分子生物学第三章--蛋白质大分子结构与功能.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本章内容,第一节 蛋白质大分子结构与功能,第二节 蛋白质生物合成,1,第一节 蛋白质大分子结构与功能,2,一、蛋白质的生物学意义（功能）,蛋白质的生物学意义（功能）,结构功能-例如：膜蛋白、糖蛋白、核蛋白,催化功能-例如：酶,运输功能-例如：载体，某些跨膜蛋白,运动功能-例如：肌球蛋白和肌动蛋白,防御功能-例如：抗体,调控功能-例如：阻遏蛋白,再激活因子,恩格斯认为：,蛋白质是生命的表现形式,3,膜蛋白,4,HA,链球菌透明质酸的代谢网络,透明质酸生物合成过程,5,糖蛋白,生物膜是磷脂双分子层嵌有蛋白质的二维流体,6,The Proton Pump,8,问 题,先有蛋白质，还是先有核酸？,先有,DNA,还是先有,RNA?,9,二、蛋白质的元素组成,四大生命元素：,C、H、O、N,有的蛋白质还有：磷,、,铁,、,锌,、,铜,、,钼等,氮在各种蛋白质中平均含量为16%。,例题:通过凯氏定氮法测得某细菌培养物的,N,含量为1.25,g,问该细菌中蛋白质含量为多少?,10,三、蛋白质的氨基酸组成,组成蛋白质的基本单位是,氨基酸,。如将天然蛋白质完全水解，最后都可得到约二十种不同的氨基酸。除,脯氨酸,外，其余均属于,-,氨基酸,11,12,(一)氨基酸结构通式,羧基写在,-,碳原子上端，氨基在左边为,L-,型，氨基在右边为,D-,型,13,(二)氨基酸的分类,根据组成蛋白质的20种氨基酸的侧链,R,基的化学结构，分为：,脂肪族氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸,芳香族氨基酸：苯丙氨酸,杂环氨基酸：组氨酸、色氨酸,杂环亚氨基酸：脯氨酸,14,根据,R,侧链基团解离性质的不同，可将氨基酸进行分类：,1.,极性氨基酸：,(1),酸性氨基酸,Glu，Asp；,侧链基团在中性溶液中解离后带负电荷的氨基酸。,(2),碱性氨基酸,His，Arg，Lys；,侧链基团在中性溶液中解离后带正电荷的氨基酸。,(3),中性氨基酸 侧链基团在中性溶液中不发生解离，因而不带电荷的氨基酸,：Ser,Thr,Asn,Gln,Tyr,Cys 2.,非极性氨基酸：,Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Phe。,15,（三）氨基酸的理化性质,1两性解离及等电点,氨基酸分子是一种两性电解质。通过改变溶液的,pH,可使氨基酸分子的解离状态发生改变。,氨基酸分子带有相等正、负电荷时，溶液的,pH,值称为该氨基酸的等电点（,pI）,。,16,17,2,紫外吸收性质,组成天然蛋白质分子的20种氨基酸中，只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸对紫外光有光吸收。其吸收峰,280,nm,左右，以,色氨酸,吸收最强。可利用此性质采用紫外分分光度法测定蛋白质的含量。,18,3.氨基酸的化学性质,与茚三酮反应生成兰紫色物质，但脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮生成黄色物质,。,与,DNFB,反应生成稳定的黄色2，4-二硝基苯氨酸（,DNP-,氨基酸）,。DNP-,氨基酸在有机溶剂中与其它氨基酸溶解度不同，用乙醚抽提，根据纸层析上的黄色斑点可鉴定,N-,端氨基酸的种类和数目（,Sanger,等用此法测定了胰岛素的一级结构）,19,氨基酸与异硫氰酸苯酯的反应,AA,的氨基可与异硫氰酸苯酯(,PITC),反应,生成苯氨基硫甲酰氨基酸(,PTC-AA)。,所得,PTC-AA,经乙酸乙酯抽提层析鉴定 确定,N,端氨基酸的种类。“多肽顺序自动分析仪”据此原理。,生物公司已经进行蛋白质测序,20,英国生化学家弗雷德,桑格尔（,Frederick Sanger,，,1918,年,8,月,13,日,）,分别获得,1958,年和,1980,年诺贝尔化学奖。他是同一领域内两次获奖，两次获奖理由都可归结为：测序。,1958,：弗雷德,桑格尔发明酶法测定人胰岛素序列，从而确定胰岛素的分子结构，开创了蛋白质测序领域。,1980,：弗雷德,桑格尔、沃尔特,吉尔伯特共同荣获诺贝尔化学奖。他们贡献在于：分别使用不同的方法测定,DNA,序列。