分子生物学之DNA和RNA的提取方法及酶切和连接.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,二、,DNA,和,RNA,提取方法,细菌,DNA,的常规制备方法；,细菌,DNA PCR,模板的快速制备方法；,细菌基因组,DNA,提取试剂盒的选择；,酵母,DNA,的常规制备方法；,酵母,DNA PCR,模板的快速制备方法；,细菌基因组,DNA,提取试剂盒的选择；,二、,DNA,和,RNA,提取方法,植物、真菌,DNA,的小量制备方法；,植物（真菌）,DNA extract Kit,的选择；,动物组织或细胞中,RNA,的制备；,真菌（植物）,RNA,的制备；,植物和真菌,RNA,提取试剂盒的选择。,RNA,提取过程中的注意事项；,鉴定所提,RNA,质量的方法和技巧。,细菌,DNA,的常规制备方法,将培养后离心得到的菌体经过生理盐水洗涤,2,遍后，取,TENS,提取液（,50mMTris.Cl,pH8.0,20mM Na,2,EDTA,100mM NaCl,1%SDS,）,3mL,于离心管中充分悬浮菌体,.,经,100,C,水浴保温,2,分钟,后取出,待其自然冷却后,离心,15,分钟,(8000g,4,C,),收集其上清液。在其中加入,0.6,倍体积,的酚：氯仿：异戊醇（,25,：,24,：,1,），离心,15,分钟（,12000g,常温,）,保留上清液,.,然后再加入,0.6,倍体积的氯仿：异戊醇（,24,：,1,），再次离心,15,分钟（,12000g,常温）,取上清,.,最后加入,1/10,体积的,3M NaAC(pH5.2),和,2.5,倍体积的无水乙醇，混匀，置于,20,C 30,分钟，离心,15,分钟（,12000g,4,C,）,弃上清保留沉淀。并用,75,的乙醇洗涤沉淀，离心，控干后溶于,100,微升,TE,或无菌水中，加,RNase,至终浓度为,20,g/mL,37,C,处理,30,分钟,取少量电泳,其余放,-20,C,保存备用。,该方法所提细菌,DNA,适于作为,PCR,反应的模板,，如果该方法所提细菌,DNA,将用于建立基因组文库，则最好先将这些,DNA,用相应的细菌,DNA,提取试剂盒或,DNA,纯化试剂盒进行纯化后再用于建库,。,细菌基因组,DNA,提取试剂盒的选择,首选,QIAGEN,公司的，因为其核酸提取试剂全球领先，因而其种类最全。当然价格也比较昂贵。另外，,有非常多的国内公司都生产细菌基因组,DNA,提取试剂盒，如：北京天根生化科技有限公司、广州东盛生物科技有限公司、杭州博日科技有限公司，北京百泰克生物技术公司，广州誉维生物科技有限公司等。这些试剂盒的质量应该都可以满足要求。,这里推荐四款我用过的、效果不错的试剂盒供大家参考：,DW09-1,：细菌基因组,DNA,快速提取试剂盒,（广州东盛生物科技有限公司）；,E.Z.N.A.Bacterial DNA,Kit,(Omega,公司，广州飞扬生物工程有限公司生产,),；,细菌基因组,DNA,提取试剂盒,（北京天根生化科技有限公司）,快速,DNA,提取扩增套装,（北京天根生化科技有限公司）。,上述四款产品，前三款产品提取的,DNA,既可用于,PCR,，也可用于建库，而第四款产品提取的,DNA,只能用于,PCR,。,酵母,DNA,的小量制备方法（,1,）,实验原理：,首先酶解消化酵母细胞壁，制备原生质体。然后用,SDS,裂解产生的原生质体，释放出基因组,DNA,，从而可以制备其总,DNA,。,程序：,、用,YPD,培养基,培养酵母。将酵母培养物在,30,C,、中度振荡条件下培养过夜，至,OD,600,2.0,3.0,(,约为,3,10,7,个细胞,mL,),。,2,、取,5mL,培养细胞置于离心管中,.2000g(4100r/Min,Sorvall SS-34,转头,),离心,5,分钟,收集细胞,.,将剩下培养物置于,4 C,贮存,.,3,、用,0.5ml,山梨糖醇缓冲液（,1 M,山梨糖醇，,0.1 M EDTA,（,pH 7.5,）,重新悬浮细胞。