DNA重组技术的基本工具陕西省柞水中学-索文斌.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,返回,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,返回,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,生物 选修3现代生物科技专题,陕西省柞水中学 索文斌,专题1 基因工程,基础理论和技术的发展催生了基因工程,20世纪中叶，,基础理论,取得了重大突破,1.DNA是遗传物质的证明,2.DNA双螺旋结构和中心法则的确立,3.遗传密码的破译,技术发明使基因工程的实施成为可能,1.基因转移载体的发现 2.工具酶的发现,3.DNA合成和测序技术的发明,4.DNA体外重组的实现,5.重组DNA表达实验的成功,6.第一例转基因动物问世 7.PCR技术的发明,生长快、肉质好的转基因鱼(中国),乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷),基本工具：,限制性核酸内切酶“分子手术刀”,DNA连接酶“分子缝合针”,基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,二、DNA重组技术的基本工具,黏性末端,黏性末端,黏性末端：,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的,核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,1、限制性核酸内切酶“分子手术刀”,当限制酶,从识别序列的,中心轴线处,切开时，,产生的是,平末端,。,当限制酶,从识别序列的,中心轴线两侧,切开时，,产生的是,黏性末端。,识别双链DNA分子的某种,特定的核苷酸序列,，并且使每一条链中,特定部位,的两个核苷酸之间的,磷酸二酯键,断开。(,6个,4、5、8个),主要是从,原核生物,中分离纯化出来的一种酶。,4000种。,（1）来源：,（2）种类：,（3）作用：,（4）结果：,形成两种末端,黏性末端,平末端,1、限制性核酸内切酶“分子手术刀”,（小结）,(2011,年雅礼中学高二检测,),基因工程中，须使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶,的识别序列和切点是,G,GATCC,，限制酶,的识别序列和切点是,GATC,。根据图示判断下列操作正确的是,(,),例1,A,目的基因和质粒均用限制酶,切割,B,目的基因和质粒均用限制酶,切割,C,质粒用限制酶,切割，目的基因用限制酶,切割,D,质粒用限制酶,切割，目的基因用限制酶,切割,【解析】,首先把目的基因切下来要用到限制酶,；如果再用限制酶,切割质粒，则,2,个标记基因都被切开，标记基因将失去作用。而用限制酶,切割质粒可保留一个标记基因，而产生的黏性末端和限制酶,切割下来的目的基因可以互补配对。,【互动探究】,上题中限制酶切开化学键后产生哪种,类型的末端？,【尝试解答】,D,【提示】,黏性末端。,【易误警示】,(1),限制性核酸内切酶是一类酶而不是一种酶。,(2),限制性核酸内切酶作用的化学键为磷酸二酯键，而不是氢键。,(3),不同种类的限制性核酸内切酶识别与切割的位点不同，这与酶的专一性是一致的。,要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？,要切两个切口，产生四个黏性末端，两个。,如果把两种来源不同的,DNA,用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性末端。,是不是,把两者的黏性末端黏合起来，,这样就真的合成,重组的,DNA,分子了,?,实际还不够,还需要DNA连接酶进行连接。,思考题：,1、种类：,Ecoli DNA,连接酶,（黏性末端）,T,4,DNA,连接酶,（,黏性末端和平末端,）,磷酸二酯键,DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。,2、DNA连接酶“分子缝合针”,2、作用部位：,与,DNA,有关的各种酶比较,名称,作用,参与生理过程应用,作用位点,(,如图,),DNA,连接酶,连接两个,DNA,片段,基因工程,a,限制性内切酶,切割某种特定的脱氧核苷酸序列,a,DNA,聚合酶,在脱氧核苷酸链上添加单个脱氧核苷酸,DNA,复制,a,名称,作用,参与生理过程应用,作用位点,(,如图,),RNA,聚合酶,在核苷酸链上添加单个核苷酸,转录,a,解旋酶,使碱基间氢键断裂形成单脱氧核苷酸链,DNA,复制及转录,b,逆转,录酶,以,RNA,为模板合成,DNA,逆转录、基因工程,DNA,连接酶和,DNA,聚合酶都是形成磷酸二酯键，而不是氢键，氢键是分子间的静电吸引力，不需通过酶催化形成。,DNA,连接酶只能在两个,DNA,片段间形成磷酸二酯键，而,DNA,聚合酶只能将单个核苷酸加到已有,DNA,片段上，且需要以一条,DNA,链为模板。,目前发现的,DNA,连接酶不具有连接单链,DNA,的能力。