微生物的遗传育种(201605).ppt

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Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,Edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,单击此处编辑母版标题样式,Edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,单击此处编辑母版标题样式,Edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,单击此处编辑母版标题样式,Edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,单击此处编辑母版标题样式,Edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,单击此处编辑母版标题样式,Edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,单击此处编辑母版标题样式,Edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,单击此处编辑母版标题样式,Edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,单击此处编辑母版标题样式,Edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,单击此处编辑母版标题样式,Edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,单击此处编辑母版标题样式,Edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,亲代与子代相似,遗传,：,变异,：,亲代与子代、子代间不同个体不完全相同,遗传（,inheritance）,和变异（,variation）,是生命的最本质特性之一,一、几个基本概念,遗传,(,heredity),：,生物的上一代将自己的一整套,遗传因子,传递给下一代的,行为或功能,，具有极其,稳定（保守）,的特性。,遗传型（或基因型）(,genotype),：,某一生物个体所含有的全部遗传因子即,基因组所携带的遗传信息,。,生物所携带的全部遗传因子或者基因的总称,表型,(,phenotype),：,某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和，是,遗传型在合适环境下通过代谢和发育而得到的具体表现,。,遗传型（可能性）+环境条件 表型（现实性）,表型是由遗传型所决定，但也和环境有关,微生物是遗传学研究中的明星,微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，,方便建立纯系；,很多常见微生物都易于人工培养，快速、大,量生长繁殖，易于积累不同的代谢产物和中,间代谢物，菌落形态具有可见性与多样性；,物种和代谢类型多样；,对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，,操作性强。,二、遗传变异的物质基础,三个经典实验,肺炎链球菌的转化实验,噬菌体的感染实验,植物病毒的重建实验,1、Discovery of bacterial transformation（,转化）,1928，,Fred Griffith,，（格里菲斯,),discovered the phenomenon of transformation in,Streptococcus pneumoniae,（,肺炎链球菌）,实验材料：肺炎,链,球菌,光滑型（,S,）,粗糙型（,R,）,有 荚 膜,菌落光滑,分泌毒素,致 病,无 荚 膜,菌落粗糙,无 毒,不 致 病,S,S,S,三个血清型,R,R,R,三个血清型,R,型活菌,S,型活菌,加热杀死,S,型菌,动物实验,R,型活菌,+,加热杀死,S,型,+,？,活的无毒（,R,）型细菌受到了死的有毒（,S,）型细菌的影响，转化为有毒（,S,）型,Discovery of DNA as genetic material,细菌培养试验,热死,S,菌 培养皿培养 不生长,活,R,菌 培养皿培养 长出,R,菌,热死,S,菌,+,活,R,菌 培养皿培养 长出大量,R,菌及,10,-6,S,菌,S,型菌的无细胞抽提液试验,活,R,菌,+S,菌无细胞抽提液 培养皿培养 长出大量,R,菌和少量,S,菌,以上实验说明：加热杀死的,S,III,型细菌细胞内可能存在一种,转化物质,，它能通过,某种方式,进入,R,II,型细胞并使,R,II,型细胞获得稳定的,遗传性状,，转变为,S,III,型细胞。