将细胞悬液转移到一只微量离心管中。,4,、加入,20,l,破壁的酶溶液,(,Lywallzyme,广东微生物所，用山梨糖醇缓冲液配成,2.5 mg/mL,浓度,),。将细胞悬液在,37,C,下温育,1h.,5,、用微量离心机离心,1,分钟，收集细胞，吸弃上清液。,6,、用,0.5ml,酵母重悬缓冲液（,50 mM Tris-Cl,pH 7.4,20 mM EDTA,pH 7.5,）,重新悬浮细胞。,酵母,DNA,的小量制备（,2,）,7,、加入,50,l 10,的,SDS,。盖上管盖，将离心管快速地翻转数次，混匀,后将离心管在,65,C,下温育,30 min,。,8,、加入,0.2 ml 5 mol/L,的醋酸钾溶液，,冰浴,1h,。,9,、在微量离心机中以最大转速,4,C,离心,5min,使细胞碎片沉积下来。,10,、室温下用粗孔吸头吸取离心上清，转移到一个新的微量离心管中。,11,、加入,等体积室温下的异丙醇,，沉淀核酸。将管内容物混匀，室温下,放置,5min,。,(,重要：不要使沉淀过程超过,5min),12,、在微量离心机中以最大转速离心,10s,回收核酸沉淀。吸去离心上清,液，将沉淀在空气中干燥,10min,。,13,、用,300 l,含,20g/ml,胰,Rnase,的,TE(pH8.0),溶解沉淀,.,将消化混合物,在,37,C,温育,30 min,。,14,、加入,30,l 3mol/L,的醋酸钠,(pH7.0).,混匀后,加入,0.2ml,的异丙醇。,再次进行混匀。在微量离心机中以最大转速离心,20s,使,DNA,沉淀。,15,吸去上清液，沉淀在空气中干燥,10 min,用,150,l TE(pH 7.0),溶,解,DNA,。,本方法所得酵母,DNA,可用作,PCR,或被限制性酶切割用于构建基因组文库,。,酵母基因组,DNA,的两个简易制备方法,(1),方法,1,：接种酵母菌种于无菌的,50 mL YPD,或,SD,培养基,在,30,C,生长至对数生长晚期,(,至,OD,600,2.0,3.0),。滤液,4000 r/min,离心,10 min.,菌体用,液氮研磨,破壁,.,加,7 mL,DNA,缓冲液,(100mM Tris-HCl,pH8.0,10mM EDTA,1%SDS),。混匀,65,C,保温,1 h.10000 r/min,离心,15,分钟。上清用苯酚抽提,2,次，每次,5000 r/min,离心,7,分钟。再用氯仿抽提一次，,5000 r/min,离心,7,分钟。用,2.5,倍乙醇沉淀（加,0.3 M NaAC,，,pH 5.2,）,10000 r/min,离心,10 min.70%,乙醇洗,电吹风吹干。加适量,TE,或水悬浮,同时加适量,RNase(,20g/ml,胰,RNase,),。,酵母基因组,DNA,的两个简易制备方法,(2),方法,2,：接种酵母菌种于无菌的,50 mL YPD,或,SD,培养基,在,30,C,生长至对数生长晚期,(,至,OD600,2.0,3.0).,滤液,4000r/min,离心,10 min.,菌体用,液氮研磨,破壁,.,加,7mL DNA,缓冲液,4mM spermidine,（亚精胺）,40mM Tris-HCl,pH8.0,10mM EDTA,0.1M Nacl,0.5%SDS,10mM,-mercaptoethanol,（,-,巯基乙醇）,。,混匀,迅速用苯酚抽提，,5000 r/min,离心,7,分钟,重复一次抽提过程,.,再用氯仿抽提一次，,5000 r/min,离心,7,分钟。用,2.5,倍乙醇沉淀（加,0.3 M NaAC,，,pH 5.2,）,10000 r/min,离心,10 min.70%,乙醇洗,电吹风吹干,.,加适量,TE,或水悬浮,同时加适量,RNase(,20 g/ml,胰,RNase,),。