基因工程的常规技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程的常规技术,1,第一节 凝胶电泳技术,什么是电泳技术？,电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在,惰性支持介质,（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。,2,特点：,1.,可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔中泳动。,2.,电泳操作方法简便，电泳速度快,3.,分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。,琼脂糖,半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷,本节主要介绍,琼脂糖凝胶电泳技术。,琼脂糖与琼脂有区别么？,3,琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。,D-,半乳糖,3,，,6-,脱水,-L-,半乳糖,4,5,琼脂糖凝胶电泳特点,6,琼脂糖凝胶的配置,1.,根据电泳需要，配置合适浓度的电泳及制胶缓冲液。一般为,1 TAE,或,0.5TBE,。,注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相同的。,2.,根据制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂糖粉。,注意：总液体量不宜超过三角锥瓶的,50%,容量。,3.,在微波炉中加热溶解琼脂糖,注意：必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电泳图像模糊不清。加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加热。微波炉中加热时间不宜过长。,7,琼脂糖凝胶的配置,3.,使溶液冷却至,60,左右，如需要可在此时加入溴化乙锭,(EB),溶液使其终浓度为,0.5ug/ml,，并充分混匀,不提倡使用。,注意：溴化乙锭是一种致癌物质。使用含有溴化乙锭的溶液时，请戴用手套。溴化乙锭在可见光下会分解。,5.,将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度一般在,3,5 mm,之间。,注意：不要产生气泡，溶液温度太高,(60),，会使得水分过分蒸发，改变凝胶离子浓度，影响电泳效果。,6.,在室温下使胶凝固（大约,30,分钟），然后放置于电泳槽中进行电泳。,注意：凝胶不立即使用时，用保鲜膜将凝胶包好在,4,下保存，或者放在制胶的缓冲液中，一般可保存,2,5,天。,8,琼脂糖凝胶缓冲液,有几种缓冲液适用于天然双链,DNA,的电泳,Tris-,乙酸盐和,EDTA,缓冲液（,pH8.0,TAE,，也称为,E,缓冲液）,Tris-,硼酸盐缓冲液,(TBE),Tris-,磷酸盐缓冲液,(TPE),9,琼脂糖凝胶缓冲液,10,琼脂糖凝胶缓冲液,TBE,可以使用,10,次左右，而,TAE,用,23,次就要更换。电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，,pH,值上升，缓冲性能下降，可能使,DNA,条带模糊或不规则,DNA,带迁移。,电泳缓冲液刚好没过凝胶,1mm,为好，太多则电流加大，凝胶发热。,11,琼脂糖凝胶载样缓冲液,载样缓冲液是上样时与样品一起加入泳道的。载样缓冲液有三个作用：,增加样品密度以保证,DNA,沉入加样孔内；,使样品带有颜色便于上样操作；,其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。,上样缓冲液有几种，但基本都包括溴酚蓝和二甲苯氰,FF,。,12,琼脂糖凝胶载样缓冲液,溴酚蓝在琼脂糖凝胶中迁移速率是二甲苯氰,FF,的,2.2,倍，这一特性与琼脂糖凝胶的浓度无关；,在,0.5TBE,琼脂糖凝胶电泳中溴酚蓝的速率约与长约,300,bp,的线性双链,DNA,相同，而二甲苯氰,FF,约与长,4kb,的,DNA,相同。在,0.5%-1.4%,浓度的琼脂糖凝胶中基本不会变化。,13,琼脂糖凝胶载样缓冲液,14,影响电泳迁移率的因素,DNA,分子的大小,1,凝胶的浓度,2,DNA,的构象,3,使用的电压,4,琼脂糖的种类,5,电泳缓冲液,6,嵌入染料的存在,7,15,影响电泳迁移率的因素,DNA,分子的大小,1,凝胶的浓度,2,DNA,的构象,3,使用的电压,4,琼脂糖的种类,5,电泳缓冲液,6,嵌入染料的存在,7,DNA,分子大小迁移速率,U,与,logN,成反比（,N,为碱基对数目）。分子越大，摩擦阻力越大，同时大分子通过凝胶孔径的效率也低于较小的分子，所以分子大的迁移慢。