基因工程和基因组学.ppt

<p>,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二层,第三层,第四层,第五层,*,*,/74,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二层,第三层,第四层,第五层,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二层,第三层,第四层,第五层,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二层,第三层,第四层,第五层,*,/74,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二层,第三层,第四层,第五层,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程和基因组学,第一节 基因工程,(Genetic Engineering),基因工程概述,限制性内切核酸酶,载体,基因的分离与鉴定,基因工程的应用,2,基因工程概述,遗传工程,广义,狭义：,细胞工程、,染色体工程、,细胞器工程等,基因工程,3,1,、,概念,：,是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。,基因工程概述,也称为,DNA,重组技术,(,DNA Recombination,),、,或分子克隆,(Molecular cloning),4,基因工程的基本操作程序包括：,(1),目的基因的分离或合成；,(2),用工具酶对目的基因和载体（,Vector,）进行加工,处理，把目的基因与载体结合成重组,DNA,分子；,(3),把重组,DNA,分子引入受体细胞，并使目的基因和,载体上其他基因得以表达；,（,4,）转化体细胞的扩增；,（,5,）重组体细胞的鉴定与筛选。,5,2,、,诞生,：,19,71,年，美国,Smith,H.O.,等分离出一种,限制性酶，可酶切病毒的,DNA,分子；,1972,年：,erg,P.,等 实现不同酶切,DNA,片,段的体外连接；,1973,年：,Cohen,s.,等将体外重组的,DNA,转入,大肠杆菌细胞并得以表达。,基因工程概述,6,1973 Cohen,第一例成功的克隆实验,1978 Genentech,公司 人胰岛素 世界上第一种基因工程蛋白,药物,1982,第一个基因工程药物,-,重组人胰岛素在英、美获准使用,第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基因鱼,1993,基因工程西红柿在美国上市,1997,英国罗斯林研究所 多莉羊,1999.9,中国获准加入人类基因组计划,.,负责测定人类基因组全,部序列的,1%,2000.6.26,科学家公布人类基因组工作草图,2001.2.11,公布人类基因组基本信息,生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程,7,DNA分子得以复制、扩增、表达。,人类基因组计划(human genome project，HGP)：,例如，利用转基因羊大量表达人类的抗胰蛋白酶。,此法已广泛用于转化水稻、小麦、玉米、大豆等主要作物。,如果将外源基因连到复制子上，外源基因则可作为复制子的一部分进行复制。,能识别一段特异的DNA序列，准确地酶切双链DNA,第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基因鱼,养板上生存并且形成菌落。,培养转化细胞，以扩增DNA重,1997 英国罗斯林研究所 多莉羊,2 目的基因和载体的连接,用特异的引物，通过聚合酶链式反应来扩增目的基因。,、,基本过程,：,基因工程概述,从供体细胞中分离出目的基因；,(,简称“切”,),用,DNA,连接酶将含有外源基因的,DNA,片断接到载体上，形成,DNA,重组分子,(,“,接”,),；,借助细胞转化手段将,DNA,重组分子导入受体细胞,(,“,转”,),；,8,、,基本过程,：,基因工程概述,培养转化细胞,，,以扩增,DNA,重,组分子,，,使其整合到受体细胞,的基因组中,（,“增”,）；,鉴定转化细胞，获得外源基因,高效表达的细胞,（,“检”,）；,由此可见,，,基因工程的操作过程可简化为,：,“,切,、,接,、,转,、,增,、,检,”,9,基因克隆示意图,10,二 限制性内切核酸酶,限制性内切核酸酶或限制性酶,：,(restriction enzymes),在细菌中此酶的功能是降解外来,DNA,分子,，,以限制,(restriction),或阻止病毒侵染。,该类能识别双链,DNA,分子中一段特异的核苷,酸序列，并将,双链,DNA,分子,切断,。,11,工具酶,常用的工具酶,限制性核酸内切酶,切割,DNA,DNA,连接酶,生成,3-5,磷酸二酯键,DNA,聚合酶,探针标记、补平,3,末端,反转录酶,cDNA,合成,多聚核苷酸激酶,5,磷酸化、探针标记,末端转移酶,3,末端多聚尾,碱性磷酸酶,切除末端磷酸基,12,1,限制性内切核酸酶,限制性酶据其作用特点，可分为两类。