,上述两个简易方法的比较和讨论,方法,1,和方法,2,制备的酵母,DNA,的得率分别为,0.2 mg/L,菌液和,0.3 mg/L,菌液。方法,2,的,DNA,缓冲液成份稍微复杂一点，但得率更高。两个方法都很,简便，不用制作原生质体，可酶切分析和作为,PCR,模板。,如果,不加液氮,研磨，则方法,1,和,2,的得率分别,减少至,15,20,和,5,10,。,酵母,DNA,小量提取试剂盒,推荐,E.Z.N.A.Yeast DNA Kit.(Omega,公司出品，飞扬公司生产,),一次可从,1-3 ml,酵母培养液中提取基因组,DNA,或质粒。,操作时间：,60,分钟左右。,得率：不高（几个微克），但较纯。,价格：,900,元,/50,次,很贵。,用途：纯化,DNA,产物可直接用于,PCR,、酶切和杂交等实验。,植物（真菌）,DNA,的小量制备方法,、首先，必须破碎（或消化）细胞壁释放出细胞内容物。,常用的破壁方法是用匀浆器直接将植物组织磨成细粉；或者将新鲜植物组织在液氮中快速冷冻后，用研钵将其磨成粉。,分离核,DNA,或细胞器,DNA,则应采取更为温和的破壁方法，以免过早破坏内膜系统，人们通常采用在含渗透剂的缓冲液中,C,匀浆的方法来破壁。,、必须破坏细胞膜使,DNA,释放到提取缓冲液中。这一步骤通常靠,SDS,或,CTAB,一类的去污剂来完成。,去污剂还可以保护,DNA,免受内源性核酸酶的降解。通常提取缓冲液中,还包含,EDTA,，它可以螯合大多数核酸酶所需的辅助因子镁离子。,、一旦,DNA,释放出来，其,剪切破坏的程度必须要降到最低。,剧烈振荡或小孔快速抽吸都会打断溶液中高分子量的,DNA,。一般说来，如果操作得当，可以得到相对分子质量长度为,kb,的,DNA,。,、在,DNA,粗提取中往往含有大量,RNA,、蛋白质、多糖、单宁、色素等杂质，大多数,蛋白可通过氯仿或苯酚处理后变性、沉淀除去,，绝大多数,RNA,可以通过,RNaseA,除去。但,多糖一般很难除去。,常使,DNA,提取物呈胶状而干扰后续操作。,用玻璃钩钩出溶液中沉淀的絮状,DNA,而不是用离心获得,DNA,，可以有效减少,DNA,中多糖的含量。,操作程序（,1,）,、将,g,经,去淀粉处理,的新鲜植物组织置于液氮中速冻，用研钵磨成细粉。,、将冷冻粉转移到一个,ml,离心管中并加入,ml,提取缓冲液,500 mMNaCl,100 mM Tris-Cl pH 8.0,50 mM EDTA,pH 8.0,10 mM,-mercaptoethanal(,用前加入,),中，轻轻旋转混匀。,、加入,ml,SDS,，混匀，,C,保温分钟，并不时轻轻旋转混匀,（要点）,、加入,5mL,mol/L KAC,混匀后冰上放置分钟,（要点）,、,12,g,4 C,离心分钟。,、上清用双层纱布过滤，转移至一干净的,mL,离心管中，加入,mL,异丙醇，轻轻颠倒混匀，,-20 C,放置,min,沉淀核酸。,7,、,2000 g,4 C,离心,20 min,去上清,晾干沉淀,5 min.,8,、用,700 lTE,缓冲液溶解沉淀并转移到一个,eppendorf,管中。,（要点,3,）,操作要点,去淀粉处理：收获之前将植株于暗处放置,24,小时即可达到去除淀粉的目的。,1,、将,SDS,溶液加入到化冻的提取物中时，可能会有沉淀析出，要保证析出的,SDS,重新溶解，以及,65 C,保温时提取物混合均匀。,2,、在高浓度（,1 mol/L,）的钾离子存在的情况下，,SDS,会与蛋白或多糖结合变成不溶性的十二烷基磺酸钾复合物，这类复合物通常呈絮状，必须要经较高转速离心和纱布过滤予以除去。,3,、若沉淀难于重新溶解，可在,65 C,加热,10 min.,操作程序（,2,）,9,、加入,7 l RNase A,储存液,37 C,保温,1 h.,10,、加入,75 l 3mol/L KAC,轻弹混匀,离心,15 min,沉淀不溶性杂质。