,Sanger,法后来成为主流，并用于人类基因组计划（,HGP,）的测序。,21,蛋白质结构,22,四、肽,肽：一个,AA,的,-,羧基和另一个,AA,的,-,氨基脱水缩合而成的化合物。,肽建：氨基酸之间脱水后形成的键，又称酰胺键,23,肽链中的氨基酸因脱水形成肽键而称为氨基酸残基,肽的命名：例如 谷胱甘肽,肽与蛋白质的界定,信号肽,24,25,肽平面,26,肽的实例,谷胱甘肽-作为辅酶，在体内氧化还原过程中起作用,催产素和加压素,促肾上腺皮质激素,脑肽,27,28,四、蛋白质的结构,蛋白质结构分为：一级结构、二级结构、超二级结构、结构域、三级结构、四级结构,（一）蛋白质的一级结构：蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序。一级结构在很大程度上决定其高级结构。,29,二硫键,30,一级结构确定的原则,测定蛋白质中氨基酸组成,蛋白质,N,端和,C,端的测定,2种以上方法水解蛋白质，得到一系列肽段,分离提纯所得肽，测其序列,从有重叠结构的肽序列中推断蛋白质的全部氨基酸的排列顺序,31,（二）蛋白质的空间结构,肽平面：肽腱中的4个原子以及相邻的2个,-,碳原子处在同一平面，使肽链具有一定的稳定性,32,1.蛋白质二级结构：,-,螺旋、,-,折叠、,-,转角、自由回转等,-,螺旋结构特点:,每隔3.6个氨基酸残基上升1圈。向上平移0.54,nm,即每个氨基酸残基沿轴上升0.15,nm。,-,螺旋体中氨基酸残基侧链伸向外侧，相邻螺旋之间形成氢键，氢键方向与中心轴平行。,分左手螺旋和右手螺旋。,33,34,35,-,螺旋,-,折叠,肽链按层排列，依靠相邻肽链,CO,和,NH,形成的氢键维持结构稳定。,平行排列：所有肽链的,N,端处于同一侧，是同方向的。,反向平行：肽链的,N,端一顺一倒排列。,反向平行结构更稳定。,36,红球代表,O,原子;白球代表,N,原子紫色球代表,R,侧链；,37,红球代表,O,原子;白球代表,N,原子；紫色球代表,R,侧链,38,39,-,转角,多肽链中180度回折，第一个,AA,残基的,CO,和,第四个,AA,残基的,NH,形成的氢键,40,自由回转,无规则卷曲,没有一定规律的松散结构,酶的功能部位常常处于这种构象区域里。,41,2.超二级结构和结构域,超二级结构,：若干相邻的二级结构中的构象单元,形成二级结构组合体。例如，,，,等。,42,43,44,45,结构域,多肽链在超二级结构基础上进一步卷曲折叠成紧密的近似球状的结构。对较小蛋白质分子，结构域往往就是三级结构，即这些蛋白质是单结构域。,许多蛋白质是多结构域。,46,结构域,47,3.蛋白质三级结构,多肽链的某些区域氨基酸形成二级结构:,-,螺旋、,-,折叠、,-,转角、无规则卷曲等构象单元,然后相邻二级结构集装成超二级结构,进而折叠绕曲成结构域,由2个或2个以上的结构域组装成三级结构。,如肌红蛋白。,48,4.蛋白质四级结构,一个蛋白质由几条多肽链组成1个活性单位。亚基的相互关系，空间排布，亚基间通过非共价键聚合成的特定构象。单一亚基无活性，只有聚合后才有生物活性。如血红蛋白。,49,50,蛋白质预测网站,Compute pI/WM,expasy.hcuge.ch,Predictprotein,www.embl-heidelberg.de/predictprotein/,SOPMA,www.ibcp.fr/predict.html,Unpredict,www.cmpharm.ucsf.edu/,51,蛋白质信息资源（,PIR)www.gdb.org/Dan/proteins/pir.html,蛋白质结构数据库（,PDB),www.rcsb.bnl.gov/,北大生物信息学中心,52,MKRSKRFAVLAQRPVNQDGLIGEWPEEGLIAMDSPFDPVSSVKVDNGLIVELDGKRRDQFDMIDRFIADYAINVERTEQAMRLEAVEIARMLVDIHVSREEIIAITTAITPAKAVEVMAQMNVVEMMMALQKMRARRTPSNQCHVTNLKDNPVQIAADAAEAGIRGFSEQETTVGIARYAPFNALALLVGSQCGRPGVLTQCSVEEATELELGMRGLTSYAETVSVYGTEAVFTDGDDTPWSKAFLASAYASRGLKMRYTSGTGSEALMGYSESKSMLYLESRCIFITKGAGVQGLQNGAVSCIGMTGAVPSGIRAVLAENLIASMLDLEVASANDQTFSHSDIRRTARTLMQMLPGTDFIFSGYSAVPNYDNMFAGSNFDAEDFDDYNILQRDLMVDGGLRPVTEAETIAIRQKAARAIQAVFRELGLPPIADEEVEAATYAHGSNEMPPRNVVEDLSAVEEMMKRNITGLDIVGALSRSGFEDIASNILNMLRQRVTGDYLQTSAILDRQFEVVSAVNDINDYQGPGTGYRISAERWAEIKNIPGVVQPDTIE,MPHGAILKELIAGVEEEGLHARVVRILRTSDVSFMAWDAANLSGSGIGIGIQSKGTTVIHQRDLLPLSNLELFSQAPLLTLETYRQIGKNAARYARKESPSPVPVVNDQMVRPKFMAKAALFHIKETKHVVQDAEPVTLHIDLVRE,MSEKTMRVQDYPLATRCPEHILTPTGKPLTDITLEKVLSGEVGPQDVRISRQTLEYQAQIAEQMQRHAVARNFRRAAELIAIPDERILAIYNALRPFRSSQAELLAIADELEHTWHATVNAAFVRESAEVYQQRHKLRKGS,等电点/分子量理论值:5.26/92840.80,举例-甘油脱水酶的,3,个亚基序列,53,Deduced secondary structure of fusion protein,dhaB123,Alpha helix,(,Hh,):399 is 47.39%3,10,helix,(,Gg,):0 is 0.00%Pi helix(,Ii,):0 is 0.00%Beta bridge(,Bb,):0 is 0.00%Extended strand(,Ee,):125 is 14.85%Beta turn(,Tt,):76 is 9.03%Bend region(,Ss,):0 is 0.00%Random coil(,Cc,):242 is 28.74%Ambigous states(?):0 is 0.00%Other states:0 is 0.00,54,Green:subunit,Yellow:the active site,Cyan:subunit,Gray:subunit,Magenta:B12 molecule,甘油脱水酶空间结构,55,（三）蛋白质分子中的共价键与次级键,共价键：肽键、二硫键,次级键：氢键、盐键、疏水键、范德华力,。,56,五、蛋白质分子结构与功能的关系,（一）蛋白质一级结构与功能的关系,种属差异,分子病,（,二）蛋白质构象与功能的关系,别构现象（变构效应）：蛋白质表现其功能时构象发生变化。,57,58,六、蛋白质的性质,（,一）蛋白质的相对分子量,（二）蛋白质的两性解离及等电点,蛋白质等电点：溶液在某一,pH,值时，蛋白质所带正电荷与负电荷相等，在电场中，蛋白质分子既不向正极也不向负极移动。此时溶液的,pH,值称为蛋白质等电点。,59,蛋白质电泳,蛋白质电泳的方向取决于所带电荷的正负性、所带电荷的多少、及分子颗粒大小。,聚丙烯酰胺凝胶电泳,60,掩盖了其他因素，电泳时只与分子量有关,61,62,SDS-PAGE,SDS-PAGE,63,2DE,仪器系统,恒温水浴,垂直板电泳仪（第二向）,电源,等电聚焦仪（第一向）,64,Comparison of fluorescent labelled 2-D gel with silver staining,Cy,TM,5 labelled gel,Silver stained gel,E.coli,lysate,50,g loading,pH 4-7,65,（三）蛋白质的胶体性质,透析法：小分子可以通过半透膜，而蛋白质不能，从而达到分离纯化的目的。,蛋白质分子表面分布着许多极性和非极性基团，非极性基团与脂溶性物质结合。而极性基团与水溶性物质结合形成,水化层,，水化层使蛋白质颗粒相互排斥，不会凝结沉淀。,66,（四）蛋白质的沉淀反应,加高浓度盐类：破坏水膜,加有机溶剂：破坏水膜,加重金属盐：蛋白质与重金属离子生成不易溶解的盐而沉淀。,67,（五）蛋白质的变性,因受物理或化学因素的影响，蛋白质的分子结构发生变化，致使蛋白质的理化性质和生物学性质都有所改变，但一级结构不变。