,等量的空间结构，紧密的电泳快（超螺旋,线性,DNA,）,一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。,16,影响电泳迁移率的因素,DNA,分子的大小,1,凝胶的浓度,2,DNA,的构象,3,使用的电压,4,琼脂糖的种类,5,电泳缓冲液,6,嵌入染料的存在,7,简言之，浓度越大，分子孔径就越小，,DNA,迁移速率就越低，反之迁移速率就大。,另外，浓度也跟凝胶的分辨率有关，浓度越大，分辨率越高，但分离的片段就越小。,17,琼脂糖凝胶的浓度,18,影响电泳迁移率的因素,DNA,分子的大小,1,凝胶的浓度,2,DNA,的构象,3,使用的电压,4,琼脂糖的种类,5,电泳缓冲液,6,嵌入染料的存在,7,一般迁移速率超螺旋环状,线状,DNA,单链开环。,19,影响电泳迁移率的因素,DNA,分子的大小,1,凝胶的浓度,2,DNA,的构象,3,使用的电压,4,琼脂糖的种类,5,电泳缓冲液,6,嵌入染料的存在,7,低电压时，线状,DNA,片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过,5-8V/cm,20,影响电泳迁移率的因素,DNA,分子的大小,1,凝胶的浓度,2,DNA,的构象,3,使用的电压,4,琼脂糖的种类,5,电泳缓冲液,6,嵌入染料的存在,7,包括标准琼脂糖和低熔点琼脂糖以及正在研制的介于二者之间的琼脂糖。其分辨率等各有不同。,21,琼脂糖凝胶的浓度,22,影响电泳迁移率的因素,DNA,分子的大小,1,凝胶的浓度,2,DNA,的构象,3,使用的电压,4,琼脂糖的种类,5,电泳缓冲液,6,嵌入染料的存在,7,溶液,pH,值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大，尤其对于蛋白质等两性分子，缓冲液,pH,还会影响到其电泳方向,;,溶液的离子强度过低，会使电导率降低，,DNA,不是全然不动就是迁移极慢；而离子过强时，电导率上升，会产生大量热能，使凝胶变化甚至熔化，也会使,DNA,变性。,23,影响电泳迁移率的因素,DNA,分子的大小,1,凝胶的浓度,2,DNA,的构象,3,使用的电压,4,琼脂糖的种类,5,电泳缓冲液,6,嵌入染料的存在,7,染色剂溴化乙锭插入双链,DNA,造成其负电荷减少、刚性和长度增加，因此，线性,DNA-,染料复合物在凝胶中的迁移率约降低,15%,。,24,DNA,分子的迁移速度与其分子质量的对数值成反比关系。,在电场的作用下，带有,负电荷的,DNA,或,RNA,核苷酸链，依靠无反应活性的稳定的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。,琼脂糖凝胶电泳基本原理,25,当用,EB,对,DNA,样品染色时，加入的,EB,就插入,DNA,分子中形成荧光结合物，,荧光的强度与,DNA,含量成正比,，如果用,DNA,片段的标准品作电泳对照，就可以估计出待测样品的分子量大小和浓度。,26,DNA,的琼脂糖凝胶电泳检测,+,-,仪器,电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、移液枪；,药品,Agarose,、,TAE buffer,、,EB,（溴化乙锭）,上样缓冲液（,6X,）,0.25%,溴酚蓝（指示,100-200bp,的带）、,0.25%,二甲苯青（指示,800-100bp,的带）、,40%,蔗糖；水溶液,4,保存。,27,玻璃片,28,29,预染色的标本,30,31,32,33,第二节 分子杂交技术,所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链,DNA,或,RNA,，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。核酸杂交技术主要有,Southern,杂交、,Northern,杂交和菌落原位杂交等。,34,一、探针与探针标记,杂交的主要目的是为了检测出同源,DNA,序列，而为了达到这一目的，必需要有标记的探针。,带有能检测的标记物的,DNA,或,RNA,叫探针。,使,DNA,或,RNA,带有可检测的标记物的过程叫探针标记。,35,1.,切口平移标记,用一定浓度的,DNaseI,在双链,DNA,的一条链的有限位置上打开切口。,利用,DNA,聚合酶,I,的,5,3,的核酸外切酶活性将,DNA,一条链上的核苷酸一个一个的切除，同时暴露出另一条单链,DNA,。,以这条单链,DNA,为模板，利用,DNA,聚合酶,I,的,5 3,的,DNA,聚合功能把一个一个带有标记的,dNTP,合成上去。,36,37,大肠杆菌聚合酶,I,的应用示例,缺口转移制备探针,Pol I+Mg,2+,+,32,P,dNTPs,37,2.,随机引物标记,能与任何,DNA,模板的多个位点配对互补的多个不均一序列寡聚核苷酸,DNA,片段叫,随机引物。,DNA,聚合酶,Klenow,大片段能在随机引物的引导下以带有标记的,dNTP,为原料合成新的与模板,DNA,互补的探针。