第一章基因工程绪论.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,授 课 内 容（,48,学时）,第一章 基因工程概论,第二章 基因工程常用技术,第三章 基因工程工具酶及其应用,第四章 基因工程载体,第五章 目的基因的制备,第六章,受体细胞和重组基因的导入,第七章 外源基因的高效表达,第八章 基因工程的应用,教材,基因工程 孙明主编 高等教育出版社,主要参考教材,1.,基因工程,楼士林,主编 科学出版社,2.,基因工程原理课件,张义正,四川大学生科院,3.,基因工程,吴乃虎主编,科学出版社,4,.,克隆技术,李建凡,主编,化学工业出版社,第一章,基 因 工 程 概 况,基因工程的核心内容是,基因克隆,和,基因表达,（二）基因工程理论依据,1.,不同的基因具有相同的物质基础：,1944,年肺炎链球菌转化实,；,1952,年噬菌体侵染实验,；,烟草花叶病毒侵染实验,2.,基因是可切割的,:,1970,年在分离并纯化的核酸内切酶,Hind II,3.,基因是可转移的,:,1951,年跳跃基因的发现,4.,多肽与基因之间存在对应关系,:,1958,年中心法则的提出,5.,遗传密码通用性,:,1966,年破译了全部,64,个遗传密码,6.,基因中的遗传信息是可传递的,:,1958,年同位素示踪实验,，,DNA,半保留复制理论,Bacterium,Radioactive protein(,35,S),Radioactive phage infects bacterial cells,Blender separates protein coats from bacterial surface,Centrifuge and measure radioactivity in pellet and supernatant,Radioactivity in supernatant,but not pellet,Hershey&Chase,（,1952,）,Hershey and Chase(1952):,Radioactive DNA(,32,P),Radioactivity in pellet,but not supernatant,Therefore,it is the viral DNA,and not protein,that programs cells to make copies of the virus.,（三）基因工程研究的技术路线,基因工程研究的成败是与技术路线的严密设计直接相关。,确定研究目标,在国内外已发表研究成果,自己提出的技术路线,严密设计可,行技术路线,生 物 材 料,人工合成,cDNA,文库,RNA,mRNA,目的基因,基因组文库,DNA,克隆载体,酶切,+,重组,DNA,受体细胞,导入,克隆子,筛选,转基因生物,（四）基因工程研究发展史,基因工程是在生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的研究成果基础上逐步发展起来的。基因工程研究的发展大致可以分为以下三个阶段。,1.,基因工程的准备阶段,2.,基因工程问世,3.,基因工程迅速发展阶段,1.,基因工程的准备阶段,Avery,et al,.(,1944)demonstrated that the,DNA is the genetic material,by using the transformation test.,A:Capsulated strain;B:Non-capsulated strain.,2003,年，恩特马克等构建的多杀性巴氏杆菌有荚膜菌株和无荚膜突变株,Watson and Crick(1952)DNA,的双螺旋结构模型,DNA,mRNA,Protein,transcription,translation,它们在,1958-1971,年先后建立了,“中心法则”,，揭示了遗传信息的流向和表达问题。,1966,年破译了全部,64,个遗传密码,以上研究成果为基因工程的问世提供了,理论依据,。