,1944年，,Avery,精确重复了转化实验，确定了转化因子,实验证明，将,R,菌转化为,S,菌的转化因子是,DNA,2,、,T2,噬菌体感染实验,1952,年,Hershey,和,Chase,用,32,P,标记,DNA,，用,35,S,标记蛋白。,实验证明，进入细菌细胞内部的物质是,DNA,。,DNA,包含有产生完整噬菌体的,全部信息,。,植物病毒蛋白质和,RNA,可以人为地分开,同时又可把它们重新组合成具感染性的病毒,3,、植物病毒的重建实验,TMV,HRV,HRV,TMV,原始株 拆开 重建 感染 分离纯化,植物病毒的重建实验,TMV:,烟草花叶病毒,;HRV:,霍氏车前花叶病毒,1,2,二、遗传物质在微生物细胞内存在方式,(189),1,、,细胞水平,2,、,细胞核水平,3,、,染色体水平,4,、,核酸水平,5,、,基因水平,6,、,密码子水平,7,、,核苷酸水平,1,、细胞水平,真核微生物：细胞核,原核微生物：核区,细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的,2,、细胞核水平,真核与原核，被称为核基因组、核染色体或基因组。多数存在核外,DNA,含量少、能自主复制的核外染色体,质粒。,3,、染色体水平,（,1,）染色体是由组蛋白与,DNA,构成的线状结构,（,2,）染色体的数目在不同的生物中是不同的,（,3,）染色体的倍数在同一生物的不同生活时期是不同的,，,染色体倍数：指同一细胞中相同染色体的套数。,4,、核酸水平,核酸种类：,DNA,，,RNA,核酸结构：双链、单链；,环状，线状，超螺旋状,DNA,长度：因种而异（,bp,、,kb,、,Mb),微生物基因组测序工作是在人类基因组计划的促进下开,始的，最开始是作为模式生物，后来不断发展，已成为,研究微生物学的最有力的手段。,5,、基因水平,1、基因概念,基因,是一个含有特定遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。,2、种类,(1)结构基因和调节基因：编码蛋白质的基因,结构基因各种结构蛋白和催化各种生化反应的酶；,调节基因阻遏蛋白或激活蛋白。,(2)核糖体,RNA,基因(,rDNA),与转译,RNA,基因(,tDNA)：,无翻译产物的基因,(3)启动子与操纵基因：不转录的,DNA,区段,6,、密码子水平,遗传密码,是指,DNA,链上决定各具体氨基酸的特定核苷酸排列顺序。遗传密码的信息单位是,密码子,。每一密码子由,3,个核苷酸序列，即,1,个三联体组成。,7,、核苷酸水平,核苷酸是最小突变单位和交换单位,27,细胞核、染色体、染色质、,DNA,、碱基对,三、基因突变（,Gene mutation）,基因突变（突变）,：细胞内（或病毒体内）,遗传物质,的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化。,狭义的突变,：专指,基因突变,（点突变）。,广义的突变,：包括,基因突变,和,染色体突变,。,突变概率一般为,10,-9,10,-6,野生型菌株,（,wild type strain,，野生型）：从自然界分离到的、没有发生过突变的菌株。,突变株,（,mutant,，突变体、突变型）：野生型经突变后形成的带有新性状的菌株。,突变率,：某一细胞（或病毒体）在,每一世代,中发生某一性状突变的几率,如突变率为,10,-8,，即该细胞发生,1,亿次分裂，发 生,1,次突变,某一单位群体在每一世代（分裂一次）中产生的突变株的数目,1x10,8,-2x10,8,1,、基因突变的特点,(P200),自发性：,突变可以在没有人为的诱变因素处理下自发产生。,稀有性：,突变率极低。,诱变性：,通过诱变剂的作用提高自发突变几率。,独立性：,突变的发生一般是独立的。,稳定性：,新的诱变性状是稳定的、可遗传的。,可逆性：,野生型基因,突变型基因,不对称性：,突变性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。,正向突变,回复突变,2,、基因突变的自发性与不对称性的证明,突变是通过适应而发生的，即各种抗性是由其环境（指其中所含的抵抗对象）诱发出来的，,突变的原因和突变的性状间,是,相对应,的，并认为这就是“定向变异”，也有人称它为“驯化”或“驯养”。,基因突变是,自发的,，且与环境是不相对称的。