,11,、将上清转移至一装有,500 l,异丙醇的干净管中，轻轻混匀，室温下放置,5min.,12,、微量离心机离心,15 min,沉淀,DNA,，去上清并用,500 l 70,乙醇清洗沉淀，再次离心,5 min,小心弃去乙醇。,13,、沉淀物溶解于,200 l TE,缓冲液中，,4 C,保存。,植物（真菌）,DNA extract Kit,的选择,优点,:,步骤较简单,重复性高,DNA,纯度很高,不含多糖等很难除去的杂质。,缺点,:,价格高,得率很低,用来做,PCR,模板可以,但用来做文库则量不够。,推荐品牌,:,严格说来目前没有一个品牌的植物（真菌）,DNA extract Kit,是令人满意的，相比而言，,Qiagen,公司和,Omega,公司的产品稍好些。,Qiagen,公司的试剂盒,（,DNeasy plant Mini Kit,）质量好,适用于植物和真菌,，但得率低,价格贵。,Omega,公司的产品,价格适中,对植物,DNA,提取效果较好（,E.Z.N.A.SP Plant DNA Kit,）,但,提真菌,DNA,效果不好,(E.Z.N.A.SP Fungal DNA Kit),。,推荐方法：,可用前面的手工提取方法提取大量的,DNA,，然后用试剂盒纯化,DNA,。,动物组织或细胞中,RNA,的制备,推荐方法：,一步法。,原理：用含,异硫氰酸胍,和,酚,的一种,单相液,来裂解细胞。加入氯仿产生了第二相（有机相），,DNA,和蛋白质在有机相中被抽提，,RNA,则被留在上层水相中。用乙醇和异丙醇连续沉淀可分别分离有机相中的,DNA,和蛋白质。,回收的有机相中的,DNA,大小约为,20KB,，适于作,PCR,的模板。存在于含胍的溶液中保持变性的蛋白质主要用于免疫印迹分析。异丙醇沉淀的上层水相中的,RNA,可用,Oligo,（,dT),纤维素柱亲和层析法进一步纯化或被用于,Northern,印迹杂交分析、反转录或反转录,PCR,反应（,RT,PCR,）。,RNA,的产量取决于组织或细胞的来源，但是，,通常每毫克组织可获得,4,7,g RNA,每,10,6,细胞可获得,5,10,g RNA,。,提取的,RNA A260,A280,比值一般为,1.8,2.0,。,定量测定,DNA,或,RNA,时需要读取,260nm,和,280nm,两个波长下的读数。根据在,260nm,处的读数可计算出样品中的核酸浓度，,1,个,OD,值相当于,50,g,mL,双链,DNA,、,40,g,mL,单链,DNA,和,RNA,及,33,g,mL,单链寡核苷酸。,利用,260nm,和,280nm,两处读数的比值可估计核酸的纯度。,DNA,和,RNA,纯制品的,OD260,：,OD280,值分别为,1.8,和,2.0,若样品中蛋白或酚的污染较严重则,OD260,：,OD280,低于上述两个数值，就不可能通过分光光度法进行精确定量。,操作步骤（,1,）,1,、准备分离,RNA,的,细胞或组织样品,。,有些组织富含降解酶（胰腺或肠子），最好先将这些组织,切成小块，迅速放入液氮中，,反复冰冻后，储存于,70,度,或直接提取,RNA,。组织可在,70,度存放几个月而不影响,RNA,的产量和完整性。,A.,解剖所要的组织，将其直接放入液氮中速冻。,B.,将,100mg,冰冻组织放入盛有液氮的研钵中，用研杵碾碎组织。在研磨过程中要,不断添加液氮以保持组织冷冻。,C.,将粉末状的组织移入一个盛有,1mL,冰冷单相液,（,Trizol,成分目前还没有公开）,的聚乙烯离心管中。,D.,于室温用,polytron,匀浆器高速匀浆组织,15,30S,。,悬浮生长的哺乳动物细胞：,A.,用台式离心机于室温以,200-900g,离心,5,10min,收集细胞。,B.,吸出培养液，用,1,2mL,无菌冰冷的,PBS,重悬细胞沉淀。,C.,离心收集细胞，吸尽,PBS,，每,106,细胞加,1mL,单相裂解液。,D.,于室温，用匀浆器高速匀浆细胞,15,30S,。,操作步骤（,2,）,单层生长的哺乳动物细胞：,A.,吸出培养液，用,5,10mL,无菌冰冷的,PBS,洗涤细胞 一次。