原核生物基因表达的调.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第,11,章 原核生物基因表达的调控,每一种生物基因组都含有一定数目的基因，但这些基因在一个细胞里并不同时表达，表达强度也不一定相同。以大肠杆菌为例，其基因组总共能编码几千种蛋白质，但在正常的生长条件下，一个细胞仅合成,600800,种不同的蛋白质。,生物体内的基因根据表达的状况可分为管家基因,(house-keeping genes),、奢侈基因,(luxury genes),。,管家基因：始终或经常性开启的基因,是维持细胞基本生命活动所必须的，如编码组成型蛋白的基因。,奢侈基因：指编码组织特异性蛋白的基因，对细胞分化有重要影响，如大肠杆菌被乳糖诱导的基因等。,原核生物是单细胞生物，需要随时根据环境条件变化调整自身基因的表达。原核生物细胞中没有形成细胞器，基因转录与翻译同时发生，,mRNA,半衰期极短，在几分钟内就被降解，因此一种,mRNA,必须持续转录才能维持蛋白质的合成。,原核生物基因表达的调控主要是在转录水平，以便能更加便捷和有效地调节细胞内一种蛋白质的水平。,许多调节蛋白属于别构蛋白，细胞中某些特定的物质能与它们结合，使调节蛋白的构象发生变化，从而改变它们与操纵基因的结合活性，影响到基因转录的活性，这些特定物质统称为别构效应物。不论是激活蛋白，还是阻遏蛋白，其活性都可能受到别构效应物的影响,。,原核生物更倾向于使用负调控，真核生物更倾向于使用正调控,。,原核生物的,DNA,基本上是裸露的，它们的基因表达默认状态是开放的，调节基因表达的主要方式是改变默认状态,即负调控。,真核生物的,DNA,与大量蛋白结合形成复合物，是基因表达的一种天然障碍，它们的基因表达默认状态是关闭的，调节基因表达的主要方式是激活,即正调控。,11.2 DNA,水平的调控,11.2.1,启动子序列对基因表达的调控,不同基因的启动子序列与一致序列可能不同，与,RNA,聚合酶的亲和力就不同，从而造成转录起始效率的差别,。具有强启动子的管家基因的转录水平要高于具有弱启动子的管家基因。,11.2.2 DNA,重组对基因表达的调控,鼠伤寒沙门氏菌是一种带有鞭毛的细菌,。构成其鞭毛的蛋白质有,H1,和,H2,两种。任何一个沙门氏细菌只表达这两种鞭毛蛋白中的一种，在同一个细胞内从不同时表达。随着一群细胞的生长和分裂，某些子代细胞会发生相变，即自发地改变其鞭毛蛋白的表达样式，以逃避宿主免疫系统的攻击。,图,11-2,鼠伤寒沙门氏菌相变的分子机制,11.3,转录水平的调控,11.3.1,转录起始阶段的调控,11.3.1,不同 因子的选择性使用,原核生物识别启动子序列的是 因子，不同的 因子可识别不同的启动子序列。大肠杆菌主要使用,。在特殊条件下其他类型的 因子被表达或激活，启动其他基因的表达。,热激条件使 失活，同时增强,rpoH,基因的表达；,rpoH,基因的产物,与,RNA,聚合酶核心酶组装成全酶，与热激基因的启动子结合，启动,Hsp,的表达,。,图,11-3 ,因子的选择性使用与热激基因的表达调控,图,11-4 ,因子的级联与,SPO1,噬菌体不同时期基因表达之间的关系,11.3.1.2,操纵子调控模型,操纵子,(operon),是原核生物基因表达和调控最重要的形式,。,11.3.1.2.1,操纵子的基本结构,(1),启动子,(2),结构基因,(3),操纵区,(operator),指能被调节蛋白特异性结合的一段,DNA,序列，常与启动子相邻或重叠，当调节蛋白结合在操纵子序列上，会影响其下游基因的转录。,(4),调节基因,调节基因编码能与操纵基因结合的调节蛋白。,11.3.1.2.2,操纵子的类型,诱导型操纵子：一般控制与分解代谢有关酶的表达，需要诱导物与阻遏蛋白结合或诱导物与激活蛋白结合，如乳糖操纵子、麦芽糖操纵子。