,变量试验,（,fluctuation test）,1943,年，,S.E.Luria,和,M.Delbrck,涂布试验,（,newcombe experiment）,1949,年，,Newcombe,平板影印培养试验,（,replica plating）,1952,年，,J.Lederberg,变量实验（,fluctuation analysis）,Salvador Luria and Max Delbruck（1943）,Salvador Luria,Max Delbruck,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969,Newcombe,的涂布实验（1949）,6,皿共,353,个,6,皿共,28,个,影印实验（,replica plating）,Joshua Lederberg and Esther Lederberg（1952）,Joshua Lederberg,J.Lederberg is awarded the Noble Prize in,Medicine and Physiology in 1958,营养缺陷型（,auxotroph,）,影印平板培养法：一种通过盖章的方式，使在一系列培养皿的相同位置能出现相同菌落的接种培养方法。,实验原理：,通过,盖印章,的方式，在,未接触抗性,因素的条件下筛选出的抗性突变株。由于实验过程中没有接触过抗性因素，所以直接证明了基因突变的,自发性,。,结果：,得到越来越多的抗性菌落，最终甚至可以得到纯的抗性菌株细胞群。,。,结论：基因突变的自发性。,3,、突变类型,选择性突变株,:,具有选择性标记，可通过某种环境条件使它们得到优势生长，从而取代原始菌株,条件致死突变型,(,conditional lethal mutant),抗性突变型,(,resistant mutant),营养缺陷型,(,auxotroph),非选择性突变株,:,无选择性标记，而只有一些性状的数量差别，如菌落大小、颜色深浅、代谢物产量等,形态突变型,(,morphological mutant),抗原突变型,(,antigenic mutant),产量突变型,(,producing mutant,),营养缺陷型（,auxotroph,）,表型判断的标准：,在基本培养基上能否生长,常见的微生物突变类型,一种缺乏合成其生存所必须的营养物,(,包括氨基酸、维生素、碱基等,),的突变型,只有从周围环境或培养基中获得这些营养或其前体物,(precursor),才能生长,.,在选择性培养基（一般为基本培养基）上不生长,负选择标记,突变株不能通过选择平板直接获得,营养缺陷型特点：,营养缺陷型的表示方法：,基因型：用,his,C,-,和,his,C,+,，分别表示缺陷型和野生型。,表型：第一个字母大写，且不用斜体：,HisC,抗药性突变型,基因突变,使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性。,表示方法：,所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“,r”,表示,str,r,和,str,s,分别表示对链霉素的抗性和敏感性,正选择标记,突变株可直接从,抗性平板,上获得在加有相应,抗生素,的 平板上,只有抗性突变能生长,.,所以很容易分离得到,.,条件致死突变型,特点：,负选择标记,这类突变型常被用来分离生长繁殖必需的突变基因,常用的条件致死突变是温度敏感突变，用,ts,表示，这类突变在高温下（如,42,）是致死的，但可以在低温（如,25-30,）下得到这种突变。,在某一条件下具,有致死,效应，而在另一条件下,没有致死,效应的突变型。,基因突变：一个基因内部,遗传结构或,DNA,序列,的任何改变,基因突变,是重要的生物学现象，它是一切生物变化的根源，连同,基因转移,、,重组,一起提供了推动,生物进化,的遗传多变性。,四、基因突变及其机制,环境因素的影响，,DNA,复制过程的偶然错误等而导致，一般频率较低，通常为10,-6,10,-9,。,某些物理、化学因素或生物因素对生物体的,DNA,进行直接作用，突变以较高的频率产生。,突变,自发突变,诱发突变,1,.自发突变,指生物体在无人工干预下自然发生的低频率突变。,引起自发突变的原因：,（1）由背景辐射和环境因素引起；,（2）由微生物自身有害代谢产物引起；,（3）由,DNA,复制过程中碱基配对错误引起。,自发突变频率约为,10,-6,。对细菌作一般液体培养，,因细胞浓度可达,10,8,/,mL,，,常会在其中产生自发突变,菌株。,2,、诱发突变（诱变）,指通过人为的方法，利用,物理、化学或生物,因素显著提高基因自发突变频率的手段,诱变剂：凡具有诱变效应的任何因素。