病原体分子诊断技术进展.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,病原体分子诊断技术进展,1,分子诊断概念和特点,概念：利用标本中的,核酸,作为检测对象，对感染性疾病、肿瘤、遗传性疾病等进行诊断和预后判断的方法。,特点,特异性高、灵敏度高,稳定性高,诊断范围广、适应性强,临床应用前景好,2,什么是核酸？,链状分子,DNA(,脱氧核糖核酸,),贮存遗传信息,RNA(,核糖核酸,),传递遗传信息,遗传信息的传递途径,DNA,RNA,蛋白质,转录,逆转录,3,DNA,和,RNA,的区别,糖基,+,Base,Nucleoside,+,Phosphate,P,Nucleotide,A,、,DNA,和,RNA,的主要区别就在,骨架上,的糖基。,B,、,DNA,很稳定，,RNA,不稳定,。,4,RNA,和,DNA,的结构,dsDNA,ssDNA,ssRNA,5,通常,RNA,在细胞中拷贝数远高于,DNA,的拷贝数,一个或几个拷贝,DNA,可达,10000,个拷贝的核糖体,RNA(rRNA),One Cell Contains:,6,如使用,rRNA,为靶标，将极大地提高了,取样效率和扩增检测灵敏度,A,、如果,2ml,样本含有,1,个细菌,取,0.2ml,样本，最终得到细菌的几率是,1/10,。,Sample,Cell Lysis,Target RNA,Released,B,、,如果,2ml,样本含有,1,个细菌,先裂解，后取样，,2ml,样本含有,10000,个,rRNA,。,取,0.2ML,样本，可得到,1000,个分子,7,主要的核酸扩增技术,DNA,扩增技术,A,、,PCR,：使用,Taq,酶进行扩增，温度循环；,RT-PCR,将,RNA,变成,DNA,，再进行,DNA,扩增,B,、实时荧光,PCR,：扩增与,PCR,相同，采用,实时闭管荧光检测,（分子信标，,Taqman,探针等）,RNA,扩增技术,A,、,TMA,：恒温扩增，使用,RT,酶和,T7,酶；终点杂交保护检测,B,、,SAT,：扩增与,TMA,相同，,采用实时闭管荧光检测,（分子信标）,8,实时闭管荧光检测常见技术,9,PCR,原理,10,Real-Time PCR,11,TMA,原理,12,SAT,原理（实时荧光,TMA,）,13,SAT,与,PCR,技术原理比较,RT,RNA,cDNA,RT,1000 copies,T7,SAT,DNA,Taq,Taq,PCR,30,分钟内,扩增,10,10,倍,14,DNA,扩增技术（,PCR,）用于病原体,检验的不足,不能区分“活菌”“死菌”,与临床相关性差,不能区分“潜伏感染”“活动性感染”,临床意义小，如,CMV,交叉污染,变温检测，对仪器要求高,反应易受抑制,15,RNA,扩增技术用于病原体,检验的优势,可以区分“死菌”“活菌”：病原体死亡，,RNA,很快降解,与临床相关性好（培养），减少无效治疗，比如抗生素滥用,可以诊断“活动性感染”,活动性感染：指示,RNA,转录活跃,潜伏感染：指示,RNA,不转录,不易污染：靶标和扩增产物都是,RNA,灵敏度高：,RNA,拷贝数,DNA,拷贝数,16,RNA,诊断产品的商品化程度及应用,FDA,或,CE,认证产品（,TMA,）,SFDA,认证 产品（,SAT,）,沙眼衣原体（,CT,）核酸检测试剂盒（,RNA,恒温扩增）,淋病奈瑟菌（,NG,）核酸检测试剂盒（,RNA,恒温扩增）,解脲脲原体（,UU,）核酸检测试剂盒（,RNA,恒温扩增）,结核分子杆菌（,TB,）核酸检测试剂盒（,RNA,恒温扩增）,.,为什么我们必须熟悉和了解,RNA,扩增技术？（一）,17,为什么我们必须熟悉和了解,RNA,扩增技术？（二）,血液筛查市场,美国,中国,RNA,诊断,RNA,诊断,传统技术,传统技术,其他传染病市场（优生优育：,CT/NG,为例）,RNA,诊断,传统技术,传统技术,美国,中国,100%,进口！,有部分国产,18,RNA,用于,TB,的检测（,TMA,）进入多国诊疗指南,1996,：美国,CDC,首个,NAAT,技术在,TB,实验室诊断的应用的指南,TMA,通过,FDA,认证，配合培养法对涂阳患者进行诊断,2000,：美国,CDC,更新,NAAT,法在,TB,实验室诊断中应用的指南,TMA,用于,TB,疑似患者,(,涂阳、涂阴,),痰液检测、,PCR,用于,TB,涂阳患者的痰液检测,2007,：加拿大卫生部,TB,诊断标准,为什么我们必须熟悉和了解,RNA,扩增技术？