAGTCGAAGTCTATTCACAAAAGATTCGAAAACGGTAATAAATGATCCTTCAGCAAAATATTATTGGACAGTATTGGACA 800,801 ATTCAACGATAAAAAAGTCACATTAAAAAGTGCTTTAAAAATAATGGCGGTTGACTTTTTTGCAGTTTTTTTTTTATCTTACCCTTTATGTCTAAAACGG 900,901 ACATTTTCAAAGGAACCTTATTCTAAAAATCTCAAAATATATGGAAGAGGGGGTAACTTTCCTCCTCTATTTAGGTTACTTTCCGATGTAAATTTTCAAA 1000,1001 ACGCCATTACATTTGTCTTCTATTTTTAGCCCTACTTTCATAATCTACTAGATTATTTCAGTATTTTTTTGCACAGTGCAGGTGATGATATTGGATAATT 1100,1101 CTTATTGAGGAAAAAATTCCCCAGTAAGAATGGAGAATCGGGTTATGAAACAAGATTTTTTAATAATTTCATTAATTATTTATTTTTTGNTTCTATGATT 1200,1201 TTGTGTTTTTTTTTTTTTTTGAATATTATTTTGAAATAAAGTGAAATCGAAATCTTCTCCTTTTTAGGTTATTGATCTAAAATACAAGGCTATTGCCAAA 1300,1301 ATCATGTAATACAATATTTGCTGAAATAGGCCAAATCACTTCTCGCCCTCCGTTCTATTTTTGATGACAGTGAAGCATTATGCAAGCTTGTTT,CAAT,TCT 1400,1401 CCCGCTTATCGTCACAACCTCTACAGATTTTGCAATTTACGTAAAGAAAAAGAAAAACGGCAAAATATTGAAAATGAAAATCAGCAAAAATCAAAAAAAT 1500,1501 TATCAGCAGTTCTCGCT,GGACTCACCTGACGGTCTGAT,TAACTATTTTGCTGTGAAATGTTAAATTTATTTGA,TATAAATA,CCCCCAGTGGAAGCCAGTG 1600,1601 GAGGGTACATTTCACAAGTTAGAACATTCGGCTTAAGAAGTGCCCGTACGACTTTGGGAATTTTTGAAACTGACCGACAGAAGG,ATG,AATCCATTGGGAG 1700,1701 TTTTGTGCTTTGTAGCCTTTGTGGCTGCCGGCGCCTTGGCCTCACAATCGCAGGACTACAGTCCAAAGCCAGCACATTGGCTGAAACCCACCGAATTGGA 1800,1801 G,GCCACACCATCTTTGAAT,GAGCTCACCTTTGAGCAGCTGGAGAATATGCCATTGGAAAAGGGAGCCAAATTGATGCGTAAACTCT,GTAAGTAGCCAGTC,1900,1901,AAGAATTTGGAAAAGACCTCCAATAATACAATTTCTCTCTTCTCTAG,ACCACCTGTCCCAAATCGACTACTCTGTGTCGCCCAACTTTGTGCCCAGTCCC 2000,2001 AGCAATGTCCCCGTCTACATTTTCAACAGCAAGGGTGAAAAAGAAACCTGCAACTTGAACAACTACGTCGACATTGCCAAGGAAAAGCCGAAATTTGGCG 2100,获得了全长3991bp的基因组序列，包含1.7kb卵黄蛋白基因组基因及其5-调控区序列。,2101 AACAAGAAGTCACCGTTTTCATCACCGGTCTGCCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTACATTCAACGTTACAG 2200,2201 CAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTGAGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAAAAACCTGTGGGCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATC 2300,2301 ACCAATGTGGAACGTTATGCCACTTTGAATGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAAGACCTTGGCTGAGTTGGAGAGGGAAAGCAATGTCGATTTGG 2400,2401 AAGATCTCCATGTCATTGGTCAGGGTATTGGTGCCAATGTTGCCGGTGCTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACATTACCACCCACAAATTGGATCGCATTAC 2500,2501 TGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGGCCAAGGATCCCAAAGTTTTGACCGGTTTGTCTCGTGGCAGTGCCAAATTCGTTGATGCCATCCACACCTCCGCC 2600,2601 TTGGGTATGGGCACCACCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCCCAATGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGTAGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAG 2700,2701 CTCGTGCCACACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGCCGTTGAGGCCAGCTCTTTGAAACAGTACCGCAACAATGA 2800,2801 TGGCTATGGCAAACGCACCTACATGGGCATTGCCACCCATCGTGACATCTCCGGTGACTACATGTTGGAGGTCAACGCCGAGAGCCCCTATGGCAAGAGA 2900,2901 ACTCCCGCCCGCAAACAAAAATCATACCATGGTGTTCATCAAACTTCCTATGCCAAAAGCAACGAAAACTATTAGAACGTTGGATGTTTGGCAAAAGAAA 3000,3001 AAGATTCTTTGGAAATGACTCCGAAAAAATTAAGCTGTGAATATTTGTCGAACGAAAACAGAAAAAAAAAACATCGAAGATAAATTATTGATTATTTAAT 3100,3101 TAAAAAAAAAAAAAAA,AATAA,GACTCTGAACATTACAAAAAGGAAATATTTATTTGAATTTTTATTCTTAGAGGATCGGGCGGGATAAACAAGATTATTA 3200,3201 AAGAAGGGCTAAAAATATAAGACAAGTGCGTCGGCGTTTTGAAAATGTACATGGCAAAGTAACCTAAATAGAGGCGCAAAGTTCCTCCTCTTCCCCATTT 3300,3301 TTAGAAATTTCGTTTCATAATATGTACAGGGTGAGATAAAAAAAAACTGCAACAAAGTCAAACGCTATAATTTTTATTTTTTTTTTAATTTTATTTATTG 3400,3401 AAAGCAAAAAATGTCGGAAATAGCATCAAATTTTAGAATATATTTAGTGTACAAGTTCCAATACCGTCGTATGGACTTGTTGTGGTTCAAATTCTACTGA 3500,3501 GTAGATTTTGAGCCGGAATTTATTGTTGCACAAAGACGAACAACAATATTGTTTAGCAAACTACAAACAAACACAAAAGTATTCTGACGATACTTACGTT 3600,3601 TGTTGTCTGCACAAAAGAAAAAGCACTTTAATAATTAGTATTTCAAAGTTGAAAATGACTCAGTCGGTCAAATTTTTATTTTATAAAAAAATTCACAATT 3700,3701 TTGATCTGGCGATCCACTTTTCTGAACTTCAAGAAGAAGAGTGCCGTTTTTAGTTTTGTGACGACATCGATAGTTTTTATTTATCGAGATCGATTAGATC 3800,3801 CATGTCGATGTCGTCATCTATCGGGTTGGGTCTATTCCCAACATGCCGGGCCCCTTGCACTGGTGCACAGTTAATGCCGTTGCTATTTTTTCAAGCACGC 3900,3901 TCAGGAACCTGTCCATCATCTCTGGCTGCTGCATTAAGGACTTTCCTTCGGGTTTTAATTCGGGCTGTTGTGCGGTATGTCGACTTTGTTG 3991,Fig.3,The sequence of Musca domestica YP1 gene containing 1.7kb 5flanking region.The intron region(18861947)is marked by underlining,the TATA box or the AATAA signal is in bold,The translation initiation codon ATG or translation termination codon TAG is indicated by an open box。,图3.,卵黄蛋白基因组基因全序列,实验三、家蝇卵黄蛋白基因启动子片段的,克隆与功能分析,FP1,RP1或RP2,PCR,FP2,FP3,P2,P3,+7,5,3,ATG,+1,启动子区,FP4,P4,P1,实验三、技术路线图,补平,T4 Ligase,表达质粒构建,表达质粒构建,TATA,Hind III,P2,P3,TATA,Hind III,Hind III 酶切,P5,P6,补平,T4 Ligase,鉴 定,电转移,转染,pMYP1-GFP,pMYP2-GFP,pMYP3-GFP,pMYP4-GFP,pMYP5-GFP,pMYP6-GFP,转染,Sf9昆虫细胞,BHK-21细胞,家蝇卵,绿色荧光蛋白,启动子活性,荧光显微镜,荧光显微镜,2.2,启动子片段的转录活性鉴定,pMYP2-GFP质粒电转移结果,pMYP3-GFP质粒电转移结果,pMYP4-GFP质粒电转移结果,TE buffer电转移,结果,实验三结果,家蝇早期胚胎转基因前后的差异表达研究,2.DD-PCR技术,5-NMAAAAAAAAAAAAA,n,细胞总RNA或poly(A)RNA,5-NMAAAAAAAAAAAAA,n,cDNA 3-,N M TTTTTTTTTTTT,简,并锚定引物,进行PCR,随机十聚体,NNNNNNNNNN,NMTTTTTTTTTTTT,持续循环,NNNNNNNNNN,NMTTTTTTTTTTTT,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,样品A 样品B,作Northern探针,作cDNA文库筛选探针,作亚克隆和测序样品,反转录反应,切取目的带,重新扩增,回收纯化,图3.