,68,（六）蛋白质的颜色反应,双缩脲反应：,米伦氏反应：,乙醛酸反应：,坂口反应：,酚试剂反应：,69,七、蛋白质的分类,简单蛋白质：只由,-,氨基酸组成,结合蛋白质：简单蛋白质+非蛋白质部分（辅基）,核蛋白：核酸+蛋白质,糖蛋白与蛋白聚糖,脂蛋白：脂类+蛋白质,色蛋白：色素+蛋白质,磷蛋白：磷酸+蛋白质,70,名人传记-王应睐,71,王应睐,研究员,曾任中国科学院上海分院院长，中科院上海生化所所长，比利时、匈牙利、捷克等国科学院名誉院士，1955年被选为中国科学院学部委员(院士)。王应睐院士是我国著名的生物化学家、近代生物化学科研事业的主要奠基人。首次证明豆科植物中含血红蛋白。成功地组织了人工合成结晶牛胰岛素与酵母丙氨酸转移核糖核酸两项重大基础性研究工作。1996年获香港何梁何利基金科学技术成就奖。,72,名人传记-,邹承鲁,邹承鲁,1923 年生,江苏无锡人。1951 年获剑桥大学博士。中国科学院院士，第三世界科学院院士,生物物理所研究员。曾任中科院生物学部主任,全国政协委员、常委,中国生物化学与分子生物学会理事长。在国内外发表科学论文二百余篇。由于在胰岛素人工合成，蛋白质和酶学方面的贡献，曾获第三世界科学院奖、陈嘉庚生命科学奖、国家自然科学及中科院自然科学奖多次。自传在国外出版的综合生物化学丛书生物化学史卷发表,对当代生物化学发展的贡献已载入史册。,73,邹承鲁照片,74,邹承鲁简历：由王应睐教授介绍去剑桥大学师从,Keilin,教授,第一篇论文1949 年在英国,Nature,杂志上发表，导师,Keilin,教授不署名,1951 年回国，在中国科学院上海生物化学研究所建立了研究组,参与结晶牛胰岛素的人工全合成,1970 年由上海调到北京生物物理所工作,75,科学家的境界追求,心无旁骛，割席断交,管宁、华歆共园中锄菜，见地有片金，管,挥锄,与瓦石不异，华,捉,而掷之去。又尝同席读书，有乘轩冕过门者，宁读如故，歆废书出看。宁割席分坐曰：子非吾友也。,76,小 结,重要概念：等电点 肽健 肽平面,-,螺旋,-,折叠,-,转角 超二级结构 结构域 别构现象 结合蛋白 盐析,蛋白质的结构：一级结构二级结构超二级结构结构域三级结构四级结构,有关蛋白质的化学反应,蛋白质的分离提纯,77,第二节 蛋白质生物合成,78,遗传密码,79,蛋白质合成概述,DNA:ATGCATGCATGC,RNA:AUGCAUGCAUGC,Protein:aa,1,aa,2,aa,3,aa,4,碱基序列决定氨基酸序列,如何实现碱基序列到氨基酸序列的转变？,80,T,A,C,T,T,T,A,A,A,G,T,A,Transcription-The Production of mRNA,RNA Polymerase begins to work!,Start Here!,A,U,U,G,G,A,A,A,A,A,A,A,Stop Here!,81,T,A,C,T,T,T,A,A,A,G,T,A,82,mRNA moves out of the,nucleus to Rough Endoplasmic Reticulum,Rough ER,Nuclear Membrane,Ribosomes,mRNA,83,A,A,A,G,U,A,Translation-Protein Synthesis,Codon,Codon,U,U,U,tRNA,Anti Codon,U,A,C,tRNA,Methionine,U,U,U,tRNA,Phenylalanine,84,Polypeptide formation,via peptide bonds.,Translation-Protein Synthesis,Ribosome(s)move along mRNA.tRNA carriers amino acids for building polypeptide.,tRNA drops away from ribosome/mRNA once amino-acid it carries is joined onto the growing polypeptide via peptide bonds.,85,Primary,Secondary,Tertiary and Quaternary Structure-Protein Synthesis,Primary,Secondary,Tertiary,Unfolded single polypeptide strand,Folded single polypeptide strand-Secondary&Tertiary,Several