,38,二、,Southern,杂交,根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的,DNA,片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链,DNA,或,RNA,探针的杂交作用检测这些被转移的,DNA,片段，这种实验方法叫做,DNA,印迹杂交技术。由于它是由,E.Southern,于,1975,年首先设计出来的，故又叫,Southern DNA,印迹转移技术。,39,（,a,）,（,b,）,（,c,）,（,d,）,（,e,）,基因组,DNA,DNA,限制片段,硝酸纤维素滤膜,同探针同源杂交的基因,DNA,片段,X,光底片,杂交步骤：,1.,酶切,2.,电泳,(,变性,）,3.,转膜,(,注意,DNA,要小于,2kb,）,4.,封闭（预,杂交）,5.,杂交,6.,显影,40,核酸杂交常用几种膜的性能比较,41,Southern DNA,印迹杂交之,X,光显像图片,水稻,（,Oryza sativa L,.),的叶绿体,DNA,分别用核酸内切限制酶,Bgl(A-C),、,BamH,（,D-F,）、,EcoR,（,G-I,）、和,Hind,（,J-L,）消化，加样在含有,EB,染料的,1%,的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同,32,P,标记的,玉米,psbA,探针作,Southern,杂交。,X,光底片中显现的阳性条带，表明含有水稻的,psbA,基因序列。,42,三、,Northern,杂交,1979,年，,J.C.Alwine,等人发展而来，是将,RNA,分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与,Southern,印迹杂交技术十分类似，所以叫做,Northern,印迹技术（,Northern blotting,）。,43,Southern,杂交和,Northern,杂交的主要差别：,1.,对象不同（,DNA/RNA,）,2.DNA,在凝胶电泳分离后，用碱处理变性，形成单链。,RNA,一般是进行变性电泳，在分离,RNA,的同时消除二级结构。,RNA,变性电泳方法主要有甲醛变性电泳、羧甲基变性电泳和乙二醛变性电泳三种。,44,四、,Western,杂交,Western blotting,是用,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，然后将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素膜或其它支持物上,，,然后同放射性同位素标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技术广泛用于基因在蛋白质水平上的表达研究。,45,原理,聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺,(Acr),和交联剂,N,N-,甲叉双丙烯酰胺,(Bis),在加速剂,N,，,N,，,N,，,N,四甲基乙二胺,(,简称,TEMED),和催化剂过硫酸铵,(,简称,AP),作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳,(PAGE),。,46,原理,而,SDS-PAGE,仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由,shapiro,于,1967,年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。,47,十二烷基硫酸钠（,sodium dodecyl sulfate,，简称,SDS,）是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及与其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有的空间构象。特别是在强还原剂，如巯基乙醇存在下，由于蛋白质分子内的二硫键被还原剂打开，不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与,SDS,充分结合,.,蛋白质,-SDS,复合物在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质的,SDS,复合物的短轴长度都一样，约为,1.8nm,，而长轴则随蛋白质的分子量成正比变化。这样的蛋白质,-SDS,复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度，也就是蛋白质分子量的函数。,带负电荷的蛋白质,-SDS,复合物由于结合了大量的,SDS,，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异。