,DNA,分子的体外切割与连接技术,1967,年世界上,5,个实验室同时发现,DNA,连接酶；,1970,年,Smith and Wilox,在流感嗜血杆菌中分离纯化了限制性内切酶,HindII,；,1972,年,Boyer,发现了限制性内切酶,EcoRI,。,基因工程载体：,病毒、质粒、噬菌体及大肠杆菌的应用。,1972,年在美国斯坦福大学的,P.Berg,博士领导的研究小组，完成了世界上第一次成功的,DNA,体外重组实验。将,SV40,和,噬菌体,DNA,片断连接起来。,2.,基因工程的问世,1973,年,Cohen and Boyer,等人合作，把非洲爪蟾,核糖体蛋白基因,片段与,pSC101,质粒,DNA,片段重组后导入大肠杆菌，证明动物基因也能进入大肠杆菌细胞并转录出相应的,mRNA,分子。,以上研究表明：,（,1,）,pSC101,质粒,DNA,可以作为基因克隆的载体，从而把外源,DNA,导入寄主细胞；,（,2,）像非洲爪蟾这样的高等生物的基因也可以被成功地转移到原核细胞中并实现其功能表达；,（,3,）质粒,DNA-,大肠杆菌细胞作为一种成功的基因克隆体系，有可能在重组,DNA,或基因工程研究中发挥重要作用。,此研究成果表明基因工程已正式问世。,3.,基因工程的迅速发展阶段,从基因工程问世以来的这,38,年是基因工程迅速发展的阶段。主要表现：,新的基因工程操作技术,构建了原核生物载体和真核生物载体,获得大量转基因菌株,1980,年首次通过显微注射培养出世界上第一个转基因动物（,transgenic mouse,）。,1983,年采用脓杆菌介导法培育出世界上第一例转基因植物,-,转基因烟草，至,1998,年转基因植物数有,4387,项。,转基因动物：,转生长激素基因鱼、转生长激素基因猪和抗猪瘟病转基因猪等。,用基因工程技术研制生产的贵重药物已市场的约有,100,多种。,凝血因子,VII IX VIII,细胞刺激因子,SCF TPO G-CSF,M-CSF,EPO,生长因子 骨形成因子 肌营养因子,FGF,，,GM-CSF,胰岛素类似物 血小板衍生因子,HGH,EGF,干扰素,IFN,1b,1b,2a,n3,1b,1b,白介素,1,1,3,6,2,4,12 11,激素 人促卵泡素 甲状旁腺素 胰高血糖素 胰岛素，心钠素,降钙素 促黄体生成素,IGF-1,甲状腺刺激素,酶 羧肽酶 尿酸氧化酶 葡萄脑苷酯酶,脱氧核糖核酸酶,链激酶,疫苗,CEA HSV,流感病毒,Lyme HBV,，,HCV,其他 水蛭素 松弛素,HB,SOD TNF,，,tPA,，,白蛋白,杀菌蛋白 单克隆抗体,可溶性补体受体,I,型,国内产业化生物药品概况,产品种类 临床,I,临床,II,临床,III,批准上市,二、,基因工程研究内容,（一）基础研究,进行基因工程研究的四个必要条件：,工具酶,、,基因,、,载体,、,受体细胞,。,1.,基因工程克隆载体的研究：,基因工程的发展是与克隆载体构建密切相关的，由于最早构建的克隆载体是原核生物的克隆载体，所以原核生物的基因工程研究得以发展；,Ti,质粒,的发现使植物基因工程研究迅速发展起来；,动物病毒克隆载体的构建,，使动物基因工程研究也有一定的进展。可以认为构建克隆载体是基因工程技术路线中的核心环节。,2.,基因工程受体系统的研究,基因工程的受体细胞与载体是一个系统的两个方面。受体是克隆载体的宿主，是外源目的,基因复制、转录和翻译的场所。,受体：,单细胞、组织、器官和个体均可以作为受体。,原核生物受体：,E.coli,真核生物受体,:,酵母是单细胞真核生物受体,植物受体：,愈伤组织、细胞和原生质，部分组织和器官,动物受体：,生殖细胞和早期胚胎细胞作为基因工程受体；,人的体细胞也可以作为基因工程受体,3.,目的基因研究,基因是一种资源，而且是一种有限的战略性资源。因此开发基因资源已成为发达国家之间激烈竞争的焦点之一。谁有基因专利多，谁就在基因工程领域占主要地位。,开发人民需要的基因产物，,基因工程研究的基本任务：,基因叫做目的基因。,例如：,Cp39,和,SpaA,获得目的基因的方法：,主要通过构建基因组文库或,cDNA,文库，从中筛选出特殊需要的基因。