,B.,吸出,PBS,，每个直径,90mm,培养皿中的培养细胞用,1mL,单相裂解剂裂解细胞（每个直径,60mm,培养皿中加,0.7mL,单相裂解液）,C.,转细胞裂解液于螺帽聚乙烯管（离心管）中。,D.,于室温用匀浆器高速匀浆细胞裂解物,15,30S,。,2.,于室温将细胞匀浆物温育,5 min,使核蛋白复合物完全解离。,3.,加入,0.2mL,氯仿于每毫升单相裂解液中，通过剧烈摇动或用涡旋振荡器混匀样品；,4.,于,4,C,以,12000r/min,离心,15 min,使混合物分为两相，将,上层水相移,至一个新的离心管中。,DNA,（中间相）和蛋白质（下层相）,被抽提进有机相，,RNA,留在水相。用乙醇和异丙醇连续沉淀回收,DNA,和蛋白质。,5.,从水相中沉淀,RNA,：每,1mL,单相裂解液，加入,0.25,倍体积的异丙醇和,0.25,倍体积的,RNA,沉淀液（,1.2 M NaCl,0.8 M,柠檬酸二钠盐,.15H,2,O,，乙酸钠，,3 M,，,pH 5.2,）。,充分混匀后，于室温放置,10 Min,。,操作步骤（,3,）,6.,于,4,C,以最大转速离心,10min,收集,RNA,沉淀。用,75,乙醇沉淀两次，重复上述离心。用一次性使用的吸头吸尽残存的乙醇。将打开管盖的离心管在实验台放置几分钟，将最后残存的痕量乙醇挥发殆尽。不要让,RNA,沉淀干透。,7.,加,50-100,L,DEPC,（焦碳酸二乙酯）处理过的水（最好再加一些商品化的,Rnase,抑制剂，如,RNAsin,Promega,公司）。,将,RNA,溶液储存于,70,C,。加,SDS,至终浓度,0.5,，然后加热至,65,C,有助于,RNA,沉淀的溶解,.,但纯的,RNA,在用,0.5%SDS,液重悬后不能抵抗,Rnase,的降解，因此一些研究者更喜欢用,50,100,L,稳定的甲酰胺溶液溶解,RNA,沉淀，并储存于,20,C,。用,4,倍体积的乙醇沉淀可回收溶于甲酰胺溶液中的,RNA,。另外如,RNA,用,SDS,溶解，在酶学处理（如,RT,PCR,等）前应用氯仿抽提和乙醇沉淀除去,SDS,。如,RNA,中不慎污染了,DNA,，可用无,RNase,的,DNase,处理样品或用,oligo(dT),柱层析制备,mRNA,的方法除去,DNA,片段,8.,电泳,（乙醛酸处理的,RNA,琼脂糖电泳或,RNA,甲醛琼脂糖电泳）,分析,RNA,完整程度,分光光度计法计算,RNA,浓度。,TRIZOL,法提取真菌（植物）,RNA,操作程序（,Invitrogen,公司,protocol,）,一、,所需试剂：,氯仿，异丙醇，,75%,乙醇（用,DEPC,水配制），,DEPC,水。,二、,操作程序：,1,、,500mg,离心收集的湿菌丝体，加,1ml TRIZOL,匀浆器中匀浆,5,分钟（液氮研磨成粉后再加入,TRIZOL,可获得更佳的效果）,，至菌丝体完全捣碎。,2,、,4,、,12000g,离心,10,分钟，转移上清。,3,、上清室温放置,5,分钟，加,0.2ml,氯仿，用手剧震,15,秒，室温放置,2-3,分钟。,4,、,4,、,11000g,离心,15,分钟，转移水相。,5,、水相中加入,0.25ml,异丙醇及,0.25ml,高盐沉淀液（,0.8M,柠檬酸钠，,1.2MNaCl,）混匀，室温放置,10,分钟。,6,、,4,、,11000g,离心,10,分钟去上清。,7,、加,1ml 75%,乙醇，,vortex,混匀，,4,、,7000g,离心,5,分钟，去上清。,8,、沉淀在空气中干燥,5-10,分钟，,用,100,l DEPC,水溶解,，枪头吸打几次，,放于,55,水浴中,10,分钟促溶。,9,、电泳及测,OD,值，检定,RNA,的量及完整性。,10,、,RNA,放,-70,保存。,植物和真菌,RNA,提取试剂盒的选择,对于植物和真菌,，没有好的提,RNA,的试剂盒（多糖含量高，不好纯化，得率很低），即使,Qiagen,的也不好用，所以,只能用,Trizol,法提取。