,原理,48,实验原理,PAGE,根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液,pH,值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。,不连续系统中由于缓冲液离子成分，,pH,，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。,49,各部分凝胶配制,50,实验过程,1.,将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,准备,2,个干净的锥形瓶,.2.,把玻璃板在灌胶支架上固定好,.,固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板,.,3.,按比例配好分离胶,用移液管快速加入,大约,5,厘米左右,之后加少许蒸馏水,静置,40,分钟,.,凝胶配制过程要迅速,催化剂,TEMED,要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶,.,注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡,.,51,实验过程,.,水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡,凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面,.,4.,倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘,5mm,处,迅速插入样梳,静置,40,分钟,.,样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平,.,52,实验过程,5.,拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,没过锯齿时可拆去 底端的琼脂糖,.,要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果,.,6,、,加样三个。,（,1,）取,10l,标准蛋白溶解液于,EP,管内，再加入,10l 2,倍样品缓冲液，上样量为,20l,。（,2,）取,10l,样品,1,溶液，再加入,10l 2,倍样品缓冲液，上样量分别为,5l,和,10l,。,7.,用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在 沸水中加热,3,分钟，去掉亚稳态聚合。,注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下 沉时会发生扩散,.,为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样,.,53,实验过程,8.,电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在,10mA,，当进入分离胶后改为,20mA,，溴酚蓝距凝胶边缘约,5mm,时，停止电泳。,9.,凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色,1,小时左右。,10.,脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。,剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分,.,.,11.,实验结果分析,。,54,55,五、菌落原位杂交,也叫原位杂交，是指把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，使溶菌的,DNA,同滤膜原位结合，带有,DNA,的滤膜烘干后，与放射性同位素标记特异的,DNA,或,RNA,探针杂交。,是直接菌落或噬菌斑为对象来检测重组子的技术。,56,检测重组体克隆的菌落杂交技术,57,第三节、,PCR,技术,58,PCR,技术的创建,Kary B.Mullis,（穆利斯（美）,Khorana(1971),等提出在体外经,DNA,变性,与适当引物杂交,再用,DNA,聚合酶延伸,克隆,DNA,的设想。,1983,年,Mullis,发明了,PCR,技术,使,Khorana,的设想得到实现。,1988,年,Saiki,等将耐热,DNA,聚合酶（,Taq,）引入了,PCR,技术,1989,年美国,Science,杂志列,PCR,为十余项重大科学发明之首,比喻,1989,年为,PCR,爆炸年,Mullis,荣获,1993,年度诺贝尔化学奖。,59,一、,PCR,技术的基本成分,PCR,的成分包括：待扩增的模板、引物、,DNA,聚合酶、四种脱氧核苷酸的混合物以及反应缓冲液。