微生物的遗传和变异-第三节.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二节 细菌基因转移的方式,细菌的三种水平基因转移形式,接合,转导,转化,p.237,接合(conjugation)：,细胞与细胞的直接接触（由F因子介导）,转导(transduction)：,由噬菌体作为载体介导,转化(transformation)：,游离DNA分子+感受态细胞,一 细菌的接合作用(conjugation),接合作用：通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息转移和重组过程,F因子的四种细胞形式,a）,F,-,菌株，不含F因子，没有性菌毛,，但可以通过 接合作用接收F因子而变成雄性菌株（F,+,）；,b）,F,+,菌株，F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。,c）,Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上,，细胞表面有性菌毛。,d）,F菌株，,Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子,，特称为F因 子。细胞表面同样有性菌毛。,1）F,+,F,-,杂交,杂交的结果：,供体细胞和受体细胞均成为F,+,细胞,F,+,菌株的F因子向F,-,细胞转移，但含F因子的宿主细胞,的染色体DNA一般不被转移。,Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移转移,过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F,-,细胞并发生重组,，由此而得名,为高频重组菌株,（High frequency of recombination）,。,2）Hfr,F,-,杂交,Hfr菌株仍然保持着F,+,细胞的特征，具有F性菌毛，并象F,+,一样与F,-,细胞进行接合。所不同的是在发生转移时，由于 F因子除先导区(leading region)以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，因此 F因子的转移是先导区结合着染色体DNA向受体细胞转移的。由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中，故HfrF,-,杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是F,-,。,染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会,就越多，在F,-,中出现重组子的的时间就越早，频率也高。,F因子不易转入受体细胞中，故HfrF,-,杂交后的受体细胞（或称接合子）大多,数仍然是F,-,。,3）FF,-,杂交,Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，,形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，,特称为F因子。,FF,-,与F,+,F,-,的不同：,给体的,部分染色体基因随F一起转入受体细胞,a）与染色体发生重组；,b）继续存在于F因子上，,形成一种部分二倍体；,细胞基因的这种转移过程又常称为性导（sexduction）、F因子转导,（F-duction），或F因子媒介的转导（F-mediated transduction）。,二 细菌的转导（transduction）,由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式：,一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中,能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA,带到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体,细菌转导的二种类型：,普遍性转导,局限性转导,1 普遍性转导（generalized transduction）,噬菌体可以转导,供体细菌染色体的任何部分,到,受体细胞中的转导过程,1951年，Joshua Lederberg和Norton Zinder,为了证实大肠杆菌以外,的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型,的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验：,用“U”型管进行同样的实验时，在给体和受体细胞,不接触的情况下，同样出现原养型细菌！