,阻遏型操纵子：通常控制与合成代谢有关的基因表达，需要辅阻遏物与阻遏蛋白解离或辅阻遏物与激活蛋白的解离，如色氨酸操纵子、组氨酸操纵子。,11.3.1.2.3,乳糖操纵子,1940,年，,Monod,发现：,E.coli,在含葡萄糖和乳糖的培养基上生长时，细菌先利用葡萄糖，葡萄糖耗尽后，才利用乳糖；在糖源转变期，细菌的生长会出现停顿，即产生“二次生长曲线”。,Jacob,和,Monod,提出操纵子学说，获诺贝尔奖。,(1),乳糖操纵子的负调控,lacZ,基因编码,-,半乳糖苷酶，催化很少一部分乳糖异构化为别乳糖，绝大多数乳糖水解为半乳糖和葡萄糖。,lacY,基因编码半乳糖透过酶，使,-,半乳糖苷透过细胞壁和细胞膜进入细胞内。,lacA,基因编码乙酰转移酶，催化半乳糖的乙酰化。,乳糖对,半乳糖苷酶的合成有诱导作用。,葡萄糖对,半乳糖苷酶的合成有抑制作用。,图,11-5 -,半乳糖苷酶催化的水解和异构化反应,Z,Y,A,O,P,结构基因,Lac I,P,调控基因,半乳糖苷酶,半乳糖苷,透性酶,半乳糖苷,乙酰转移酶,阻遏,蛋白,催化,-,半乳糖苷,水解,将,-,半乳糖苷,转入细胞,将乙酰,CoA,的乙酰基转移到,-,半乳糖苷上,启动子,(,lac P),操纵基因,（,lac O,）,Z,Y,A,O,P,结构基因,操纵基因,（,lac O,）,Lac I,P,调控基因,阻遏,蛋白,阻遏蛋白,存在时，阻止,Lac,操纵子转录。,阻遏蛋白,缺乏,或,无活性,时，,Lac,操纵子的基因开启。,RNA pol,乳糖操纵子的负调控,可诱导的负调控,Z,Y,A,O,P,结构基因,操纵基因,（,lac O,）,Lac I,P,调控基因,阻遏,蛋白,诱导物,诱导物-阻遏蛋白复合物,诱导物(如乳糖、,IPTG),存在时，与阻遏蛋白结合，改变阻遏蛋白的构象，使其不能与,LacO,结合，基因开始转录。,mRNA,安慰诱导物,(gratuitous inducer),：能高效诱导酶的合成但不被所诱导的酶分解的分子。,如：,IPTG,(,异丙基硫代半乳糖苷,),lacO,是,-5至+21,的序列，与启动子右末端重叠,操纵基因,(,operator,O),是原核生物操纵子中被调控蛋白识别并结合的,DNA,区域。,lacO,的序列，以+11为对称轴具有,反向重复序列,图,11-6,lac,操纵子的负调控,乳糖操纵子属于可诱导型操纵子，这类操纵子通常是关闭的，当受效应物作用后，被诱导开放。这类操纵子使细菌能适应环境的变化，最有效地利用环境提供的能源底物。当细菌在没有乳糖的培养中生长时，阻遏蛋白同乳糖操纵子的操纵基因区域结合，阻止转录的进行。,(2),乳糖操纵子的正调控,当乳糖和葡萄糖同时存在时，大肠杆菌出现葡萄糖效应：即在有葡萄糖存在时，细菌优先利用环境中的葡萄糖，即使有诱导物乳糖存在，乳糖操纵子也处于被抑制的状态，直至葡萄糖消耗完才解除抑制，此时细菌才利用乳糖生长。乳糖的存在仅仅是乳糖操纵子开放的必要条件，而非充要条件。,乳糖操纵子的开放需要,CRP(cAMP,受体蛋白,),的正调控。只有在负调控消失、正调控起作用时，乳糖操纵子才能开放。,启动子,Z,Y,A,lac O,cAMP-CAP,位点,RNA,聚合酶作用位点,cAMP-CAP,结合结合于启动子上游的激活区域，帮助,RNA,聚合酶,形成开放型起始复合物,，促进转录起始。,分解代谢物激活蛋白,(,Catabolite activator protein,，,CAP,),：,即,CRP(cAMP,受体蛋白,),，转录的活化因子，直接作用于操纵子，激活基因转录。,CAP,需要,cAMP,存在时才有活性,。