分子生物学研究方法-9.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,一、重组DNA技术发展史上的重大事件,三大理论基础：,1.40年代确定了,遗传信息的携带者,，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；,2.50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的,自我复制和世代交替,问题；3.50年代末至60年代，相继提出了,中心法则和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。,三大技术支持,1970 H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了,限制性核酸内切酶,。,1972-1973 H.Boyer，P.Berg等人发展了,DNA重组技术,，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。,1975-1977 F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了,DNA序列测定技术,。,1981R.D.Palmiter和R.L.Brinster获得转基因小鼠；,1983获得第一例转基因植物。,1994第一批基因工程西红柿在美国上市。,1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。,2003,年人类基因组计划完成，中国,1%,，,二、基因操作的主要技术原理,1 核酸的凝胶电泳(Agarose),2 核酸的分子杂交技术,3 细菌的转化,4 DNA序列分析,5.基因的定点诱变（,site-directed mutagenesis）,6 利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究,1 核酸的凝胶电泳,将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的,净电荷数成正比,，而与分子的,摩擦系数成反比,（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。,在生理条件下，核酸分子中的,磷酸基团,是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈,多聚阴离子状态,（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由,负极正极移动,。,在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）-ethidium bromide染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。,核酸杂交技术从Hall等1961年的工作开始的，探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体。该法很慢、费力且不精确，但它开拓了核酸杂交技术的研究。,60年代中期Nygaard 等的研究为应用标记DNA或RNA探针检测固定在硝酸纤维素（NC）膜上的DNA序列奠定了基础。,2 核酸的分子杂交技术,70年代末期到80年代早期，分子生物学技术有了突破性进展，限制性内切酶、载体系统的发展和应用。,固相化学技术和核酸自动合成仪的诞生，现在可常规制备18100个碱基的寡核苷酸探针。应用限制酶和Southern印迹技术，用数微克DNA就可分析特异基因，大大提高了杂交水平和可信度。,核酸杂交反应首先经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，然后通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”转移到滤膜上的。,常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）等。,将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。核酸杂交也称印迹杂交。,核酸杂交技术与其它技术相结合广泛应用于特定,基因的表达,、基因,定位,、遗传病的,检测,、组织病理学的研究、生物分类方面。,核酸分子杂交的基础是通过碱基对之间非共价键（主要是氢键）的形成出现稳定的双链区。,杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。,分子杂交可在DNA与DNA（Southern blot）、RNA与RNA(In situ)或RNA与DNA(Northern blot)的二条单链之间进行。,由于DNA一般都以双链形式存在，因此在进行分子杂交时，应先将双链DNA分子解聚成为单链，这一过程称为变性，一般通过加热或提高pH值来实现。,是指将核酸分子固定在纤维膜上的过程。将核酸从电泳后的凝胶中转移到膜上或直接将核酸点到膜上。是核酸杂交过程中的主要步骤之一。,转膜,关键步骤,探针标记,标记方法：缺口平移、末端标记、随机引物延伸、聚合酶链反应等。,核酸探针的种类：DNA探针、cDNA探针、RNA探针、寡核酸探针。,选择标记方法：一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高。在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法。,在对灵敏要求不高时，可采用生物素探针技术,杂交的方法：,菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）,点杂交（Dot blot）,Southern印迹杂交（Southern blot）,Northern印迹杂交（Northern blot）,组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）等。,菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将DNA烘干固定于膜上与,32,P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。,菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）,点杂交（Dot blot）,将被检测标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（manifolds），如Minifold I和II、Bio-Dot(BioRad)和HybriDot,它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。,Southern blot 是研究DNA图谱的基本技术，在遗传诊断DNA图谱分析、特定基因组的分析及PCR产物分析等方面有重要价值。,Southern印迹杂交（Southern blot）,基本方法,将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各,酶解,片段，然后经,碱变性,，高盐下通过,毛吸作用,将DNA从凝胶中,转至,硝酸纤维素滤膜上，烘干固定后即可用于杂交。,凝胶中DNA片段的,相对位置,在DNA片段转移到滤膜的过程中,继续保持,着。附着在滤膜上的DNA与,32P标记的探针杂交,，利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置，从而可以确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的,位置和大小,。,将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜方法。,DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术。RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被趣称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。,Northern印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在进样前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使,RNA变性,，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2-羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合以及保持其单链状态。,Northern印迹杂交（Northern blot）,不同之处：没有酶切,组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。,因此,原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，例如，与细胞RNA的杂交可精确分析一种RNA在细胞中和组织中的分布。,组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）,3 细菌的转化,细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自外源DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。,大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。在加入转化DNA之前，必须预先用CaCl,2,处理大肠杆菌细胞，使之呈,感受态,（Competent Cells）,质粒DNA中的抗生素是筛选标记。,4 DNA序列分析,a.Sanger的双脱氧链终止法,b Maxam-Gilbert化学修饰法,Sanger的双脱氧链终止法,Cambridge的F.Sanger在1977年发明用双脱氧链终止法测定单链DNA的序列，其基本原理如下：DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链；,该酶能够用,2，3-双脱氧核苷三磷酸,作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3-末端，从而终止其延伸反应。,在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物，如T7，T3，M13等），dA，dT，dG，dC和一种ddNTP和DNA聚合酶。,2，3ddNTP与普通dNTP不同之处在同它们在脱氧核糖的3 位置缺少一个羟基。它们可以在DNA聚合酶作用下通过其5 三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但由于没有3羟基，它们不能同后续的dNTP形成磷酸二酯链，因此，正在增长的DNA链不可能继续延伸。,DNA聚合酶,通常用于双脱氧法序列测定的有几种不同的酶：,大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段,反转录酶,测序酶,Taq DNA聚合酶：从嗜热水生菌分离的耐热DNA聚合物。,测序中的关键酶类,（1）大肠杆菌DNA聚合酶 I Klenow 片段,最初用以建立Sanger法的酶，至今仍广泛用于DNA序列测定。,不足：,1）Klenow片段的,持续合成能力低,，以致一些片段并非由于dd NTP的掺入，而是因为聚合酶在模板上随机解离而终止合成，因而导致背景增高。由于该酶不能沿模板进行长中距离移动，因此利用该酶进行的标准测序反应所得序列的长度有限。通常，这一反应只能得到大约250-350个核苷酸的序列。,2）Kle,now酶对模板中的,同聚核苷酸,段或其他含牢固二级结构的区域进行复制的效能很低。,将聚合反应的温度提高到55，可以缓解但并不能彻底解决这一问题。,因此，Klenow片段仅测定250个碱基以内的一段DNA序列，不宜用它来测定更长一段DNA序列或者具有二重对称和（或）同聚核苷酸段的DNA序列。,2）反转录酶,不是测序工作中广泛使用的酶，主要用于解决一些由于模板DNA中存在A/T或G/C同聚核苷酸区而引起的问题。,反转录酶测序效果比比Klenow酶略胜一筹。,3）测序酶,T7噬菌体DNA聚合酶,，化学修饰消除35外切酶活性。,特点,：极其稳定、高活性、持续合成能力很强、聚合速率很高。