,模板是含有待扩增序列的,DNA,或从,mRNA,反转录来的,cDNA,。,60,Taq,DNA,聚合酶（,thermus aquaticus),酶活性,(%),温度,(,),40 50 60 70 80 90 100,100,80,60,40,20,1988,年,Saiki,等将耐热,DNA,聚合酶（,Taq,）引入了,PCR,技术,61,Taq DNA,聚合酶,Characteristics of Taq Polymerase,62,PCR,的引物,是指与待扩增的靶,DNA,区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片断。,63,引物的设计原则：,1.,引物碱基,G,C,含量以,45%,55%,为宜。,2.,其长度通常在,1530,个核苷酸之间。,3.Tm,值应高于,55,。,引物的另一个重要参数是熔解温度（,Tm,）。这是当,50,的引物和互补序列表现为双链,DNA,分子时的温度,.Tm,对于设定,PCR,退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从,55,到,70,。,退火温度一般设定比引物的,Tm,低,5,。,2,个引物要有近似的,Tm,值，以免相差太大，引起非特异性扩增；一般退火温度为最高,Tm,值的引物温度减,5.,64,4.PCR,扩增的长度一般：,G,CA,。即当引物,3,末端为,A,时，即使有错配碱基也最不易延伸，所以引物设计时可将,3,末端设计为,A,，以提高复制精确性。另一种理论是,3,末端应设计为,G,或,C,，因为,G,和,C,的氢键多于,A,与,T,，能更好地与模板结合开始,DNA,合成，当然对错配延伸效率方面就不能苛求了。总而言之，引物的,3,末端不要考虑使用,T,。,6.,尽量减少自身配对。,7.,避免两条引物互补。,8.,引物要特异。,9.,可以在引物的,5,端加上合适的酶切位点。,一般引物自身配对形成茎环结构，茎的碱基对数不大于,3,，两条引物间配对碱基数小于,5,个。,65,引物的设计可以参照：,两分钟StepByStep学会引物设计软件,Primer premier5.0/oligo软件,dxy,核酸基因技术讨论版/生物信息学讨论版/PCR技术讨论版,:/www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/,primer/primer3_ cgi,引物设计,66,反应条件,1,PCR,缓冲液 常用的,1PCR,缓冲液为,10mmol,L Tris-HCl pH8.3(,常温,),，,50mmol,L KCl,，,1.5mmol,L MgCl2,。由试剂公司与,Taq,酶一起提供。,(1)Mg2+,离子浓度：,Mg2+,离子浓度对,PCR,反应影响很大，因为,Mg2+,与引物,-,模板及产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的生成、产物的忠实性、酶活力、产物的产量等诸多因素有关。,Mg2+,一般使用浓度为,0.5,2.5mmol,L,，必要时可以,0.5mmol,L,梯度间隔做,Mg2+,最适浓度试验。,67,(2)dNTP,：常用,dNTP,浓度为,20mol,L(,可用范围为,20,200mol,L),。,dNTP,的用量与,PCR,产量及产物忠实性有关，,dNTP,量过少时合成的产物减少。,(3)K,+,离子浓度：,PCR,反应中,K,+,离子的作用是促进,Taq,酶活力与促进引物退火，一般使用浓度是,50mmol,L,，但当,K,+,离子浓度高于,50mmol,L,时会抑制,Taq,酶活力。,68,2,模板,PCR,模板可以是,DNA,或,RNA,，,RNA,需反转录后再扩增。模板可以是基因组,DNA,或纯化的质粒,DNA,，当然两者的,DNA,量在,PCR,起始模板中相差很大。每个,PCR,反应中加入的模板数量可在,102,105,分子之间，必要时可低至,50,个分子，模板的量少时应酌情增加循环次数。小于,100ng,的哺乳动物细胞基因组,DNA(,相当于约,104,个细胞,),，经,30,个循环，,10,的反应物应能够在溴化乙锭染色的凝胶上看到一条主要产物带。使用较大量的模板时，循环数可减少；如果模板量很少，可能需要增加至,45,个循环反应。,69,3,引物浓度 常用引物浓度为,0.1,0.5mol,L,。随着引物浓度的降低，,PCR,反应的特异性提高但产物得率降低；随着引物浓度的升高，情况正好相反。,70,二、,PCR,技术的原理和过程,94,72,60,？,主要是为了保险起见，使模板,DNA,的二级结构充分打开。