,图,11-8,乳糖操纵子的操纵基因和,CAP-cAMP,结合位点序列,图,11-9 CAP,的正调控作用,分解代谢阻遏作用,ATP cAMP,腺,苷,酸环,化酶,(,ACase),葡萄糖,分解代谢物,抑制作用,活化,CAP,lac,操纵子转录,葡萄糖降低细胞内,cAMP,水平,使,CAP,失活，,lac,操纵子不能表达,不能利用乳糖。,CAP,也是很多其他与分解代谢有关的操纵子的激活蛋白，包括乳糖操纵子、阿拉伯糖操纵子、半乳糖操纵子和麦芽糖操纵子等近,100,个启动子受到它的激活。这种由同一种调控蛋白调节多个操纵子基因表达活性的方式称为调谐子,(regulon),。这些操纵子附近都含有,CAP,结合位点。,11.3.1.2.8,色氨酸操纵子,色氨酸操纵子属于可阻遏型，作为辅阻遏物的是色氨酸。色氨酸是构成蛋白质的组分，如果环境中缺乏色氨酸，细菌必须自己合成。但是一旦环境能够提供色氨酸，细菌就会充分利用外界的色氨酸，减少或停止色氨酸的合成，以节省能量。,trp,操纵子是一个氨基酸合成体系，不是糖的分解，因此和葡萄糖没有什么关系，操纵子中也就不存在,cAMP-CAP,位点。,大肠杆菌的色氨酸操纵子由一个启动子、一个操纵基因、一个前导肽编码基因,(,trpL,),和,5,个结构基因,(,trpE,、,trpD,、,trpC,、,trpB,、,trpA,),以及一个调节基因,(,trpR,),组成。,结构基因编码将莽草酸转化为色氨酸的关键酶。,trpR,编码阻遏蛋白，与结构基因相距较远。,合成色氨酸所需要酶类的,结构基因群,，受其上游的启动子,P,trp,和操纵区,O,的调控,，调控基因,trpR,的位置,远离,P-O-,结构基因群,，在其自身的启动子作用下，以组成性方式低水平表达其,调控蛋白,R,，,R,并没有与操纵区,O,结合的,活性,，当环境能提供足够浓度的色氨酸时，,R,与色氨酸,结合后构象变化而活化,，就能够与操纵区,O,特异性亲和结合,，,阻遏结构基因的转录,。,图,11-18,色氨酸操纵子的阻遏调控,色氨酸合成途径的终产物色氨酸通过阻遏转录抑制该途径酶的合成，这种作用又称为,末端产物阻遏,。细胞在合成蛋白质的过程中，本着节约能量的原则平衡氨基酸合成酶的合成。通过,TrpR,的调节，可使色氨酸的合成降低,100,倍。,阻遏作用是色氨酸合成第一个层次的调控，主管转录的启动是否启动。此外，大肠杆菌还有色氨酸合成第二个层次的调控,弱化作用,(,也称为衰减作用,attenuation),，决定已经启动的转录是否继续下去。,弱化作用,trp,操纵子不因为,trpR,基因的缺失完全丧失调控功能。当,trpR,基因被敲除，,trp,操纵子,在无色氨酸时的,转录活性是有色氨酸存在时的,10,倍。,trp,操纵子在结构基因的,5-,端含有一个,ORF,，它并不编码合成色氨酸的酶，而是编码一种短肽,前导肽，里面有两个连续的色氨酸密码子，约占总密码子数目的,10%,。,色氨酸,-tRNA,对前导肽的翻译是必不可少的。,弱化作用的实质是以翻译的手段来控制基因的转录。,前导区的碱基序列包括,4,个分别以,1,、,2,、,3,和,4,表示的片段,能以两种不同的方式进行碱基配对,1-2,和,3-4,配对,或,2-3,配对,3-4,配对区正好位于终止密码子的识别区。,前导序列有相邻的两个色氨酸密码子,当培养基中色氨酸浓度很低时,负载有色氨酸的,tRNA,Trp,也就少,这样翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就会很慢,当,4,区被转录完成时,核糖体滞留,1,区,这时的前导区结构是,2-3,配对,不形成,3-4,配对的终止结构,所以转录可继续进行，起到将色氨酸操纵子中的结构基因全部转录完为止。,反之,色氨酸充足,核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子,在,4,区被转录之前,核糖体就到达,2,区,这样使,2-3,不能配对,3-4,区可以配对形成终止子结构,转录停止。