,沙门氏菌LT22A是携带P22噬菌体的溶源性细菌,另,一株是非溶源性细菌,一个表面看起来的常规研究却导致,一个惊奇和十分重要发现的重要例证！,基因的传递很可能是由可透过“U”型管滤板的,P22噬菌体介导的,（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）,普遍性转导过程,2 局限性转导（specialized transduction）,把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中的过程,温和噬菌体感染,整合到细菌染色体的特定位点上,宿主细胞发生溶源化,溶源菌因诱导而发生裂解时，,在前噬菌体二侧的少数宿主,基因因偶尔发生的不正常切,割而连在噬菌体DNA上,部分缺陷的温和噬菌体,把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中的过程,温和噬菌体,裂解时的,不正常切割：包含gal或bio基因,（几率一般仅有10,-6,）,缺陷噬菌体在宿主细胞内能够象正常的DNA分子一样进行复制、,包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒。,但没有正常噬菌体的,溶源性和增殖能力,，感染受体细胞后，通过,DNA整合进宿主染色体而形成稳定的转导子。,3 局限性转导与普遍性转导的主要区别：,a）普遍性转导是误包；局限性转导是误切。,b）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因,导入受体，故称为局限性转导。而普遍性转导携带的宿主基,因具有随机性，包装的可能全部是宿主菌的基因。,三 细菌的遗传转化（genetic transformation）,定义：,游离DNA分子(质粒和染色体DNA)被自然或人工感受态细胞摄取，并得到表达的基因转移过程。,1、转化,1928年，Griffith发现肺炎链球菌（,Streptococcus pneumoniae,）,的转化现象,目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力,进行转化，需要二方面必要的条件：,受体细胞处于感受态：,最容易接受外源DNA的一种生理状态。,转化因子：外源游离dsDNA分子,以革兰氏阳性的肺炎链球菌为材料，其转化过程大体是：,1、双链DNA片段与感受态受体菌的细胞表面特定位点结合。,2、在位点上的DNA发生酶促分解，形成平均分子量为（45),x,10,6,D的DNA片段。,3、DNA双链中的一条单链逐步降解，同时，另一条单链逐步进入细胞。,4、转化DNA单链与受体菌染色体组上的同源区段配对，接着受体染色体组的相应单链片段被切除，并被外来的单链DNA所交换和取代，于是形成了杂种DNA区段。,5、受体菌染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一类似供体菌，另一类似受体菌。当细胞分裂后，此染色体分离形成了一个转化子。,转化全过程,转化整合过程,转化过程的特点：,a）对核酸酶敏感；,c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于,转化（DNA）给体菌株和转化受体菌株之间的,亲源关系；,d）通常情况下质粒的自然转化效率低,b）不需要活的DNA供体细胞；,人工转化,用CaCl,2,处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。,在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是,基因工程的奠基石和基础技术,该过程与细菌自身的遗传控制无关.,用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一,种可以摄取外源DNA的,“人工感受态”。,接合(conjugation)：,细胞与细胞的直接接触（由F因子介导）,转导(transduction)：,由噬菌体介导,自然遗传转化(natural genetic transformation)：,游离DNA分子+感受态细胞,第三节,基因克隆及重组DNA技术,利用DNA体外重组技术，将一个特定的基因或,DNA序列插入一个载体DNA分子上，导入宿主,细胞内，使其扩增和表达。,基因克隆,是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到的或,合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，,使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生,物表现出新的性状。,基因工程（genetic engineering）或,重组DNA技术(recombinant DNA technology),二十世纪生物科学具有划时代意义的巨大事件，推动了,生物科学的迅猛发展，并带动了生物技术产业的兴起。