有些化学修饰的热启动酶这一步时间还要长，目的是充分释放酶活,71,温度（,）,时间（,min,）,94,72,60,94,变性（,1min,）,60,退火（,1min,）,72,延伸,（,1.5min,）,循环,1,循环,2,循环,3,PCR,反应的温度循环周期,PCR,反应的每一个温度循环周期都是由,DNA,变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是,94,变性,1min,，,60,退火,1min,，,72,延伸,1.5min,。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。,72,73,PCR,扩增过程中片段增殖的计算,74,PCR,反应体系的确立,Water,Buffer,（,10,）,Mg+,（,25mM,）,dNTPs,（,10mM,）,Primer1,（,10uM,）,Primer2,（,10uM,）,Taq,（,5U/uL,）,Templets,12.8,2,1.6,0.4,1,1,0.2,1,20uL,反应体系中各成分的母液浓度及加入量,PCR,扩增程序举例,Tem.,94,94,60,72,72,Time,00:08:00,00:00:30,00:00:40,00:01:00,00:07:00,Cycles,30,75,经典循环参数（,500bp,以内）,94 30s,55 45s,72 1min,94 5min,30,次,72 5min,42 forever,76,PCR,扩增结果分析举例,M 1 2 3 4 5 6 7 M,M,marker;1-2,PCR for CP4-EPSPS gene;3-4,PCR for 35S Promoter;5-6,PCR for lectin gene;7,Negtive control.,77,PCR,常见问题,无扩增产物,非特异性扩增,拖尾,假阳性,78,PCR,常见问题之一,无扩增产物,模板,:,含有抑制物，含量低,Buffer,对样品不合适,引物设计不当或者发生降解,反应条件：,退火温度太高，延伸时间太短,原因,对,策,纯化模板或者使用试剂盒提取模板,DNA,或加大模板的用量,更换,Buffer,或调整浓度,重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物,降低退火温度、延长延伸时间,现象：,正对照有条带，而样品则无,；,79,PCR,常见问题之二,非特异性扩增,现象：,PCR,扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。,80,PCR,常见问题之二,引物特异性差,模板或引物浓度过高,酶量过多,Mg,2+,浓度偏高,退火温度偏低,循环次数过多,原因,对,策,重新设计引物或者使用巢式,PCR,适当降低模板或引物浓度,适当减少酶量,降低镁离子浓度,适当提高退火温度或使用二阶段温度法,减少循环次数,非特异性扩增,81,PCR,常见问题之三,拖尾,现象：,产物在凝胶上呈,Smear,状态,。,M 1 2,82,PCR,常见问题之三,模板不纯,Buffer,不合适,退火温度偏低,酶量过多,dNTP,、,Mg,2+,浓度偏高,循环次数过多,原因,对,策,纯化模板,更换,Buffer,适当提高退火温度,适量用酶,适当降低,dNTP,和,镁离子,的浓度,减少循环次数,拖尾,83,上样缓冲液有几种，但基本都包括溴酚蓝和二甲苯氰FF。,Tris-乙酸盐和EDTA缓冲液（pH8.,TTTTTTTTTTTTTTp 5,Southern于1975年首先设计出来的，故又叫Southern DNA 印迹转移技术。,在PCR开始前增加50的保温步骤，UNG酶即可将反应体系中已有的U-DNA污染物中的尿嘧啶碱基降解，并在随后变性这步的条件下DNA链断裂,消除由于污染DNA产生的扩增，从而保证扩增结果的特异性，准确性。,有几种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳,采用dUTPUNG酶防污染，有效降低污染机会。,3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药 物对蛋白质之间相互作用的影响,Mg2+一般使用浓度为0.,双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：,TTTTTTTTTTTTTTp 5,酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。,PCR,常见问题之四,假阳性,（筛选转基因、检测基因表达情况,),原因：,靶序列或扩增产物的交叉污染,现象：,空白对照出现目的扩增产物,对策：,操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；,除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。,各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。