,图,11-21,trp,操纵子的弱化子茎环结构,图,11-22,弱化子调控机制,R,P O leading seq.E D C B A,trp,+,为什么需要阻遏作用？,当大量,Trp,存在时，阻遏系统起作用。阻遏物与之结合，阻止先导,mRNA,合成。,经济,Negativerepressible operon,可以被最终合成产物所阻遏,R,P O leading seq.E D C B A,少量,trp,+,不足以结合,O,位点,为什么需要弱化作用？,当,trp,浓度低时，阻遏物从有活性变为无活性，速度极慢，不能很快引发色氨酸合成。因此需要一个能快速作出反应的系统，以保持培养基中适当的色氨酸水平。,编码合成其他氨基酸的基因也有类似的弱化作用。例如在组氨酸和苯丙氨酸操纵子的起始区分别含有多个,His,或,Phe,的前导肽编码序列，能对氨基酸的合成起更精确的调节作用。但对于某些氨基酸为说，弱化作用可能是其唯一的调控机制。如组氨酸操纵子没有阻遏蛋白，其前导序列中一共有,7,个连续的,His,密码子，这大大提高了弱化作用的效率。,11.4,翻译水平的调控,11.4.1 mRNA,高级结构对基因表达的影响,11.4.1.1 mRNA,二级结构对自身翻译的影响,大肠杆菌的,RNA,噬菌体,MS2,、,R17,和,f2,的基因组只含有,4,个基因：,cp,(,编码外壳蛋白,),、,A,、,Rep,(,编码复制酶,),、,Lys,。,RNA,噬菌体进入到宿主细胞后，核糖体仅结合到,cp,基因的,RBS,上，而,A,蛋白基因和,rep,基因的,RBS,因为形成了,RNA,的二级结构，不能与核糖体结合。,由于,A,和,rep,的,RBS,被封闭在二级结构中，当核糖体阅读到,cp,基因时，促使形成二级结构的氢键断裂。其下游的,rep,基因所形成的二级结构也随着翻译的进行而被打开，,rep,基因得以翻译。,虽然,rep,的,RBS,每次都被,cp,基因的翻译打开，但,RNA,噬菌体的外壳蛋白合成的量要比复制酶多得多。新产生的外壳蛋白的亚基可以特异性地结合在,rep,基因的,RBS,上，阻止核糖体的结合。这样外壳蛋白就成了复制酶基因的特异性翻译阻遏物。在感染,10,分钟后，外壳蛋白的合成量便足以阻断复制酶的进一步合成。,11.4.1.2 mRNA,二级结构对自身寿命的影响,在大肠杆菌中，降解,mRNA,的酶有核糖核酸酶,II,和,PNP,，但,mRNA,的二级结构可以阻遏这些酶的作用。,大肠杆菌,mRNA,中有一种高度保守的反向重复序列,(IR),，对,mRNA,的稳定性起着重要的作用。,IR,有利于形成茎环结构，防止,35,外切酶的降解作用，从而增加,mRNA,上游部分的半衰期，但对下游部分影响不大。,如大肠杆菌麦芽糖操纵子中，,malE,和,malF,基因之间存在,2,个,IR,，,malE,的产物要比,malF,产物的含量高,20,倍,40,倍。,malE,的,3-,端也有,2,个,IR,，可以形成茎环保护其不被外切酶降解，造成,malG,和,malF,的,mRNA,区域不如,malE,的区域稳定。,11.4.2,反义,RNA,对翻译的调控,大肠杆菌编码许多小分子调控,RNA,，能够与不同的,mRNA,结合，从而在翻译水平上发挥调控作用。由于这些小分子通过与靶,RNA,进行碱基配对结合的方式行使功能，因此被称为,反义,RNA,。,大肠杆菌有两种外膜蛋白,OmpC,和,OmpF,，分别由,ompC,和,ompF,两个基因编码。渗透压增高时，,OmpC,产量增加，,OmpF,产量减小；渗透压下降时，,OmpC,产量减小，,OmpF,产量增加。,细胞感应渗透压变化的体系属于双组分调节系统。,envZ,基因编码感应器激酶，负责感受环境中渗透压的变化。