,测定长段DNA序列的,首选酶,。测序酶可以沿模板移动很长的距离，因而一套反应常常就可以测定数百个核苷酸的DNA序列。实际上，测得序列的长度更多是受聚丙烯酰胺凝胶的分辨能力而不是受该聚合酶的特性所制约。,（4）Taq DNA聚合酶,Taq DNA聚合酶适用于测定稳定一级结构的单链DNA模板序列。这是因为Taq DNA聚合酶在70-75活性最高，这一温度下即使GC丰富的模板也无法形成二级结构。这种酶的持续合成能力甚佳。,Taq DNA聚合酶是一个单亚基，分子量为94，000Da。具有5-3的聚合酶活力，5-3的外切核酸酶活力。不具有3-5的外切核酸酶活力，会在3末端不依赖模板加入1个脱氧核苷酸（通常为A），在离体反应中，Taq DNA聚合酶的出错率为10,-4,-10,-5,。,测序型的Taq DNA聚合酶经修饰，具有较低的5-3外切酶活力，有利于在测序中获得均匀强度的片段和低的背景。延伸反应在70,进行，可消除模板中的次级结构。,Maxam-Gilbert化学修饰法,该方法的基本原理是用,化学试剂,处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。,该反应的关键在于使DNA的4种核苷酸中，只有1-2种发生特异性的化学切割反应：,第一步,先对特定碱基（或特定类型的碱基）进行化学修饰,第二步,修饰碱基从糖环上脱落，修饰碱基5和3的磷酸二酯链断裂。,在每种情况下，这些反应都要在精心控制，确保每个DNA分子只有一个靶碱基被修饰。随后裂解修饰碱基的5和3位置，得到一组从一到数百个核苷酸不等的末端标记分子。,用来对核苷酸作化学修饰，并打断磷酸二酯键的化学试剂有,硫酸二甲酯(dimethylsulphate)和肼(hydrazine)。,G反应,：,DMS,(,硫酸二甲酯),使鸟嘌呤的7位氮原子甲基化，其后断开第8位碳原子和第9位氮原子间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。,G+A反应,：,甲酸,使嘌呤环上的氮原子质子化，削弱了腺嘌呤脱氧核糖核苷酸和鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸中的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。,T+C反应,：肼断开了嘧啶环，产生的碱基片段能被哌啶所置换。,C反应,：在NaCl存在时，只有C才能与肼发生反应，随后被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。,compare,Maxam-Gilber法所能测定的长充要比Sanger法短一些，它对放射性标记末端250个核苷酸以内的DNA序列效果最佳。,在70年代Maxam-Gilbert法和Sanger法刚刚问世时，利用化学降解进行测序不但,重现性,更高，而且也容易为普通研究人员所掌握。,Sanger 法:单链模板和特异寡核苷酸的，并需获得大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow 片段的高质量酶制剂。,Maxam-Gilbert法只需要人所共的简单化学试剂。,随着M13 噬菌体和噬菌粒载体的发展，也由于现成的合成引物及测序反应日臻完善，双脱氧链终止法如今远比Maxam-Gilbert法应用得广泛。,c DNA序列分析自动化,用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作为,荧光剂,标记DNA引物，带有这种引物的DNA片段能在激光诱导下发出荧光。按照标准的双脱氧终止法或化学终止法进行测序反应，跑DNA凝胶后用计算机检测。,5 基因的定点诱变（site-directed mutagenesis）,使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。,a.盒式诱变(cassette mutagenesis)，包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。,b寡核苷酸引物诱变,CPCR与PCR诱变,盒式诱变,盒式取代诱变,寡核苷酸引物诱变,PCR,诱变,6 DNA与蛋白质的相互作用研究,a.凝胶滞缓实验(Gel retardation assay)，-,又称DNA迁移率变化试验(DNA mobility shift assay-EMSA)。,b DNase I 印迹试验（DNase I foot printing）,c 甲基化干扰试验(Methylation interference assay),d 体内足迹试验,可用于鉴定DNA与蛋白质结合的情况,将标记的DNA小片段与蛋白质混合进行PAGE电泳，不结合蛋白质的DNA泳动较快，结合蛋白质的DNA则滞留而缓慢移动。,凝胶滞缓实验,DNase I 印迹试验（DNase I foot printing）,即,DNA footprinting,DNA,结合蛋白质后不被,DNase,酶切，标记一条链末端，电泳分析可鉴定,DNA,蛋白质结合部位。,主要步骤：用,32,P标记DNA双链末端，并用RE切去一端；加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育；加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使DNA链发生断裂。这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关键，保证一条链只发生一次断裂！沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）；进行DNA凝胶分析。,c 甲基化干扰试验,用DMS(,硫酸二甲酯,)处理靶DNA，使平均每条链上只有一个G被甲基化。将局部甲基化的DNA与含DNA结合蛋白的细胞提取物共温育后进行凝胶滞缓试验。分离各种DNA条带，并用六氢吡啶切割甲基化的残基。G残基的,甲基化作用会阻止蛋白质与DNA的结合,，那么，六氢吡啶在没有蛋白质结合的DNA上切割甲基化G残基。,d 体内足迹试验,用适量DMS处理完整的游离细胞，使染色质中的G残基甲基化，提取DNA并加入六氢吡啶切割DNA链。与对照的裸露DNA经甲基化处理后形成的梯度相对照，就能发现DNA链上的蛋白质结合区。,