,84,三、荧光定量,PCR,是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对,PCR,产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程结合相应软件可以对产物进行分析，计算待测样品的初始模板量。,荧光定量,PCR,仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的,PCR,仪，通常配有电脑系统及相应的软件。,标记方法主要有：内插染料、双标记探针、分子信标等。,85,SYBR GREEN I,1,、,SYBR Green,法,86,87,SYBR Green,熔解曲线分析,88,2,、,TaqMan,探针法,89,TaqMan,作用机理,90,Molecular beacon,？,91,荧光定量,PCR,的优点,1.,全封闭的,PCR,过程，无需跑胶。,2.,采用,dUTP,UNG,酶防污染，有效降低污染机会。,原理：,UNG,酶的作用原理是选择性水解断裂含有,dU,的双链或单链,DNA,中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的,DNA,链，在碱性介质以及高温下会进一步,水解断裂，从而被消除,.UNG,酶的最佳活性温度为,50,，,95,灭活。,作用：为保证,PCR,结果的准确性，要预防非特异性,PCR,扩增和污染。常用的措施是使用,UNG,酶,(Uracil-N-Glycosylase),和,Taq,酶热启动。,PCR,反应最常见,最重要的污染物是,PCR,产物,防污染热启动,PCR,试剂盒以,dUTP,取代,dTTP,，所以,PCR,产物都是含有,dU,的,DNA,链。,在,PCR,开始前增加,50,的保温步骤，,UNG,酶即可将反应体系中已有的,U-DNA,污染物中的尿嘧啶碱基降解，并在随后变性这步的条件下,DNA,链断裂,消除由于污染,DNA,产生的扩增，从而保证扩增结果的特异性，准确性。同时,UNG,酶被灭活,不会再降解新扩增的产物,U-DNA,。,92,3.,对样品扩增的整个过程进行实时监控。,4.,使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了,PCR,反应的特异性。,5.,在样品扩增反应的最佳阶段进行数据采集，增加了定量的精确性。,6.,线性关系直接。,7.,结果分析更加快捷方便。,荧光定量,PCR,的优点,93,第四节、生物芯片,美国,财富,杂志载文指出，在,20,世纪科技史上有两件事影响深远，一是微电子芯片，它是计算机和许多家电的心脏，它改变了我们的经济和文化生活，并已进入每一个家庭；另一件事就是生物芯片，它将改变生命科学的研究方式，革新医学诊断和治疗，极大地提高人口素质和健康水平。,94,第四节、生物芯片,生物芯片就是在一块指甲大小的玻片、硅片、尼龙膜等材料上放上生物样品，然后由一种仪器收集信号，用计算机分析数据结果。目前制备芯片的固相材料有玻片、硅片、金属片、尼龙膜等。,生物芯片主要分为基因芯片和蛋白芯片。,95,一、基因芯片,基因芯片技术是指将大量寡核苷酸或,DNA,探针（与核酸分子杂交相反，亦称靶基因）按特定的排列方式固化在固相支持物表面，按碱基互补配对的原则，与标记的特异的单链,DNA,或,RNA,（待测样品）分子杂交形成双链，通过对杂交信号的检测分析，即可得出样品分子的数量和序列信息。,由于基因芯片上固定的探针可以是,cDNA,、寡核苷酸或来自基因组的基因片段，且这些探针固化于芯片上形成基因探针阵列，故基因芯片又被称为,DNA,芯片、,DNA,阵列、,cDNA,芯片、寡核苷酸阵列等。,96,DNA,芯片技术工作流程主要包括：芯片的制备、样品的准备与标记、杂交、信号检测和数据分析处理，其中最关键的是芯片的制备。,DNA,芯片基本应用可分为两个主要方面：定量分析（主要指测序和突变检测）与定性分析（主要指对基因表达的研究）。,如：,1.DNA,序列测定,2.,突变及多肽性分析,3.,基因表达分析,4.,基因组研究,5.,基因诊断,6.,药物研究与开发,97,基因芯片杂交检测流程图,98,二、蛋白芯片,蛋白芯片是以蛋白质代替,DNA,作为检测对象。,其原理是将各种蛋白质有序的固定于某种介质的载体上成为检测的芯片，然后用标记了有特定荧光物质的抗体与芯片作用，与芯片上的蛋白质相匹配的抗体将与其对应的蛋白质结合，在将未与芯片上的蛋白质互补的抗体洗去之后利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，检测芯片上各点的荧光强度，在通过计算机分析蛋白质之间的相互关系以及基因表达功能等。