,Trizol,推荐使用,Invitrogen,公司的,Trizol reagents,为最佳,Omega,公司的也可以。其他公司也有,Trizol,，但效果良莠不齐。,至于提血液、动物组织，很多公司的试剂盒都不错,，如,Omega,，,Qiagen,的试剂盒。,如何确保,RNA,提取实验成功,1,、带,手套、口罩,操作。,2,、研磨时,液氮添加的量,（样品为植物和真菌材料、动物器官等时需要用到）,要足够,，研磨时要不停地添加；,3,、操作时周围,人不要太多,，而且,尽量不要走动,；,4,、,样品最好新鲜采集,，并且保存在冰箱或液氮中；,5,、,Trizol,等试剂,没有过期变质。,6,、提取,缓冲液没被污染,（空气或微生物）。,7,、保证有,RNA,实验,专用的移液器、生化试剂、工作台面、玻璃 器皿（,300,度烘,4,小时），,DEPC,处理过的水；,8,、,进口的移液器吸头和离心管。,一种简单、快速进行,RNA,电泳的方法,目前,RNA,的质量采用变性琼脂糖凝胶电泳方法来鉴定,这些方法步骤繁琐、费时、费力。我室在长期进行,RNA,的研究中,摸索出了一种简单、快速和可靠的鉴定,RNA,质量的电泳方法,现报道如下：,电泳方法、步骤大体同普通的,TBE,琼脂糖凝胶电泳。为最大限度降低,RNA,在电泳时被降解,结合甲醛变性琼脂凝胶电泳分离,RNA,方法,在常规琼脂糖凝胶电泳的基础上进行如下改进。,电泳,RNA,所用器械,如制胶的模具、梳子、电泳槽等用洗涤剂洗干净后,用,DEPC,处理过的水,（也可用无菌双蒸水替代）,冲洗,二遍后在室温晾干备用。,用新的,TBE buffer,配制,1,.,2%,琼脂糖凝胶,倒胶时溴化乙锭,(EB),直接加入凝胶中。,制备好的琼脂糖凝胶板放入电泳槽后再加入经高压灭菌过的,1XTBE,液面只能刚好同胶面平齐,缓冲液不要淹过胶面。点样时,样品,RNA,每,10l,加入,2l,上样缓冲液,上样缓冲液是用,DEPC,处理的水配制的,50%,甘油,另外单独点一样品孔含有,3l,溴酚蓝的上样缓冲液作为电泳指示剂,。,电泳电压可适当加大，用,10 V/cm,胶板,以减少电泳时间。,电泳结束后立即取出凝胶在紫外灯下观看所提取的,RNA,的质量或进行拍照记录。,实验关键：普通,TBE,电泳跑,RNA,，有两个关键：,第一，从清洁电泳槽和胶板，制备电泳胶及点样、电泳的过程中都要尽可能避免,RNA,酶的污染。,第二，实验过程要动作迅速，电泳仪的电压加大，减少电泳的时间。,理想的,RNA,提取结果（电泳图片）,理想的,RNA,提取结果应该是由两条比较亮的带组成，对应于真核生物的,28S rRNA,和,18S rRNA,。特别是,28S rRNA,的带越完整、清晰和明亮，通常说明,RNA,提取结果越好。,最下面一条比较模糊的带通常是由,tRNA,、,5.8s rRNA,和,5S rRNA,组成的。,rRNA,占总,RNA,的,90%,以上,它们主要由,28S,、,18S,、,5.8 S,、,5S,组成,28S(,约,4.5 kb),、,18S(,约,2.1 kb),、,5.8S(5S),（约几百,bp,）,这三类,rRNA,的摩尔浓度大致相等,但他们的分子量相差较大,在紫外灯下的亮度依次为,28S18S5.8S(5S),。,不理想的,RNA,提取结果（电泳图片）,三、酶切与连接,1,、限制性内切酶的概述及使用注意事项；,2,、标准的限制酶酶切体系；,3,、星活性（,Star activity,）；,4,、双酶切反应；,5,、,PCR,片段末端的限制酶酶切；,6,、酶切片段的回收；,7,、限制酶末端的相互连接；,8,、同尾酶举例；,9,、,限制性内切酶和连接酶品牌推荐；,10,、底物,DNA,没有被限制酶切断的常见原因；,11,、实验室代替低温循环水浴的几个小窍门。,限制性内切酶的概述及使用注意事项,分子生物学实验中常用的酶,:,限制性内切酶,:,Eco,RI,，,Hin,dIII,等。