,微生物在基因工程的兴起和发展过程中起着,不可替代的作用！,“微生物与基因工程”,一、基因工程的基本过程,1.基因分离：,a）分别提取供体DNA和载体DNA,2.体外重组,b）用专一性很强的限制性核酸内切酶分别切割供体和载体DNA,在DNA连接酶的作用下使具有相同粘性末端的供体DNA片段和,载体连接，成为重组载体。,3.重组载体的传递与筛选,用人工转化的方法将重组载体导入受体细胞中，并通过一定,的筛选标记筛选得到含有目的外源片段的重组子.,4.在特定的宿主中表达,得到基因工程产品,大肠杆菌生产胰岛素,假单胞菌生产毒素蛋白,二、基因工程的发展历史,对基因工程的建立与发展具有重要意义的几项关键技术：,DNA的特异切割,DNA的分子克隆（人工转化方法的建立）,DNA的快速测序,聚合酶链式反应（PCR）（DNA的体外扩增）,DNA合成技术,DNA的定点诱变技术,基因工程工具酶,基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不同微生物,中分离和纯化而获得的,一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）,能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割,DNA的一类内切酶。简称为限制性酶（restrition enzyme）。,在细菌细胞内限制性酶与DNA甲基化酶共同构成细菌的,限制修饰系统,，利用限制酶降解进入细胞内的外源DNA，,同时用甲基化酶修饰细菌本身DNA，以避免被酶降解。,限制性内切酶,I型：单一多功能(限制-修饰)的酶，不是特异性的切割，所以用处不大。III型：双功能的酶，特异性的切割，用处不大。,II型,：,分开的核酸内切酶和甲基化酶(,Eco,RI,M,Eco,RI,)。特异性的切割，十分有用。识别序列通常由4-8个碱基对组成，具有回文结构。,Eco,RI,:,E,scherichia,co,li,R,Y13,识别序列:G,AATT,C,C,TTAA,G,Bam,HI:,B,acillus,am,yloliquefaciens,H,识别序列:G,GATC,C,C,CTAG,G,限制性内切酶的剪切方式,常用限制性内切酶,酶连,DNA连接酶(1967,许多实验室同时发现)的发现和应用对于重组DNA技术的创立和发展也具有头等重要的意义。将两段DNA拼接起来的酶叫连接酶，目前已知有三种方法可以用来在体外连接DNA片段：,第一种,：粘性末端连接；,第二种,：平端连接；,第三种,：先在DNA末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端，再进行连接。,T4噬菌体DNA连接酶,：,它催化DNA 的5磷酸基与3羟基之间形成磷酸二酯键（Weiss等，1968）,转化,重组质粒DNA进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。,感受态细胞的转化,电穿孔转化,抗生素筛选,能够把脱氧核糖核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3-OH 末端,催化核苷酸的聚合作用,而不发生从引物模板上解离的情况.,常见的DNA聚合酶：最常用的依赖于DNA的DNA聚合酶是,大肠杆菌DNA聚合酶I,（全酶）（DNA聚合酶；5-3外切核酸酶；3-5外切核酸酶）;,大肠杆菌DNA聚合酶I的,Klenow片段,，（没有5-3外切核酸酶的活性）；,Taq,DNA聚合酶,(,Thermus aquaticus,;1976;Chien),能耐高温；,pf,u,DNA聚合酶,(,Pyrococcus furiosus,),高保真性。,DNA聚合酶,DNA扩增,PCR反应,PCR的基本反应体系,（以DNA为模板的反应：,10缓冲液 10,l,4种dNTP混合物,各200,mol/L,引物,各10100 pmol,模板DNA,0.12,g,Taq DNA聚合酶,2.5 u,Mg,2+,1.5 mmol/L加双或三蒸水至 100,l,Taq,DNA聚合酶,来自水生栖热菌,Thermus aquaticus,良好的耐热性,Mg,2+,依赖性,无校正功能,Pfu,DNA聚合酶,来自,Pyrococcus furiosus,(激烈火球菌“,Pfu,”),纠错功能，高保真性,基因工程的常用载体：,质粒载体,噬菌体载体,柯斯质粒载体,M13噬菌体载体,真核细胞的克隆载体,人工染色体,噬菌粒载体,一、质粒克隆载体,a）低分子量有利于DNA的分离和操作；,特点：,b）具有较高拷贝数；,c）易于导入细胞；,d）具有安全性；,质粒载体克隆外源DNA片段的大小一般不超过15Kb,二、噬菌体克隆载体,将野生型噬菌体DNA进行改造后建成，主要是去掉噬菌体,DNA上过多的常用限制酶的酶切位点，及对非必要基因区域,进行改造。