（三）,19,什么样的病原体需要分子诊断？,传统方法不能及时检测或鉴定的病原体。,难培养的,如,CT,、,MG,、手足口病毒,培养较慢的,如,TB,镜检容易弄错的,如,NG,、,T.vaginalis,免疫交叉反应较多的,如,CT,需要分型的,如,HPV,、,HSV,胞内病原体,如衣原体、支原体、病毒,20,与,PCR,、,TMA,等相比，,SAT,改进了捕获方法（一）,靶标核酸,捕获核酸,磁珠,Oligo dT,Oligo dA,优点：,几乎去除了所有抑制剂,允许使用大体积样本,可同时处理多种样本,21,与,PCR,、,TMA,等相比，,SAT,开发了全自动样本处理方法（二）,全自动样本处理工作站,特点,不需要任何样本前处理,国内唯一全自动尿样（血样等）处理系统,1.5,小时，,96,个样本,（,RD Mag-96,）,样本,提取,反应液制备,一体化,22,SAT,应用例一（,CT/NG,尿液检测，国内唯一）,CT/NG,尿液检测,CT,女性感染人群中,70%,以上,无临床症状,男性感染人群中,50%,无临床症状,NG,女性感染人群中,60%,无临床症状,男性感染人群中,20%,无临床症状,CT,的反复感染不仅导致不育，而且,增加感染淋球菌、,HIV,、,HBV,等风险（,6,8,倍）,【1】,【1】,李跃进,谭湘芳,.,荧光定量,PCR,检测性病的结果分析,J.,实用医技杂志,2007,14(16):2151.,23,RNA,（,TMA,）检测尿液中的,CT,（美国）,尿液样本的灵敏度、特异性与拭子相当,Systematic Review,:Noninvasive Testing for Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae.Ann Intern Med.2005;142:914-925.,24,SAT,国内数据,检测样本量：,1050,例,CT-SAT,拭子,尿液,NG-SAT,拭子,尿液,CT,感染拭子和尿液灵敏度对比,NG,感染拭子和尿液灵敏度对比,25,SAT,应用例二（结核分枝杆菌检测）,操作流程,痰液预处理,超声波处理,15min,预热,15min,恒温扩增,40min,耗时,2,小时,26,1,、以临床诊断的结果为金标准，对,253,例结核患者痰标本；,134,例其他呼吸道感染患者标本同时进行涂片、,TB-SAT,、,Bactec MGIT 960,检测。,参数,方法,临床诊断,灵敏度,(%),特异度,(%),阳性预测值,(%),阴性预测值,(%),阳性,阴性,TB-SAT,总样本,阳性,171,0,67.6,100,100,62.0,阴性,82,134,涂片阳性,阳性,120,0,97.6,100,100,40.0,阴性,3,2,涂片阴性,阳性,51,0,39.2,100,100,62.6,阴性,79,132,MGIT 960+,菌种鉴定,总样本,阳性,156,0,61.7,100,100,58.0,阴性,97,134,涂片阳性,阳性,118,0,95.9,100,100,28.6,阴性,5,2,涂片阴性,阳性,38,0,30.2,100,100,60.0,阴性,88,132,SAT,检测痰液标本中的结核杆菌,27,28,其他,科研,临床检验,血液筛查,传染病,癌症检测,遗传检测,HIV,HCV,HBV,Syphilis,细菌支原体,CT,NG,UU,TB,MG,MP,病毒检测,HIV,HCV,HBV,HPV,EV/EV71/CA16,Flu A/H1N1,HCMV,前列腺癌,直肠癌,乳腺癌,巨细胞瘤,其它肿瘤,工业界,学术研究用,食品安全,水污染检测,环境污染检测,国防生物反恐,动植物检疫,农业病害,耐药性检测,MRSA,VRE,MDR-PA,MDR-AB,MDR-TB,ESBLs,SAT,其它产品,29,小结,RNA,诊断技术，包括,SAT,，应用于传染病诊断具有明显的优势。,我们预期，在接下来的十年里，,RNA,诊断技术将对传染病的诊断带来革命性的变化。,30,