基因工程的基本操作程序-2021推选ppt.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,基因工程的基本操作程序,基因工程的基本操作程序,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,为什么要有,“,目的基因的获取,”,这一步？,有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。,一、目的基因的获取,真核细胞的基因结构,什么是,“,目的基因,”,？,原核细胞的基因结构,目的基因主要是,_,，也可以是一些具,有调控作用的因子,编码蛋白质的结构基因,目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌,抗虫基因,、植物,抗病基因,（抗病毒、抗细菌,),、种子,贮藏蛋白基因,及,人,胰岛素基因,等。,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,DNA在高温下变性解旋,为什么要有“表达载体的构建”这一步？,将目的基因导入受体细胞,2、下列属于获取目的基因的方法的是(),构建基因文库只是获取目的基因的方法之一。,表达载体与感受态细胞混合,利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,模板DNA(需含有目的基因),（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；,与DNA模板结合，形成局部_。,与DNA模板结合，形成局部_。,细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。,上是否插入了目的基因,在生物_复制_的核酸合成技术,1,）从基因文库中获取目的基因,获得目的基因的方法,2,）利用,PCR,技术扩增目的基因,未知目的基因的核苷酸序列,已知目的基因的核苷酸序列,3,）人工合成,且基因比较小,且基因比较大,将含有某种生物不同基因的许多,DNA,片段,，导入,受体菌的群体,中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为,基因文库,。,1.,基因文库概念,2.,基因文库的分类,:,按外源,DNA,片段的来源分类,种类,部分基因文库：,只包含了一种生物的,部分,基因，,如：,cDNA,文库,基因组,DNA,文库：,含有一种生物的,全部,基因,3,、基因文库的构建,（,1,）基因组文库的构建,提取某生物,全部,DNA,用适当,限制酶切割,许 多,DNA,片段,与载体连接,导入受体菌群,该生物基,因组文库,（每个受体菌含有一段不同的,DNA,片段）,（,2,）,cDNA,文库的构建,mRNA,反转录形成,与载体连接,导入受体菌群,mRNA,逆转录酶,杂交双链,核酸酶,H,单链,DNA,DNA,聚合酶,双链,DNA,(,cDNA,),该生物,cDNA,文库,基因组,DNA,文库,cDNA,文库,真核生物转录过程,文库类型,cDNA,文库,基因组文库,基因多少,文库大小,启动子,内含子,物种间的基因交流,基因组,DNA,文库与,cDNA,文库的比较,某种生物部分基因,某种生物全部基因,小,大,无,有,无,有,可以,部分基因可以,村长,为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物中提取不行吗？,当然行啊。构建基因文库只是获取目的基因的方法之一。但是，有时我们完全,不知道目的基因序列,，或者想从一种生物体内获得,许多基因,，或者想知道几种生物之间有哪些基因不同，或者想知道一种生物在,不同的发育阶段,都表达哪些基因，或者想得到一种生物的,全部基因序列,，往往就需要构建基因文库。,4.,基因文库的目的,1,、概念,：,PCR,全称为,_,，是一项,在生物,_,复制,_,的核酸合成技术,通过这项技术可在,短时间内大量扩增目的基因,因为整个过程是在体外进行，所以又叫做,体外,DNA,扩增技术。,聚合酶链式反应,体外,特定,DNA,片段,2,、原理：,DNA,复制,利用,PCR,技术扩增目的基因,四种脱氧核苷酸,(dNTP),一对引物：,热稳定,DNA,聚合酶,(Taq,酶）,模板,DNA(,需含有目的基因,),4,、条件：,一小段单链,DNA,或,RNA,，,一般,20,30个碱基,，能与,DNA,母链的一段碱基序列,互补配对,。,已知目的基因的核苷酸序列,3,、前提：,温度控制,PCR,扩增仪,5,、方式：,指数,2,n,6,、结果：,使目的基因的片段在,短时间内大量地扩增,以,_,方式扩增，即,_,（,n,为扩增循环的次数）,扩增过程,a,、,DNA,变性（,90-95,）：,双链,DNA,模板,在热作用下，,断裂，形成,_,b,、,复性（,55-60,）：,系统温度降低，,引物,与,DNA,模板结合，形成局部,_,。,c,、,延伸（,70-75,）：,在,Taq,酶,的作用下，从,引物的,5,端,3,端延伸，合成与模板互补,的,_,。,氢键,单链,DNA,双链,DNA,链,PCR,仪,微量离心管,一 次 性,吸液枪头,调节轮,卸枪头按钮,推动按钮,卸枪头器,微量移液器,利用,PCR,技术扩增目的基因,PCR,技术,DNA,复制,相同点,原理,原料,条件,不同点,解旋方式,场所,酶,结果,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA,在高温下变性解旋,解旋酶催化,体外,复制,细胞,核内,热稳定的,DNA,聚合酶,细胞内的,DNA,聚合酶,大量的,DNA,片段,形成整个,DNA,分子,通过,DNA,合成仪用化学方法人工合成,DNA,合成仪,蛋白质的氨基酸顺序,mRAN,核苷酸序列,基因,DNA,的核苷酸序列,目的,基因,推测,推测,合成,当,基因比较小,、,蛋白质的氨基酸序列可以测得,或,核苷酸序列已知,时，可采用此种方法。,DNA,合成仪,为什么要有“表达载体的构建”这一步？,单独的,DNA,片段,目的基因是,不能稳定遗传,的。,构建表达载体的目的是为了,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，,同时使目的基因能,表达,和发挥作用。,1.,用一定的,_,切割载体，使其出现一个切口，露出,_,。,2.,用,_,切断目的基因，使其产生,_,。,核心,3.,将切下的目的基因片段插入载体的,_,处，再加入适量,_,，形成了一个重组,DNA,分子,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,相同的黏性末端,切口,DNA,连接酶,二、基因表达载体的构建,DNA,连接酶,基因表达载体的组成：,c,、目的基因,b,、启动子,d,、终止子,e,、标记基因,a,、复制原点,启动子：,位于基因的首端的一段特殊的,DNA,片断，它是,RNA,聚合酶识别和结合的部位,，有了它才能,驱动基因转录出,mRNA,，最终获得蛋白质。