,第,类限制性酶：,每隔一段,DNA,序列随机切割双链,DNA,分子，没有序列特异性。,第,类限制性酶：,能识别一段特异的,DNA,序列,，,准确地酶切双链,DNA,的特异序列。,其识别的序列是对称的，即在一条链中从,5,到,3,方向的序列，与其互补链从,5,到,3,方向的序列完全相同。这种序列称为,回纹对称序列,(palindrome),。,13,14,15,16,17,2 DNA,聚合酶,DNA,聚合酶的主要作用是在体外大量合成目的基因,18,3,、,DNA,连接酶,在大肠杆菌和动物细胞中都发现了,DNA,连接酶，这种酶能够催化,DNA,中相邻的,3,一,OH,和,5,一磷酸基末端之间形成磷酸二酯键。,4,、逆转录酶,RNA DNA,19,三 载体,一个,DNA,片段只有与适合的载体,(vector)DNA,连接构成重组,DNA,后，在载体,DNA,的运载下，才可以高效率地进入宿主细胞,(host cell),，并在其中复制、扩增、克隆出多个拷贝。,可作为,DNA,载体的有质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体（,BAC,、,YAC,）等。,20,三 载体,作为载体,DNA,分子,，,需具备四个条件,：,具复制原点,(ori),，,能携带的外源,DNA,片段独立地自我复制；,具有多克隆位点,，即具有多种限制性酶的,切点,，,用于克隆外源,DNA,片段；,至少具有一个选择标记基因,；,易从宿主细胞中回收,。,21,1.,细菌质粒,质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的,、,能自我复制,、,易分离,和,导入的环状双链,DNA,分子,。,这些质粒的适应范围广，拷贝数多。进入宿主细胞复制后，每个细胞的质粒拷贝数可高达,1000,个。,22,2.,噬菌体,23,3.,柯斯,质粒,24,4.,穿梭载体,25,5.,细菌人工染色体,26,6.,酵母人工染色体,27,7.Ti,质粒及其衍生载体,28,4.1,目的基因的获得,4.2,目的基因和载体的连接,4.3,重组,DNA,导入受体菌,4.4,筛选转化子,4.5,克隆基因的表达,4,重组,DNA,技术基本原理,29,4.1,目的基因的获取,目的基因的获取大概有以下途径：,1,化学合成法,如已知目的基因的核酸序列，则可以利用化学合成,法进行人工合成。,2,基因组,DNA,可以从基因文库中筛选出目的基因。,30,3 cDNA,法,通过提取,mRNA,，然后进行反转录得到目的基因。,4 PCR,法,用特异的引物，通过聚合酶链式反应来扩增目的基因。,31,PCR,的基本原理,变性、复性、半保留复制,PCR,三步曲,变性,90,97,退火,45,55,延伸,72,左右,32,P C R,操作流程,90,0,C,50,0,C,70,0,C,33,PCR,的三个步骤为一次循环，约需,5,10,分钟。每经一次循环，所找到的目的基因扩充一倍。经过,20,次循环，即可扩增,10,6,倍，总共只需,几个小时,。,34,4.2,目的基因和载体的连接,外源基因离开染色体是不能复制的。如果将外源基因连到复制子上，外源基因则可作为复制子的一部分进行复制。这种复制子就是载体。,载体可分为复制载体和表达载体。,表达载体是将外源基因在寄主细胞内表达成蛋白质的载体。,作为表达载体必须具有强的启动子和终止子，而且启动子必须是受控制的，所产生的,mRNA,必须具有翻译的起始信号。,35,选择了载体后，就要将载体和目的基因在体外进行连接，即,DNA,的体外重组。,DNA,的体外重组是依靠连接酶在体外将连接。,36,4.3,重组,DNA,导入受体菌,外源,DNA,与载体在体外连接成重组的,DNA,分子后，,需要将其导入受体菌。随着受体菌生长、增殖，重组,DNA,分子得以复制、扩增、表达。,在选择了适当的受体菌后，经过特殊的方法处理后，使之,成为感受态细胞，具备接纳外源,DNA,的能力。,感受态的细胞制备有氯化钙法、电击发等。,37,38,4.4,重组体的筛选,筛选就是将众多的转化菌落和菌斑区分开来，并鉴定,那一个菌落或菌斑所含的重组,DNA,带有目的基因。,39,筛选的方法有以下种：,40,常用的方法有以下几种：,1,遗传检测法：,如果载体携带有某些抗药性标志基因，转化后，只有含,有这种抗药基因的转化子细菌才能在含有该抗生素的培,养板上生存并且形成菌落。,抗药性：,以上两种方法仅仅是初步筛选。,插入失活：,载体一般含有多克隆位点，在没有外源,DNA,插入时该基因可正确表达，当外源基因插入时该基因就不能正确表达。这就是插入失活。,41,2,重组质粒的快速提取和酶切鉴定,3 PCR,法,如果质粒中重组有外源基因，则可以先快速提取少量质粒,进行酶切，然后通过电泳法检查是否含有目的基因片段。,可提取质粒，用特异的引物进行扩增，如能扩增出目的基因,片段，则证明目的基因已重组入质粒。,42,4.5,克隆基因的表达,重组,DNA,技术的目的是为了扩增目的基因并且使目的基因,表达，实现生命科学研究、医药或商业目的。,克隆基因在受体细胞表达或大量生产涉及正确的基因,转录、,mRNA,的翻译以及后加工等问题。这些过程的,进行在不同的表达体系是不一样的，这些差别不但与,基因的来源、性质有关，而且与载体和表达体系有关。