,修饰酶,:ligases,Alkaline phosphatases,DNA polymerases,RNA polymerases,Nucleases,等。,酶类都有,保存期限,保质期一般是,检定日后的一年内,，但几乎所有的限制酶在超过保质期后都不会急剧失活，还可以用一段时间。,一般买酶时分析日期以半年内为好。酶切时酶应放在冰上操作或从冰箱拿出吸完立刻放回。拿酶时手指应放在管子的上部，防止手指的温度使酶失活。另外，限制性内切酶从冰箱中取出后，应置于冰上。一般总是在其它试剂加完后，再加入内切酶。,标准的限制酶酶切体系,一般是,1,g,底物,DNA,，在,50,l,终反应体系,中，用,1,个单位（,1 Unit,）的内切酶催化，在推荐的反应缓冲液和温度下反应,1,个小时。,酶解,1,g,以下或以上的,DNA,，可按上述,标准体系进行缩小或放大,。加入过量的内切酶，可以缩短反应时间并达到酶切完全的效果，但是不能过分加大酶的用量，以免产生,星活性,。所以我们,推荐稍过量的酶（,2-5,倍）较长的反应时间。,对于绝大多数酶切反应，,通常,4-6,小时都足以完全酶切,反应底物。如果底物不纯或难以酶切，通常,过夜酶切（,8-12,小时）,可实现底物的完全酶切。但不推荐,太长的酶切时间（,18,小时以上），,太长的酶切时间（或许还有酶量过多的原因）,有时会把反应底物切成碎片,。,由于某些未知的原因，,有时按预实验结果放大酶切体积的时候，会导致酶切效果不理想。,如果重复一次实验仍然不能解决问题，这种情况下最好的办法是,做多管小体积的酶切实验,，最后把酶切产物汇集到一起进行电泳、回收酶切片段。,星活性（,Star activity,）,限制酶根据反应条件的不同，可能会切断与原来认识序列不同的位点，这种不同于原来的特异性的活性，称为,星活性。,一般产生星活性的主要原因是反应体系中,酶量太多（一般不要超过,15,20,），或样品中甘油含量多（一般不要超过,10,），或酶切温度变化（如从,37,C,变为,30 C,）。,双酶切反应,使用两种酶同时进行,DNA,切断反应，是实验操作中非常常用的手段。,此时，使用,Buffer,非常重要。,为了节省时间，,通常希望在同一反应体系中进行。,Takara,采用,Universal Buffer,表示系统，并对每种酶表明了在各,Universal buffer,中的相对活性（详见,Takara,商品目录,A,4,表,）。根据该表，,可选出双酶切时的缓冲液,（具体见,Takara,商品目录,A,6,表,，,选择原则是该缓冲液应该使两种酶的活性都比较高，且尽可能避免出现酶的星活性,）。尽管如此，在进行,Double Digestion,时，有时还会,难以找到合适的,Universal Buffer,。,此时应自己调整缓冲液的成份,（,Takara,商品目录,A,5,表,，如先在,低盐,Buffer,下用一种酶切，然后补加盐后，将一种酶加热失活，再在,高盐,Buffer,下用另一种酶酶切。,根据,DNA,的种类,，各,DNA,的,立体结构的差别,，或,当限制酶切位点邻接时,，,有时,会发生,Double Digestion,不能顺利进行,的可能。此时可,调节酶切反应体系,或,换不同的载体,进行酶切反应。,PCR,片段末端的限制酶酶切,克隆,PCR,产物的方法之一，是在,PCR,产物两端设计一定的限制酶切位点，经酶切后克隆至用相同酶切的载体中。但实验证明，,大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。必须在酶切位点旁边加上,2,3,个保护碱基，以,3,个为最好，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。,保护碱基不是随便设计的，,不同的酶需要设计不同的保护碱基,，以达到最佳酶切效果。