当渗透压增加时，,EnvZ,激活一种正调节蛋白,OmpR,，,OmpR,可以激活,ompC,和,micF,的转录，这两个基因连锁，但转录方向相反，调控区位于两个基因之间。,图,11-24,反义,RNA,对,OmpF,基因表达的调控,OmpF,mRNA,的翻译被阻止,11.4.3,翻译水平的自体调控,基因表达的自体调控指一个基因的表达产物反过来控制自身基因的表达，实际上也是一种反馈。,核糖体蛋白与,rRNA,同属核糖体的组成成分，协调两者的合成十分重要。通过自体调控可以很好地保证核糖体蛋白与,rRNA,之间的平衡。,绝大多数核糖体蛋白在每个核糖体中只有一个分子，因此它们的表达必须与,rRNA,的量相协调。延伸因子,EF-Tu,的分子数目大约是核糖体数目的,10,倍。,RNA,聚合酶的亚基数目要比核糖体数目少一些。由于这些基因混杂在不同的操纵子中，必然存在一种协调机制来控制它们的表达水平。,图,11-25,不同的核糖体蛋白形成的操纵子结构,图,11-26 S15,与其,RBS,结合引发的翻译受阻,对于每一个操纵子来说，一个或者两个核糖体蛋白能与操纵子第一个基因靠近,RBS,的位点结合，从而阻止核糖体的结合或者核糖体沿着,mRNA,的移动，导致翻译受阻。,核糖体蛋白,S8,的,mRNA,在,RBS,周围的二级结构与和它结合的,16S rRNA,的结构十分相似，为,S8,与自身,mRNA,的结合提供了结构基础。,S8,与其,mRNA,的亲和力不及与,rRNA,的亲和力，因此,S8,优先与,rRNA,结合，只有在,S8,过量的时候，,S8,才有机会与其自身,mRNA,结合，阻断自身的翻译。,图,11-27 S8-mRNA,的结构与,16S rRNA,结构的比较,核糖体蛋白自体调控模式可以实现两个目标。,首先，核糖体蛋白的水平受细胞生长条件影响，通过对,rRNA,水平的控制，细胞可以实现对核糖体所有成分合成的控制。,其次，由这些操纵子编码的其他蛋白质有自己的,SD,序列，因此不受核糖体蛋白的影响。,如,rif,操纵子中，,RNA,聚合酶 亚基不受,L10,的控制，而由其自身进行自体调控。这样，即使位于同一个操纵子中，其基因的表达量也要根据需要而变化。如,RNA,聚合酶的表达量即比核糖体成分的少。,11.4.4,严谨反应,细菌在饥饿条件下生长，特别是缺乏氨基酸时，将关闭大部分的代谢活动，主要表现是,rRNA,和,tRNA,合成大量减少，而蛋白质降解的速度增加，此现象称为,严谨反应,(stringent response),。,不仅缺乏任何一种氨基酸要导致严谨反应，任何氨酰,-tRNA,合成酶的失活也可引起严谨反应，表明诱发严谨反应的装置实际是空载,tRNA,。在正常条件下，氨酰,-tRNA,在,EF-Tu,作用下进入,A,位点。但当核糖体因缺乏一种氨酰,-tRNA,而停滞不前时，空载,tRNA,便进入,A,位点，触发空转反应,(idling reaction),。,通过空转反应，细胞能合成两种特殊的核苷酸,:ppGpp,和,pppGpp,，再由它们诱导严谨反应。这两种核苷酸最初因其电泳的迁移率和一般的核苷酸不同，被称为魔斑,I,和魔斑,II,。,空转反应受,RelA,催化，,RelA,又被称为严谨因子。,RelA,催化,ATP,将焦磷酸加到另一个,GTP,或,GDP,的,3-OH,上，产生,ppGpp,和,pppGpp,，引起空载,tRNA,从,A,位点释放。,ppGpp,通常是严谨反应的效应物。,在饥饿时，当氨酰,-tRNA,不能对,A,位点的密码子做出有效反应时，核糖体便停滞不前。空载,tRNA,进入,A,位点，触发,ppGpp,的合成，,ppGGpp,又使空载,tRNA,释放，重新空出,A,位点。核糖体是恢复多肽的合成，还是重复空转反应，关键取决于有无氨酰,-tRNA,。,图,11-28,严谨反应的分子机制,