,终止子：,位于基因的尾端的一段特殊的,DNA,片断，,能终止,mRNA,的转录。,三、将目的基因导入受体细胞,常用的受体细胞：,动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。,将目的基因导入受体细胞的原理：,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,转化,目的基因进入,_,内，并且在 受体细胞内维持,_,和,_,的过程,受体细胞,稳定,表达,方法,导入,植物,细胞,导入,动物,细胞,导入,微生物,细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞吸收,DNA,分子,农杆菌特点：,易感染,双子叶植物,和,裸子植物,。,Ti,质粒的,T-DNA,可转移至受体细胞的染色体上,基因枪法,基因枪法又称微弹轰击法，是利用,压缩气体产生的动力,，将包裹在金属颗粒表面的,表达载体,-DNA,打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,花粉管通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加,表达载体,-DNA,，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,显微注射法,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到子宫,受精卵发育,新性状动物,2.,微生物作受体细胞原因：,将目的基因导入微生物细胞,3.,转化方法：,大肠杆菌,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,1.,常用菌：,感受态大肠杆菌细胞,Ca,2+,处理,大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收,DNA,不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。,DNA,分子导入受体细胞后就说明目的基因完成了表达吗？,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,(,四,),目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,分子,检测,个体,鉴定：,检测转基因生物染色体的,DNA,上,是否插入了目的基因,检测目的基因,是否转录出了,mRNA,检测目的基因,是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA,分子杂交,分子杂交,抗原,-,抗体杂交,DNA,附着在膜上,硝化纤维素,加探针,含荧光素分子,变性,DNA,杂交,（如检测,SARS,病毒等）,a,b,c,d,如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因或目的基因已经转录。,无表达产物,无表达产物,有表达产物,无表达产物,细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。,基因工程的基本操作程序,获取目的基因,从基因文库,利用,PCR,化学方法人工合成,构建基因表达载体,目的基因、启动子、终止子、标记基因,将目的基因导入受体细胞,农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法,目的基因的检测与鉴定,检测：是否插入、转录、翻译、个体水平鉴定,思考：,1.,作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如,启动子、终止子和标记基因,等。必须构建上述元件的主要理由是：,（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；,（2）通过,cDNA,文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；,（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；,（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；,（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,2.,根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?,要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；,要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的,Vir,区（诱导）的基因，使,T-DNA,转移并插入到染色体,DNA,上。,酚类化合物,3.,利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些,糖链是在内质网和高尔基,复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是,不可能的,。,（1）从小鼠中克隆出,-,珠蛋白基因的编码,序列,（,cDNA）。,（2）,将,cDNA,前接上在大肠杆菌中可以适用的,启动子,，另外加上,抗四环素的基因,，构建成一个,表达载体,。,（3）将表达载体,导入无四环素抗性的大肠杆菌中,，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明,-,珠蛋白基因已进入其中。,（4）,培养,进入了,-,珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，,破碎后从中提取,-,珠蛋白。,4.-,珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的,-,珠蛋白，想一想，应如何进行设计？,1.,下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容，正确的组合是,2,、下列属于获取目的基因的方法的是,(),利用,mRNA,反转录形成从基因组文库中提取,从受体细胞中提取 利用,PCR,技术,利用,DNA,转录 人工合成,A.B.C.D.,3.,细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是,A,提高受体细胞在自然环境中的耐药性,B,有利于对目的基因是否导入进行检测,C,增加质粒分子的分子量,D,便于与外源基因连接,4.,有关基因工程的叙述正确的是,A,限制酶只在获得目的基因时才用,B,重组质粒的形成是在细胞内完成的,C,质粒都可作为运载体,D,蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,