polypeptide strands,Quaternary,86,Translation-big picture,Initiation:Recruit,fMet-tRNAMet,mRNA,large particle,Elongation:,Synthesize protein,Termination:,Stop synthesis,release protein,87,一、,mRNA,mRNA,概念最初由,F.Jacob,和,J.Monod 1965,年提出当时推测，有一种信使在细胞核中合成后携带上遗传信息进入细胞质，指导蛋白质合成，后来发现，除,rRNA,和,tRNA,之外的第三种,RNA,，称为信使,RNA(mRNA),。,mRNA,半衰期很短,一旦完成使命就被水解。,原核生物和真核生物,mRNA,的结构差异较大，尤其是在,5,端。,88,（一）原核生物,mRNA,的结构,1,、,5,端,SD,序列,在起始密码子,AUG,上游,9-13,个核苷酸处，有一段可与核糖体,16SrRNA,配对结合的、富含嘌呤的,3-9,个核苷酸序列，一般为,AGGA,，此序列称,SD,序列。它与核糖体小亚基内,16S rRNA,的,3,端一段富含嘧啶的序列,GAUCACCUCCUUA-OH,（暂称反,SD,序列）互补，形成氢键。使得结合于,30S,亚基上的起始,tRNA,能正确地定位于,mRNA,的起始密码子,AUG,。,89,Ribosome binding site,(,RBS,)or,SD-sequence,in prokaryotic mRNA,complementary with the sequence at the 3 end of 16S rRNA.,structure of mRNA,90,2,、原核,mRNA,转译时，各个基因都有自己的,SD,序列、起始密码子、终止密码子，分别控制其合成的起始与终止，换言之，每个基因的翻译都是相对独立的。如,E.coli,，一个,7000b,的,mRNA,编码,5,种与,Trp,合成有关的酶,多基因共表达载体构建时，可利用,SD,序列，将几个基因串联,91,（二）真核生物,mRNA,的结构,1,、真核生物,mRNA 5,端均具有,m,7,GpppN,帽子结构,，,无,SD,序列,。,帽子结构具有增强翻译的作用。若起始,AUG,与帽子结构间的距离太近（小于,12,个核苷酸），就不能有效利用这个,AUG,，会从下游适当的,AUG,起始翻译。当距离在,17-80,个核苷酸之间时，离体翻译效率与距离成正比。,92,2,、真核生物,mRNA,通常是,单顺反子,。,真核,mRNA,具有“第一,AUG,规律”，即当,5,端具有数个,AUG,时，只有,1,个,AUG,为主要开放阅读框架的翻译起点。起始,AUG,具有,2,个特点：,（,i,）,AUG,上游的,-3,经常是嘌呤，尤其是,A,。,（,ii,）紧跟,AUG,的,+4,常常是,G,。,起始,AUG,邻近序列中，以,A,NNAUG,G,N,的频率最高。若,-3,不是,A,，则,+4,必须是,G,。无此规律的,AUG,，则无起始功能。,93,Once,Kozak sequence,Eukaryotic mRNA uses a,methylated cap,to recruit the,ribosome.Once bound,the ribosome,scans,the mRNA in a 5-3 direction to find the AUG start codon.,Kozak sequence,increases the translation efficiency.,Poly-A in the 3 end,promotes the efficient recycling of ribosomes,94,94,KOZAK,是一个女科学家,她研究过起始密码子,ATG,周边碱基定点突变后对转录和翻译所造成的影响，并总结出在真核生物中，起始密码子两端序列为：,G/N-C/N-C/N-ANNATGG,，如,GCCACCATGG,、,GCCATGATGG,时，转录和翻译效率最高，特别是,-3,位的,A,对翻译效率非常重要。关于,kozak,序列的这篇文章发表在,Nucleic Acids Res.1984,上，该序列被后人称为,Kozak,序列，并被应用于表达载体构建,95,二、遗传密码,氨基酸排列顺序由,mRNA,的核苷酸顺序决定。