,诱变剂的种类很多,，有物理因素（,UV、,激光、离子束、,X,射线、,射线、快中子）和化学因素（亚硝酸、氮芥、烷化剂、碱基类似物、吖啶类化合物）,（1）碱基的置换,点突变,一对,碱基,被另一对,碱基,置换。,1）转换,DNA,链中的,一个嘌呤,被,另一个嘌呤,（一个嘧啶被另一,个嘧啶）所置换。,2）颠换,DNA,链中的,一个嘌呤,被,另一个嘧啶,（一个嘧啶被另一,个嘌呤）所置换。,碱基置换的两种类型转换（实线，对角线）和颠换（虚线，纵横线）,（2）移码突变,造成突变点以后全部遗传密码转录与转释发生错误,ABC,ABC,ABC,ABC,ABC,ABC,ABC,ABC,AB+,ABC,ABC,CBA,CBA,CBA,CBA,CBA,ABC,BCA,BCA,BCA,BCA,BCA,BCA,BCA,增添一个碱基,缺少一个碱基,DNA,序列中的,一个或少数几个核苷酸,发生增添（插入）或缺失，而使其后面的全部遗传密码发生改变，而引起,转录和转译,错误。,某些理化因子，如射线，紫外线，亚硝酸等，除引起点突变外，还会引起,DNA,分子大损伤，包括染色体缺失，重复，易位，倒位等，即为染色体畸变。,（3）染色体畸变,（四）紫外线对,DNA,的损伤及其修复,DNA,中,嘧啶对,UV,的敏感性较强，经,UV,照射后,相邻嘧啶,会形成,嘧啶二聚体,（,TT，TC，CC）,和水合物。形成二聚体后，造成局部,DNA,分子无法配对，从而引起微生物的死亡或突变。,微生物修复受损,DNA,的作用,（1）光复活作用,把经,UV,照射后的微生物立即暴露于可见光下，就可出现明显降低其死亡率的现象。,对照：810,6,个/,cfu,E.coli,100 cfu,/,ml,E.coli,实验：810,6,个/,cfu,E.coli,210,6,个/,cfu,E.coli,UV,UV,360490,nm,可见光，30,min,光复活作用机制：,经,UV,照射后带有,嘧啶二聚体,的,DNA,分子，在黑暗下会被一种光激活酶（光解酶、光裂合酶）结合。,这种复合物在300 500,nm,可见光下时，此酶会因获得,光能而激活,，并使二聚体分解成单体。,光复活作用：把经,UV,照射后的微生物,立即,暴露于,可见光,下时，可明显,降低其死亡率,的现象。所以在进行紫外线诱变育种时，只能在,红光,下进行照射和后续操作，并在,黑暗,条件下培养。,58,（,2,）、暗修复作用,1,、,由,核酸内切酶,切开二聚体的,5,末端，形成,3-,OH,和5,-,P,的单链缺口,2、,核酸外切酶,从5,-,P,到,3-,OH,方向切除二聚体，并扩大缺口。,3、,DNA,聚合酶,以另一条互补链为模板，从原有链上暴露的,3-,OH,端起合成缺失片段。,4、,连接酶,将新合成的,3-,OH,与原有的5,-,P,相连接。,五、突变与育种,选种,从自然界中选种,样品采集,增殖培养（富集培养）,分离纯化：平板划线分离法、平板表面涂布法、琼脂培养基浇注法。,The classical approach for isolating enzymes from environmental samples,Enzymes(overlook)-(novel genes(encode comercial enzymes but properies of the requirment for application),1,、定向培育优良菌株,一种利用微生物的,自发突变,，并采用特定的,选择条件,，通过对微生物群体不断移植以选育出较优良菌株的,古老方法,。,卡介苗,从生产中选种,2,、诱变育种,利用物理、化学等诱变剂处理,均匀而分散,的微生物细胞群，促进其突变率显著提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选,少数,符合目的的突变株。包括,诱变和筛选,两个环节，其中筛选更重要。,诱变育种,（,breeding by induced mutation,）,诱变育种：,通过诱发基因突变，获得具有更,优生产属性,或,科学研究,的新突变菌株,诱变剂：物理、化学、生物,诱变方法,筛选方法,发酵生产属性评价,青霉素：一个时代的传奇,Penicillium chrysogenum,NRRL 1951,120,m,g/ml,Cultivation of spontaneous mutants and single-spore isolations,:,NRRL 19511325,produced,250,m,g/ml,.,X-ray treatment,:,5,00,m,g/ml,ultraviolet-induced mutants,:,Wis.Q-176,which produced,900,m,g/ml,“Wisconsin Family”of superior strains,from,Q-176 led to strains producing,over,1800,m,g/ml,.,菌种选育目的,工业生产,提高产量,简化生产工艺,缩短生产周期,提升质量,适应原材料,获得新的产品,科学研究,阐明遗传背景,增加遗传标识,分析生物合成机制,提供遗传学研究材料,1）.