,基因：,医,药相关的基因；,抗病、虫害和,恶劣环境的基因,；,特殊营养价值的蛋白或多肽的基因。,基因组的研究工作,嗜血流感杆菌：,183 0137bp,，,1743,个基因,产甲烷球菌：,16 64976bp,，,1682,个基因,大肠杆菌,K-12,：,463 9221bp,，,4288,个基因,枯草杆菌：,4.2110,6,bp,4100,个基因,1980,年提出,Human Genome Project(HGP),；,1990,年开始，美国、英国、日本、德国、法国等国家实施,“人类基因组计划”,；,我国,1999,年,9,月获准参加这一计划，承担,1%,的测序任务。,2000,年,6,月宣告人类基因组,“工作框架图”,，已经绘制完毕。同时已被破译了近万个基因；,1999,年美国对,6500,个人类基因提出了,专利,申请；,一般认为人类基因组含有,数万个基因,，每一个基因控制在人的生长、发育和繁殖等过程；,如果：人类基因组全部被破译，可以了解几千种遗传疾病的发病机制和原因，为基因治疗提供可靠的依据。,目前正在进行，,“水稻基因组计划”,，我国是主要参加者；,中国、英国合作的,“家猪基因组计划”,已经启动。,4.,基因工程工具酶的研究,基因工程工具酶,指体外进行,DNA,合成、切割、修饰和连接等系列过程中所需要的酶，包括：,DNA,聚合酶、限制性核算内切酶、修饰酶和连接酶等。,5.,基因工程新技术研究,基因转化法：,不同类型受体细胞的,DNA,转化方法和病毒转导方法，特别是研制了,基因枪,和,电激仪,克服了某些克隆载体应用的物种限制性，提高了外源,DNA,转化的效率。,基因检测法：,生物素标记,DNA,探针、荧光标记,DNA,探针、,Dig,标记,DNA,探针等；,PCR,技术，凝胶电泳技术，脉冲电泳技术等。,供体细胞,目的基因,载体,重组,DNA,分子,转化细胞,受体细胞,多肽药物,疫苗、抗体,基因治疗,基因诊断,转基因动物,(,畜牧业、渔业,生物反应器,),转基因植物,(,农业、林业,生物反应器,),冶金、环保,轻工、食品,（二）应用研究,1.,基因工程药物研究,利用基因工技术开发新型治疗药物,最活跃和发展最快的领域。,基因工程药物：,基因工程活性多肽、基因工程疫苗和,DNA,药物。,活 性 多 肽：,干扰素（,IFN,）、白介素（,IL,）、生长因子（,GF,）、,肿瘤坏死因子（,TNF,）和胰岛素等。,（摄入）,基因工程疫苗：,医疗卫生部门使用的疫苗是活疫苗和弱毒疫苗。由于在制备过程中因减毒不充分，接种该疫苗是引发疾病的缺点。有些疫苗还有副作用。,抗原基因,植物细胞,（导入）,（表达）,转基因植物疫苗,动物或人,免疫应答,（产生）,病毒感染,能抵抗感染,转基因植物疫苗,例如：转乙肝病毒表面抗原基因或大肠杆菌肠毒素基因的马铃薯；,饲喂小鼠后，产生免疫应答。,转狂犬病毒糖蛋白或天花病毒表面抗原基因在番茄中表达。,DNA,疫苗：,被克隆目的基因克隆到表达载体而构建的重组,DNA,分子。,亚单位疫苗：,具有免疫原性和免疫保护性的蛋白质（抗原）。,例如，猪丹毒杆菌,SpaA,蛋白可以作为猪丹毒的亚单位,疫苗。,Benefits:Gene Therapy,Genes can be,inserted into people,to replace dysfunctional forms of genes and,promote health,（病人）,三、基因工程的安全性问题：,1,）筛选的标记基因和报告基因是否会对人畜有害，这些基因是否会,被病原菌摄取而导致其抗药性提高；,2,）抗除草剂基因会不会使转基因植物变成难以控制的杂草，或转移,到杂草上使杂草泛滥；,3,）外源基因插入的位置效应是否会引起有害的沉默基因的表达；,4,）转基因动物是否会演变成对人类有极大威胁的新物种；,5,）基因治疗是否会对人体正常功能产生不良影响。,第一章绪论作业,1.,基因工程？,2.,重组,DNA,技术的含义？,3.,基因工程研究的技术路线？,4.,进行基因工程研究中的四个必要条件？,