如果每,2,个核苷酸编码,1,个氨基酸,那么,4,种核苷酸只有,16,种编码方式。如果每,3,个核苷酸编码,1,个氨基酸,则有,64,种编码方式,。如果,4,对,1,则有,256,种,显然没必要。科学家们已用生物化学实验证实,3,个碱基编码,1,个氨基酸,称为三联体密码或密码子。,96,（一）遗传密码的破译,美国科学家,M.W.Nirenberg,等人破译了遗传密码,于,1968,年获得诺贝尔生理医学奖,.,早在,1961,年，,M.W.Nirenberg,等人在大肠杆菌的无细胞体系中外加,poly(U),模板、,20,种标记的氨基酸，经保温后得到了多聚,phe-phe-phe,，于是推测,UUU,编码,phe,。利用同样的方法得到,CCC,编码,pro,，,GGG,编码,gly,，,AAA,编码,lys,。,如果利用,poly,（,UC,），则得到多聚,Ser-Leu-Ser-Leu,，推测,UCU,编码,Ser,，,CUC,编码,Leu,，因为,poly,（,UC,）有两种读码方式：,UCUCUC,和,CUCUCU,采用该方式，到,1965,年就全部破译了,64,组密码子。,97,（二）遗传密码的特点,在,64,个密码子中有,61,个编码氨基酸，,3,个不编码任何氨基酸而起肽链合成的终止作用，称为终止密码子，它们是,UAG,、,UAA,、,UGA,，密码子,AUG,（编码,Met,）又称起始密码子。（,编码链上则为,TAG,、,TAA,、,TGA,、,ATG,）,密码子：,mRNA,上由三个相邻的核苷酸组成一个密码子，代表肽链合成中的某种氨基酸或合成的起始与终止信号。,（,1,）,方向性,：从,mRNA,的,5,到,3,98,（,2,）连读性,从起始密码子到终止密码子构成一个连续的阅读框架（,ORF,）（不包括终止密码子）。如果在阅读框中插入或删除一个碱基就会使其后的读码发生移码。,两个基因之间或两个,ORF,之间可能会互相部分重叠（共用部分序列）。,（,3,）简并性,几种密码子编码同一种氨基酸称为密码子简并性。如,GGN,（,GGA,、,GGU,、,GGG,、,GGC,）都编码,Gly,，这,4,种密码子称为,Gly,的简并密码。只有,Met,和,Trp,没有简并密码。一般情况下密码子简并性只涉及第三位碱基。,99,问题：简并性的生物学意义？,可以降低由于遗传密码突变造成的物种灾难,试想，如果每种氨基酸只有,1,个密码子，如果一旦哪个氨基酸的密码子发生了单碱基的点突变，那么极有可能造成肽链合成的过早终止。例如，由于简并性的存在，不论第三位的,U,变成什么，都仍然编码,Ala,100,（,4,）摇摆性,密码子中第,3,位碱基与反密码子第,1,位碱基配对不一定完全遵循,A-U,、,G-C,的原则，即密码子的第,1,、,2,位是严谨配对的，第,3,位严谨度低。密码子第,3,位和反密码子的第,1,位是摇摆位点，,Crick,称之为摇摆性。,反密码子第,1,位的,G,可以与密码子第,3,位的,C,、,U,配对，,U,可以与,A,、,G,配对，另外反密码子中还经常出现罕见的,I,，可以和密码子的,U,、,C,、,A,配对，这使得该类反密码子的阅读能力更强。,101,102,问题：细胞内有几种,tRNA,？,遗传密码破译后，由于有,61,个密码子编码氨基酸，于是预测细胞内有,61,种,tRNA,，但事实上绝大多数细胞内只有,50,种左右，,Crick,提出的摇摆假说合理解释了这种情况。,根据摇摆性和,61,个密码子，经过仔细计算，要翻译,61,个密码子至少需要,31,种,tRNA,，外加,1,个起始,tRNA,，共需,32,种。但在叶绿体和线粒体内，由于基因组很小，密码子少，叶绿体内就有,30,种左右,tRNAs,，线粒体只有,24,种。,（,5,）通用性,：密码子在不同物种间几乎是完全通用的。,目前只发现线粒体和叶绿体内有例外情况。但是不同生物往往偏爱某一种密码子。,103,三、核糖体,核糖体又称,核蛋白体,，是蛋白质合成场所,.,标记各种氨基酸，注入大鼠体内，在不同时间取出肝脏，匀浆，离心分离各种亚细胞器，分析放射性蛋白的分布，证实蛋白质合成在核糖体上进行。就真核细胞而言，核糖体按其在细胞质中的位置分为游离核糖体（合成细胞质蛋白）和内质网核糖体（合成分泌蛋白和细胞器蛋白）。,104,105,不论原核细胞还是真核细胞，一条,mRNA,可以同时被几个核糖体阅读，把同时结合并翻译同一条,mRNA,的多个核糖体称为,多核糖体,。