,99,基因文库的基本概念,从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为：,基因组文库,（含有全部基因）,cDNA,文库,（含有全部蛋白质编码的结构基因）,第五节、基因文库构建,100,一、基因组文库,基本步骤,:,1.,分离基因组,DNA,2.DNA,的断裂,物理剪切,(,包括吹吸、振荡和超声波）和限制性酶解,3.DNA,片断的分离与连接,4.,包装，转染或者转化,101,二、,cDNA,文库的构建,基本步骤：,1)mRNA,分离、纯化和分级分离,2)cDNA,的合成,3),与载体的连接,4),转化,102,RNA,提取流程,样品前处理注意点,选择新鲜血液，不得超过,4,小时,选择新鲜的幼嫩组织,选择处于生长旺盛的时期收集细胞,选择新鲜组织，生长旺盛的组织,103,可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到的白细胞,然后加入一定量的,TRNzol,，,-70,保存较长时间,去掉培养基，加入一定量,TRNzol,-70,保存较长时间,推荐使用,专门的,RNA,样品,储存液,进行储存,液氮或加入,RNase,抑制剂中保存，,避免反复冻融,RNA,提取流程,样品前处理中如何保存样本,104,所有,RNA,的提取过程中都有五个关键点,，即,样品细胞或组织的有效破碎；,有效地使核蛋白复合体变性；,对内源,RNA,酶的有效抑制；,有效地将,RNA,从,DNA,和蛋白混合物中分离；,对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。,但其中最关键的是抑制,RNA,酶活性,105,模板mRNA 的质量直接影响到cDNA 合成的效率。在提取过程中要严格防止RNA 酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。,所有的组织中均存在RNA 酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。,106,所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200烘烤2 小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理。,DEPC 是RNA 酶的化学修饰剂,它和RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC 水溶液会致癌,因而使用时需小心。,107,RNA,提取的通用方法,RNA,提取的一般步骤,RNA,提取的一般步骤是,：,破碎组织,分离,RNA,沉淀,RNA,洗涤,RNA,融解,RNA,保存,RNA,.,108,破碎组织和灭活,RNA,酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、,SDS,、蛋白酶,K,等破碎组织,加入,-ME,可以抑制,RNA,酶活性。,分离,RNA,一半用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，,RNA,一般分布于上层，与蛋白层分开。,沉淀,RNA,一般用乙醇、,3M NaAc,（,pH-5.2,）或异丙醇。,洗涤,RNA,使用,70,乙醇洗涤，有时，为避免,RNA,被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。,RNA,提取的通用方法,109,二、,cDNA,克隆片段的获得,cDNA,第一链的合成,第二链的合成,双链,DNA,末端的处理,110,mRNA,1.c,DNA,第一链的合成,5ppp5,G,G,AAAAAAAAAAAAAA,OH,3,5ppp5,G,G,AAAAAAAAAAAAAA,OH,3,TTTTTTTTTTTTTT,p,5,5ppp5,G,G,AAAAAAAAAAAAAA,OH,3,TTTTTTTTTTTTTT,p,5,cDNA,第一链,引物,退火,逆转录酶,dNTPs,111,2.c,DNA,第二链的合成,煮沸,NaOH,自身引导法：,获得的双链,cDNA 5,端会有几对碱基缺失,AAAAAAAAAAAAAA,5,ppp,5,G,G,AAAAAAAAAAAAAA,OH,3,TTTTTTTTTTTTTT,p,5,TTTTTTTTTTTTTT,p,5,TTTTTTTTTTTTTT,p,5,AAAAAAAAAAAAAA,OH,3,TTTTTTTTTTTTTT,OH,3,Klenow,dNTPs,S1,112,3),第二链,cDNA,的合成,氢氧化钠消化杂合双链中的,mRNA,链,第一链,cDNA,的,3-,末端就会形成一个发夹环,合成第二链,cDNA,S1,核酸酶消化连接处,自身引导法合成,cDNA,第二链,113,DNApol dNTPs,RNaesH,置换合成法：,获得的双链,cDNA 5,端也会有几对碱基 缺失,5ppp5,G,G,AAAAAAAAAAAAAA,OH,3,TTTTTTTTTTTTTT,p,5,AAAAAAAAAAAAAA,p,5,5,S1,AAAA,TTT,OH,3,TTTTTTTTTTTTTT,p,5,5,TTTTTTTTTTTTTT,OH,3,AAAAAAAAAAAAAA,5,5,TTTTTTTTTTTTTT