,特点：,1）它的分子遗传学背景十分清楚,2）噬菌体载体的容量较大。一般质粒载体只能容纳10多个kb。,而噬菌体载体却能容纳大约23kb的外源DNA片段。,3）具有较高的感染效率。其感染宿主细胞的效率几乎可达100，,而质粒DNA的转化率却只有0.1。,4）和质粒相比，噬菌体具有更为狭窄的寄主范围，因此更加安全,经过体外基因操作和包装后形成重组,噬菌体，可以通过正常的感染途径进,入宿主细胞；,重组噬菌体DNA也可不经过体外包装,而直接通过转染（转化）方式进入宿,主细胞；,质粒和噬菌体载体都可用于,构建基因文库；,但后者更有优势：,容纳的外源DNA片段较大；,以感染途径进入宿主细胞的,效率比转化高；,三、柯斯质粒载体,柯斯质粒载体,（cosmid vector），,又称粘粒，是由,噬菌体的粘性末端,和质粒构建而成。,Cosmid,(cos site-carrying plasmid),带有粘性末端位点(cos),的质粒,特点：,1）具有噬菌体的特性：,在克隆了外源片段后可在体外被包装成,噬菌体颗粒，高效地感染对噬菌体敏感的大肠杆菌细胞。进,入寄主的柯斯质粒DNA分子，按照噬菌体DNA的方式环化，,但无法按噬菌体的方式生活，更无法形成子代噬菌体颗粒。,2）具有质粒载体的特性,：,在寄主细胞内如质粒一样进行复制，携,带有抗性基因和克隆位点，并具氯霉素扩增效应。,3）具有高容量的克隆能力：,柯斯质粒本身一般只有57kb左右，,而它克隆外源DNA片段的极限值竟高达45kb.,柯斯质粒用于克隆大片段的DNA分子特别有效，而,这种特性对于研究高等生物的基因组十分重要。,四、微生物作为克隆载体的宿主,一、宿主的基本要求与性质,能够高效吸收外源DNA；,具有使外源DNA进行高效复制的酶系统；,不具有限制修饰系统；,不具有DNA重组系统，常用重组缺陷型（RecA,-,）；,便于进行基因操作、筛选和大量繁殖；,具有安全性。宿主细胞应该对人、畜、农作物无害或无致病性等。,二、常用的基因工程宿主,1）大肠杆菌,3）酿酒酵母,2）枯草芽孢杆菌,特点：生长迅速、极易培养、能在廉价培养基中,生长，遗传学及分子生物学背景十分清楚,4）动物细胞,第四节 菌种的复壮及保藏,一.菌种的衰退与复壮,1.衰退（degeneration）：,菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。,衰退的原因：基因突变，分离现象。,常见的衰退现象：,菌落和细胞形态的改变；,生长速度缓慢，产孢子越来越少；,抵抗力、抗不良环境能力减弱等。,代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降；,P.252,2.菌种的复壮（rejuvenation）,：,衰退的菌种恢复原来优良性状。,菌种的复壮措施：,纯种分离：,（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等,）。通过寄主体内生长进行复壮,（如,Bacillus thuringiensis,的复壮）,；淘汰已衰退的个体,（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。,采用有效的菌种保藏方法。,3.防止菌种衰退的方法：,控制传代次数,（一般在DNA的复制过程中，碱基的错配率是5x10,-4,，自发突变的频率为10,-8,-10,-9,，采用良好的菌种保藏方法，可以减少移种和传代的数）,；,选择合适的培养条件；采用不同类型的细胞进行传代,（对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种）,；采用有效的菌种保藏方法。,5.2、菌种保藏：,(1)目的：存活，不丢失，不污染 防止优良性状丧失 随时为生产、科研提供优良菌种(2)原理：选用优良的纯种，（最好是休眠体，如分生孢子、芽孢等），创造降低微生物代谢活动强度，生长繁殖受抑制，难以发生突变的环境条件。（其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养 以及添加保护剂等）,菌,连续在培养基上（内）移种,种,生活态 传代培养保藏法,连续在活宿主上（内）移种,保,固体斜面,藏,湿法 半固体琼脂柱,方,休眠态 液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）,法,干法 藏在玻璃管内,吸附在合适的载体上,(3)菌种保藏的方法,几种常用菌种保藏方法的比较,方法名称,主要措施,适宜菌种,保藏期,评价,冰箱保藏法（斜面）,冰箱保藏法（半固体）,石蜡油封藏法*,沙土保藏法,冷冻干燥法,低温,低温,低温、缺氧,干燥、无营养,干燥、无氧、低温、有保护剂,各大类,细菌、酵母菌,各大类*,产孢子微生物,各大类,36月,612月,12年,110年,515年以上,简便,简便,简便,简便有效,简便有效,*一般斜面或半固体穿刺，4,*石油微生物除外,