,106,107,（一）核糖体的结构与组成（,2009,年诺贝尔化学奖,）,核糖体是由核糖核酸（,rRNA,）和几十种蛋白质（核糖体蛋白）组成的巨大复合体。不同生物中核糖体的结构高度保守，尽管其,rRNA,和核糖体蛋白的一级结构有所不同，但其三级结构却惊人相似。,核糖体是核酸和蛋白密切合作的体现！,108,每个核糖体是由大小两个亚基组成，,每个亚基都有各自不同的,rRNA,和蛋白质分子,核糖体的大亚基上有两个重要的位点：,P,位点,是结合肽酰,tRNA,的肽酰基的位点，,A,位点,是结合氨酰,tRNA,的氨酰基的位点。,109,（二）,rRNA,与核糖体蛋白的结构与功能,1,、,rRNA,的结构与功能,结构：有大量茎环（发夹）结构，可能是核糖体的钢筋骨架。,功能：,（,1,）蛋白质合成的施工平台,（,2,）参与,tRNA,与,mRNA,的结合,mRNA,先识别,rRNA,的特定序列并结合固定,然后,tRNA,再识别并固定到,rRNA,特定部位，其反密码子才与,mRNA,密码子配对。已知,16SrRNA,上有一段序列与原核,mRNA,上的,SD,序列相结合。,110,（,3,）在大小亚基的聚合中起作用,（,4,）在翻译的校正和调控方面有重要功能（如可结合调控因子）,总的来说，,RNA,分子似乎是整个核糖体的活性中心。,111,2,、核糖体蛋白的结构与功能,结构：大多数核糖体蛋白呈纤维状（可能起骨架作用），少数呈球状（可能起生物功能）。,功能：,(1),维持核糖体的结构,(2),一些核糖体蛋白具有,DNA,结构（,HeilixturnHeilix,模块）；还有些真核核糖体蛋白具有,DNA,修复功能,112,四、蛋白质合成的机理,真核和原核生物在蛋白质合成方面有共同之处,以下为蛋白质合成的一般过程。,游离氨基酸在掺入肽链前须先活化以获得能量，每一种游离氨基酸须在专一的氨酰,tRNA,合成酶作用下与专一的,tRNA,相连（称为装载），然后由,tRNA,将它带至核糖体的特定位点（,A,位点）并添加到正在合成的肽链,C,端。这种从游离氨基酸到形成氨酰,tRNA,的过程是氨基酸活化过程。,113,（一）氨酰,tRNA,合成酶：,氨基酸活化和氨酰,tRNA,合成是蛋白质合成的第一步，由氨酰,tRNA,合成酶催化，该酶既能识别氨基酸，又能识别,tRNA,。,1,、活化,在,Mg,2+,存在下，氨酰,tRNA,合成酶首先识别并结合专一的配体氨基酸，然后氨基酸的羧基与,ATP,发生反应形成一个酸酐型的高能复合物（氨酰,AMP,中间复合物），该中间复合物暂时结合在酶上。,酶,/Mg,2+,氨基酸,+ATP,氨酰,AMP-,酶,+PPi,114,AMP,115,2,、连接,氨酰,tRNA,合成酶有专一的,tRNA,识别位点，因此游离,tRNA,就会识别并结合到氨酰,AMP-,酶复合物的活性部位，氨基酸被转移到,tRNA,的,3,端，其羧基与,tRNA 3,端的自由,-OH,形成氨酰酯键，从而形成氨酰,tRNA,，此为高能化合物，其能量足以形成肽键。由于氨酰,tRNA,能量低于氨酰,AMP,，所以这一过程是自发的。,tRNA,+,氨酰,AMP-,酶氨酰,tRNA+AMP+,酶,116,116,aa-tRNA synthase,117,Complex of ClassI Tyr-tRNA synthetase with tRNA,tyr,Fig.Interactions between tyrosyl-tRNA synthetase and tRNAtyr.(A)The C-terminal domain(orange)binds in the,elbow between the long variable arm and the anti-codon stem of the tRNA(red backbone,green bases).The,anti-codon stem loop interacts with both the C-terminal domain and the-helical domain(pink).The tRNA makes no,contact with the catalytic domain of the same subunit(cyan).(B)The unusual conformation of the anti-codon triplet in,which Ade-36 is stacked on Gua-34,while Psu-35 bulges out.