家蝇早期胚胎转基因前后DD-PCR结果,1、3、5转基因处理组T,11,MA-AP,1,、T,11,MA-AP,3,、T,11,MA-AP,4,2、4、6对照组 T,11,A-AP,1,、T,11,MA-AP,3,、T,11,MA-AP,4,图4.差异片段的二次PCR回收结果,1DD-frag-6,2DD-frag-5,3DD-frag-3,MDL2000 Marker,DD-frag-3：355 nt,GGTACTCCAGTACAACTGATATCGTATGTTGAAATTCCTGCCGTGAGCAAAGCTCCCTTTGTAATAATCA,GTACC,CAAGAACAGGCAAACAAATAAATAACAGTTCTAAGTGAAATAACTGATGATCTACTATACAAAACTTATAAAGAGATAATAAGGTATTCGGTAATAAAATAAAAAAATAGTAAAGGTGGGTTCTTACTAATTATTCATTCAATAATAATAATCGAATGTATTACTGCTCCCTAAATCAACTAAACAGTTCTAATAGAGTTGAGGGAATGCATGCAGTAATATTCCTGTTGTAAAATTGAATGAAGCTCCAAACCTGTTCCAATGCAGGAGTATAT,CTGGA,DD-frag-5：432 nt,GCAATCGATGTACGATGTTTAACAACAACAAGAGTAATTACACTTTCAATTTTCACTTGTCTAACCAAAATTCATGTTGTATGAATGTCAAAAAGAAAAGACGACGGGTAACAAAAATCGAAAGTGAGCAACAATCGATTCTGGTGACGACAAAATTCTTAAGCAAGAAATCATCATCTTAAGAACGAAACAACTCATTGACCTAGAATGTTGATTGACAACTTAATGCTTCACCACTAGACATTACTCGTCAGCTGGTTA,CATCGATTG,TTAAACGTTTTCAAATCGAAACACTAGAAGATGGATAACCCGTGATTGGCTTTTCGTATTAAAGATAGATGTAAATCAAC,C,GCGAATTGTTCAACAACAACCAAGCAAAGGAATCAACTGAACACATATCAAAGAGTGTTTGGCACTTTATATAAATACTT,DD-frag-6：240 nt,GCAATCGATGTCACGATCGTAAGCGTTAACCAAAATTGCGTCCTCTAGAGATAGTATTCAACAAGCGATAATGGCCGTACTGAGGCAAATCTTTGTCATTCCCAAAAGTATGTTTCAGAAGCACCTTGGTAATAGTGCAAAATATAGGC,C,TTATTGAATTTTGACGAAATCTCTTTCATGATTTTAGTGC,ATCGATTGC,ATACAAACGCTCTTTTGTAAGCCAAGACATAGTTTCTCCA,图8 DD-frag-3（上）,、,DD-frag-5（A）与DD-frag-6（B）,点杂交鉴定结果,1阳性对照 2.阴性对照 3.家蝇基因组,1阴性对照;2.家蝇基因组;3转基因处理组;4.对照组,三、重组质粒的构建与鉴定,1.,工具酶：限制性内切酶、连接酶、聚合酶及其他修饰酶等；,2.,大肠杆菌感受态细胞；,3.,DNA的酶切与回收；,图.,pIRES-EGFP,4,.,目的片段与载体的连接；,5.,转化与重组质粒的鉴定；,1）初步鉴定：,-互补,；快速鉴定；原位杂交；PCR；抗性筛选；,2）酶切鉴定；,3）测序鉴定。,四、提高表达效率的技术方法,1.选用强启动子，如,CMV、EF1,等；,2.增强子，如MAR序列；,3.poly(A)；,4.组成型表达（可诱导表达）；,5.Dhfr加压筛选系统；,6.串联表达（融合表达）；,7.稳定表达（瞬时表达）；,8.Kozak序列（CCACCATG）；SD序列,9.密码子优化；,10.联合应用几种方法。,五、阳性克隆筛选技术,1.,报告基因：cat；LacZ；GFP；YFP；hGH；生长激素。,2.,抗性筛选：Amp；Tetr；G418；潮霉素；氯霉素。,3.其 他：,MTX-DHFR；HGPRT。,六、重组病毒构建技术（反向遗传学操作技术！）,1.,Ad2 vector,2.,Baculovirus vector,3.,RT-V vector,七、转基因方法与转基因动物,八、由真核生物蛋白质氨基酸序列获得其cDNA基因,第五节 基因工程中的最新技术,一、克隆技术,二、蛋白质工程,三、生物芯片技术,四、抗体库与基因工程抗体,五、RNAi and iPS,Protein Engineering：,以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过有目的的分子设计，或人工直接合成蛋白质（多肽），或利用基因工程手段，对已知或未知蛋白质进行定向改造，获得比天然蛋白更优良、更符合人们需要的新型蛋白质的过程。,Huge Mouse,A transgenic mouse with an active rat growth hormone gene(left)is twice the size of a normal mouse(right).,凡事之本，必先治身！,-吕氏春秋先己,不疾学而能为魁士名人者，未之尝有也！,-吕氏春秋劝学,在科学的道路上，只有丰碑，没有路标！,-爱因斯坦,知识,+,智慧,+,机遇,+,奋斗,+,健康,成功!,衣带渐宽终不悔，,为,伊,消得人憔悴。,柳永（宋）,伊,新解：,科学,