,特别提醒,(2011,年北大附中高二检测,),下列关于,DNA,连接酶的叙述正确的是,(,),催化相同黏性末端的,DNA,片段之间的连接,催化不同黏性末端的,DNA,片段之间的连接,催化两个黏性末端互补碱基间氢键的形成,催化,DNA,分子两条链的脱氧核糖与磷酸之间磷酸二酯键的形成,A,B,C,D,例2,【尝试解答】,D,【解析】,在,DNA,重组技术中，两个,DNA,片段间必须有相同的黏性末端才能互补配对，进行结合；具有相同黏性末端的,DNA,分子连接时，,DNA,连接酶的作用是催化脱氧核苷酸链的脱氧核糖与磷酸之间磷酸二酯键的形成，即把,“,梯子,”,的,“,扶手,”,缝合起来。,【探规寻律】,限制酶与DNA连接酶的关系,跟踪训练,两个具有相同黏性末端的,DNA,片段，在条件适宜时，经酶的作用合成一个重组,DNA,分子。该酶是,(,),A,DNA,连接酶,B,RNA,聚合酶,C,DNA,聚合酶,D,限制性内切酶,解析：,本题考查几种酶的作用。,DNA,连接酶可以连接两个,DNA,片段之间的磷酸二酯键形成一个,DNA,分子；,RNA,聚合酶可以催化单个游离的核糖核苷酸形成,RNA,；,DNA,聚合酶可以催化单个游离的脱氧核糖核苷酸形成,DNA,；限制性内切酶可以将,DNA,分子从特定的位点切割成两个,DNA,片段。,答案：A,3、,基因进入受体细胞的运载体“分子运输车”,（1）运载体的作用,作为运载工具，将外源基因,(,抗虫基因,),转移到受体细胞,(,棉花细胞,),中去。,利用运载体在受体细胞,(,棉花细胞,),内，对外源基因,(,抗虫基因,),进行大量复制。,（随载体的复制而复制）,（2）作为运载体必须具备的条件,能够在宿主细胞中自我复制并稳定地保存。,具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。,具有某些标记基因，便于进行筛选。,必需是安全的，不会对受体 细胞有害。,大小应适合，便于提取和操作,（3）常用的运载体,3、,基因进入受体细胞的运载体“分子运输车”,细菌细胞质的质粒,噬菌体的衍生物,动植物病毒,注意：真正用作运载体的质粒都是人工改造过的。,3、,基因进入受体细胞的运载体“分子运输车”,最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，,其中常含有抗药基因，,如四环素的,标记基因。,质粒的存在与否对宿主,细胞生存没有决定性作用，但复制,只能在宿主细胞内成。,质粒是,一种裸露的、结构简单、独,立于细菌染色体（即拟核DNA）之外，,并且具有自我复制能力的双链环状,DNA分子。,质粒是基因工程最常用的运载体。,如图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下列问题。,例3,(3),氨苄青霉素抗性基因在质粒,DNA,上称为,_,，其作用是,_,。,(4),下列常在基因工程中用作载体的是,(,),A,苏云金芽孢杆菌抗虫基因,B,土壤农杆菌中的,RNA,分子,C,大肠杆菌的质粒,D,动物细胞的染色体,【思路点拨】,本题通过质粒结构的模式图考查质粒的功能和特点，分析如下：,如图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下列问题。,例3,DNA,能够自我复制,具有遗传效应,CGCGT,A,DNA连接酶,(3),氨苄青霉素抗性基因在质粒,DNA,上称为,_,，其作用是,_,。,(4),下列常在基因工程中用作载体的是,(,),A,苏云金芽孢杆菌抗虫基因,B,土壤农杆菌中的,RNA,分子,C,大肠杆菌的质粒,D,动物细胞的染色体,标记基因,供重组DNA,的签定和选择,C,【探规寻律】,(1),主动运输中载体的化学本质是蛋白质，其作用是运输离子、氨基酸、核苷酸等物质进出细胞。,(2),基因工程中的载体的化学本质是,DNA,，其作用是携带目的基因进入受体细胞。,（补充知识）基因的结构,1、原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。,转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。,转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。,原核细胞的基因结构,能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质,编码区,非编码区,不能转录为信使RNA，,不能编码蛋白质,。,有调控遗传信息表达的核苷酸序列，,在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。,启动子,2、真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,与RNA聚合酶,结合位点,内含子,外显子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,内含子：,外显子：,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区:,外显子：能编码蛋白质的序列,内含子：不能编码蛋白质的序列,有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,启动子与起始密码,启 动 子,起 始 密 码,位 置,DNA上基因的非编码区，在编码区上游段（左侧）,位mRNA上的开始即单链信使RNA（转录产物）,功 能,转录时与RNA聚合酶结合，对转录mRNA起调控作用。,是翻译的开始，是肽链延伸的第一个氨基酸的位点。,