(C)Base-specific interactions of Asp-259 from the,-helical domain with Gua-34 and Asp-423 from the C-terminal domain with Psu-35.,118,mRNA,119,氨酰,tRNA,的去向由,tRNA,来决定，,tRNA,凭借自身的反密码子与,mRNA,上密码子相识别。,结论：,（,1,）氨基酸的活化和氨酰,tRNA,的合成是蛋白质生物合成的第一步，活化和连接都发生在氨基酸的羧基上。,（,2,）载体,tRNA,凭借自身的反密码子与,mRNA,上的密码子识别而把所携带的氨基酸送到肽链的一定位置上,（,3,）遗传信息是通过,mRNA,上的密码子与,tRNA,上的反密码子间碱基配对作用而传递。,120,氨酰,tRNA,合成酶：,氨酰,tRNA,合成酶既能识别氨基酸，又能识别,tRNA,，从而使氨基酸与,tRNA,相对应，故把氨酰,tRNA,合成酶的双向识别功能称为第二遗传密码。,121,不同氨酰,tRNA,合成酶在分子量、氨基酸序列、亚基组成上差异较大。,其识别氨基酸的机理尚不太清楚。一些氨基酸结构极其相似，尽管,Ile,与,Val,仅差一个甲基,但,tRNA,Ile,合成酶也能正确识别。偶尔也错误形成,Val tRNA,Ile,，但是氨酰,-tRNA,合成酶都有一个校正位点，由于大小原因，只有,Val tRNA,Ile,才能结合到校正位点，然后合成酶将,Val,又从,tRNA,Ile,上将其水解下来。,122,氨酰,tRNA,合成酶能正确识别和结合,tRNA,，一些氨酰,tRNA,合成酶识别,tRNA,上的反密码子，以及,tRNA,上的受体茎环（,acceptor stem,）。,tRNA,分子的突变与校正基因,tRNA,是一个万能接头：,（,1,）有氨酰,-tRNA,合成酶的识别位点（,接头合成酶,）,（,2,）,3,端,-CCA,上的氨基酸运载位点（,接头氨基酸，装载,）,（,3,）有核糖体的识别位点（,将氨基酸运送到目的地,）,（,4,）反密码子位点（,接头,mRNA,，验货并卸载,）,123,回复突变,：突变型生物有时通过遗传物质的变化重新获得其原有表型，被回复的生物称为,回复子,。,回复突变的原因很多，有一种回复突变是其基因上发生一个突变而引起，称为基因,校正突变,。大多数基因较正突变发生在,tRNA,基因上。,124,（二）蛋白质合成的一般过程,可以分为三个阶段：,起始、,延伸、,终止，,分别由不同的起始因子、延伸因子和终止因子（释放因子）参与。,125,Fig 14-14 Overview of the events of translation/ribosome cycle,126,Polysome/polyribosome,:an mRNA bearing multiple ribosomes,Each mRNA can be translated simultaneously by multiple ribosomes,Fig 14-15 A polyribosome,127,1,、,翻译起始,（,1,）小亚基与,mRNA,结合,（,2,）起始氨酰,tRNA,进入,P,位点，其反密码子与,mRNA,上的起始密码子,AUG,碱基配对。,（,3,）大亚基与小亚基结合形成起始复合物。,128,2,、延伸,方向：,mRNA 5,/,3,/,新生肽：,N,/,C,/,（,1,）就位：第二个氨酰,tRNA,通过密码子,反密码子的配对作用进入核糖体的,A,位点（氨基位点）。,（,2,）转肽：在大亚基上肽酰转移酶作用下，,A,位点氨基酸的,-,氨基亲核攻击,P,位点上氨基酸的羧基并形成肽键，结果两个氨基酸均连到,A,位点的,tRNA,上，该过程称为转肽作用，此时，,P,位点上卸载的,tRNA,从核糖体上离开。,（,3,）移位（,translocation,）：核糖体沿着,mRNA,移动,1,个密码子位置，,tRNA,移位到,P,位点，,A,位点空出以便接纳下一个氨基酸。,129,3,、终止,由于终止密码子不能结合任何氨酰,tRNA,，于是终止因子（又称释放因子）识别并结合到终止密码子上，接着肽转移酶的酯化酶功能转变成水解功能，将肽链从,P,位点,tRNA,上水解掉，核糖体释放掉