如有需要，我这里有份,NEB,公司限制酶的保护碱基资料（,pdf,版），可供大家参考。,如果加上保护碱基仍然不能切开,PCR,产物，,可将,PCR,产物克隆,（利用,PCR,产物末端通常加,A,的特性连接到,T,载体上）,到,T,载体上再切。,酶切片段的回收,将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳,，然后将,所需大小的酶切片段从胶上切下来,，利用,DNA,胶回收试剂盒,进行回收。具体技术细节和产品推荐将在电泳章节中详述。,限制酶末端的相互连接,尽管限制酶不同，但只要酶切后产生的切口序列相互吻合，就可相互连接。在,Takara,产品目录,A41,A47,中,罗列了这些限制酶的相互关系，对选择用于切断连接的限制酶很有用处。,同尾酶举例,Bam,HI,识别位点：,GGATCC,，,Bgl,II,识别位点：,AGATCT,，,Bam,HI,切后产生：,GATC,末端,Bgl,II,切后产生：,GATC,末端,所以二者的酶切产物可以互相连接起来，产生新的识别位点,GGATCT,，该序列能被,MfI,I,和,Sau,3AI,识别。,限制性内切酶和连接酶品牌推荐,内切酶推荐品牌,:Takara,（宝生物），,ToYoBo,（东洋纺）。这两个公司生产的限制性内切酶价廉物美，非常可靠，适用于绝大多数酶切实验。如果重复多次酶切都不成功，且,DNA,质量和酶本身都没有问题，那么推荐可采用质量最好的限制性内切酶,NEB,（,New England Biolabs,）公司的酶试一试，通常都能立刻解决问题。,连接酶推荐品牌,:,绝大多数连接实验都可采用,Takara,公司的,ligase,或,ToYoBo,公司的,Ligation high,完成。如果酶切位点特别难连接或进行平端连接，推荐采用质量更可靠、连接效率更高的下列品牌的连接酶：,NEB,（,New England Biolabs,），,Clonetech,德国宝灵曼的,ligase(,已被,Roche,收购,),。,最近，加拿大的,Fermentas,（富酶泰斯）产品也开始进入中国市场，该公司是世界第二大的工具酶生产商，其限制性内切酶（尤其是快速内切酶，号称可以在,5,分钟内完成酶切）和连接酶质量也很好，而价格介于,NEB,和,TakaRa,之间，大家也可以使用。,底物,DNA,没有被限制酶切断的常见原因,1,、底物,DNA,上没有该限制酶位点，,特别是一些经过重组等处理的,DNA,（非工程菌株），碱基易发生缺失、变化等。,2,、限制酶识别位点上的,A,或,C,被甲基化。,部分限制酶对识别位点中的碱基是否被甲基化比较敏感，从而无法切断该位点。,3,、底物不纯。,如果底物,DNA,中含有限制酶阻害物质，会影响限制酶的酶起作用。在此情况下,DNA,必须进行纯化。,4,、限制酶的识别、切断位点在,底物,DNA,的高级结构,中所处的位置，对酶切反应也有一定的,影响,。,5,、,酶的质量问题。,如过期、运输或保存过程中放置不当导致的酶活的丧失。,6,、一个常常容易被忽视的原因是由于酶切所采用的,水质量不好（应采用无菌超纯水或无菌三蒸水）,，使得底物,DNA,没有被限制酶切断。,实验室代替低温循环水浴的几个小窍门,酶切片段连接时通常采用的,连接温度是,16,度,，,最好用低温循环水浴进行过夜连接,。,如果没有，可使用以下替代方法，也可获得很好的效果：,1,、如果是,白天连接,，可将,保温壶,中水温度调至,16,度，然后放入连接产物进行连接。每隔一段时间，往保温壶中加一点冰，保持壶中温度不升高；,如果是晚上连接,，离开前将保温壶水温,调至,12,度,左右，然后盖紧壶盖离开。夜间温度一般比较低，第二天往往水温还能保持在,20,度左右，基本可满足连接条件；,2,、,冰箱冷藏室门的最上面往往保持在,15,16,度（不同品牌冰箱可能略有不同，需预先测量一下），是连接的好地方。,在测量过温度后，可将连接产物放在上面过夜，效果也很好。,thank you!,