,43,常用的表达体系有原核表达体系和真核表达体系。,大肠杆菌是当前采用最多的原核表达体系。,真核表达体系有酵母、昆虫、哺乳动物细胞等。,44,45,46,47,48,可作为DNA载体的有质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体（BAC、YAC）等。,是认识基因组的结构、功能及进化，弄清基因组包含的全部遗传信息及相互关系，为最终充分合理利用各种有效资源，预防和治疗人类遗传疾病提供科学依据。,如已知目的基因的核酸序列，则可以利用化学合成,生成3-5磷酸二酯键,段的体外连接；,可以从基因文库中筛选出目的基因。,11 公布人类基因组基本信息,可利用家禽作为生物反应器，生产人类大量需要的,可利用家禽作为生物反应器，生产人类大量需要的,酸序列，并将双链DNA分子切断。,的基因组中（“增”）；,1972年：erg,P.,至少具有一个选择标记基因；,在细菌中此酶的功能是降解外来DNA分子，,作为载体DNA分子，需具备四个条件：,(1)DNA微列阵(DNA microarrays),基因工程的基本操作程序包括：,49,五,基因工程,的应用,(,一,),基因工程工业,(,二,),植物基因工程,(,三,),转基因动物,(,四,),遗传疾病诊断,50,(,一,),基因工程药物,胰岛素的人工生产,51,(,二,),植物基因工程,根癌农杆菌介导的植物转化,植物基因转化：是指将外源基因转移到植物细胞内、并整合到植物基因组中稳定遗传和表达的过程。,根癌农杆菌介导的植物转化,52,2.,基因枪转化技术,通过高压气体等动力,，,高速发射包裹有重组,DNA,的金属颗粒,，,将目的基因直接导入受体细胞,，,并整合到染色体上的方法,。,此法已广泛用于转化水稻、小麦、玉米、大豆等主要作物。,53,(,三,),转基因动物,与转基因植物相比,，,转基因动物的发展要慢些,。,例如，利用转基因羊大量表达人类的抗胰蛋白酶。,将人的抗胰蛋白酶,-1,基因克隆在羊奶产生相关基因,启动子的下游，这种启动子仅在乳腺细胞中表达，使,羊奶中含有大量有功能的人类抗胰蛋白酶；,可利用家禽作为,生物反应器,，生产人类大量需要的,重要蛋白质。,大象的生长基因转到猪身上,54,(,四,),遗传疾病诊断,55,(,五,),基因治疗,利用基因工程技术，将特异基因导入并整合到具有遗传缺陷的患者的基因组中，以治疗遗传疾病的方法，通常叫做基因治疗,(gene therapy),。,目前最常用的方法是利用病毒,DNA,作载体，构建重组,DNA,分子，用病毒包装物包装后形成的重组去毒病毒感染患者的细胞，将正常基因整合到染色体上。,56,第二节 基因组学,基因组学,(genomics),：,是遗传学研究进入分子水平后发展起来的一个分支，,主要研究生物体全基因组,(genome),的分子特征。,特点：是以,基因组,为研究单位，而不是以单个基因,，,目标,：,是认识基因组的结构、功能及进化，弄清基因组包含的全部遗传信息及相互关系，为最终充分合理利用各种有效资源，预防和治疗人类遗传疾病提供科学依据。,57,58,构建基因组的遗传图谱,(genetic map),；,构建基因组的物理图谱,(physical map),；,测定基因组,DNA,的全部序列；,构建基因组的转录本图谱,；,分析基因组的功能。,基因组学的重要组成部分是,基因组计划,(genome project),，,大体上可分为：,59,人类基因组计划,(,human genome project,，,HGP),：,水稻基因组计划,(rice genome project,，,RGP),模式生物基因组计划：,如酵母、线虫、果蝇、小鼠、家猪、拟南芥,60,一 基因组图谱的构建,鸟枪射击法,(shotgun),基因组序列测定,61,遗传图谱的构建,物理图谱的构建,一 基因组图谱的构建,62,(,一,),遗传图谱的构建,图谱标记,图谱构建中需要可以鉴别的标记,(marker),，在构建遗传图谱中，可用基因和,DNA,作为标记。,(1),基因标记,(2)DNA,标记,63,(,二,),物理图谱的构建,64,65,拟南芥,66,人类部分染色体物理图谱,67,E.coli,物理图谱,68,二 基因组图谱的应用,基因定位,基因组比较分析,标记辅助选择,(marker-assisted selection,，,MAS),基因的克隆与分离,69,三 后基因组学,后基因组学,(post-genomics),：,是在完成基因组图谱构建以及全部序列测定的基础,上，进一步研究全基因组的基因功能、基因之间的相互关系和调控机制为主要内容的学科。,后基因组学主要利用,DNA,微列阵技术、蛋白质组学,、,酵母菌双杂交系统以及生物信息学等技术相结合，,对已知的基因组序列进行研究。,70,(1)DNA,微列阵,(DNA microarrays),是利用,DNA,芯片技术，同时进行大量分子杂交，以分析比较不同组织或器官的基因表达水平，筛选突变基因，从核酸水平分析基因表达模式。这是后基因组学研究中的重要方法之一。,三 后基因组学,71,基因芯片发展历史,Southern&amp;Northern,Blot,Dot,Blot,Macroarray,Microarray,72,感谢观看,</p>