诱变育种的基本环节,2）.诱变育种中的原则,（1）选择简便有效的诱变剂,突变的频率,诱变剂,物理因素,化学诱变剂,生物诱变剂,出发菌株,（,original strain）,用于育种的原始菌株,选用合适的出发菌株有利于提高育种的效率,（2）挑选优良的出发菌株,自然界直接分离获得的野生型菌株,在生产中经历生产条件考验的菌株,已经过诱变甚至多次改造的菌株,选用对诱变剂敏感性较高增变变异株,合适的出发菌株来源,（3）处理单细胞或单孢子悬液,诱变剂一般只作用于,DNA,双链中的,某一条,单链，故某一突变无法反映在当代的表型上,经过,DNA,的复制,和,细胞分裂,后，这一变异才会在表型上表达出来，,出现了不纯菌落,，这就叫,表型延迟（,phenotypic lag）,表型延迟（,phenotypic lag,）,AT,G T,GC,用于诱变育种的细胞应尽量选用：,单核单细胞、悬液状态,培养几代再筛选,霉菌或放线菌的分生孢子,诱变剂的作用：,提高诱变的频率,扩大变异的幅度,使变异向正变的方向移动（产量提高）,（4）选用最适的诱变剂量,两条重要的实验曲线,横坐标,纵坐标,剂量,-,存活率曲线,诱变剂的剂量,细胞存活数的,对数值,剂量,-,诱变率曲线,诱变剂的剂量,诱变后获得的,突变细胞数,通过比较上述两曲线，可找到某,诱变剂的：,剂量存活率诱变率,三者的最佳结合点,(5),充分利用复合处理的协同效应,两种或多种诱变剂的先后使用,同一种诱变剂的重复使用,两种或多种诱变剂的同时使用,复合处理有几类,（,6,）设计高效筛选方案,筛,选,工,作,初筛,以量为主,-,选留较多有生产潜力的菌株,复筛,以质为主,-,对少量潜力大的菌株的代谢产物量作精确测定,常用的筛选方案,第一轮：,第二轮：,第三轮：同第二轮,第四轮：同上,.,.,直至获得较满意的结果为止,为了大大提高育种时初筛的效率，必须进行大量的分析测定和统计工作，并找到,形态变异,与,产量变异,两者间的相关性。,（,7,）利用和创造形态、生理与产量间的相关指标，简化筛选过程，提高正突变菌株获得机率,Genotype,phenotype,利用鉴别性培养基的原理或其他途径，就可有效地把原先肉眼无法观察的生理性状或产量性状转化为,可见的“形态”性状,。,（8）创造新型筛选方法,初 筛,复 筛,对产量突变株,培养皿上,摇瓶中,粗测为主,快速平板检出法,（1）产量突变株的筛选,1971年，国外有人报道了筛选春日霉素（,kasugamycin，,即“春雷霉素”）生产菌时所采用的一种,琼脂块培养法,，一年内曾使该抗生素产量提高10倍,3）.三类突变株的筛选方法,琼脂快培养法,诱变,春日霉素产生,菌的孢子悬液,琼脂块培养法筛选,春日霉素高产菌种,培养,2 d,培养,4-5 d,此法的关键是用打孔器取出含有一个,小菌落,的琼脂块作分别培养。这样，各琼脂块所含养料和接触空气面积基本相同，且产生的抗生素等代谢产物不致扩散出琼脂块外。,数据精确，效率高,生物鉴定平板,（2）抗药性突变株的筛选,基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性。,特点：,正选择标记,突变株可直接从抗性平板上获得-在加有相应,抗生素,的平板上，只有,抗性突变,能生长。所以很容易分离得到,定向筛选抗药性突变株,的一种有效方法，通过制备琼脂表面存在药物浓度梯度的平板、在其上涂布诱变处理后的细胞悬液、经培养后再从其上选取抗药性菌落等步骤，就可定向筛选到相应抗药性突变株。,梯度平板法,梯度平板法,（,gradient plate,）,-,定向筛选抗药性突变株的一种有效方法,表示方法,所抗药物的前三个英文字母小写斜体加上,“,r”,str,r,str,s,对链霉素的,抗性,敏感性,（3）营养缺陷型突变株的筛选,某一,野生型菌株,因发生基因突变而,丧失,合成一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，只有从周围环境或培养基中获得这些,营养或其前体物,才能正常生长繁殖的变异类型,营养缺陷型突变株,在生物学基础研究和应用研究、生产实践等研究中,十分重要,表型判断的标准,在基本培养基上能否生长,1),与营养缺陷型突变有关的3类遗传型个体,原养型（,prototroph）,野生型（,wild type，wild strain）,营养缺陷型（,auxotroph）,从自然界分离到的原始菌株（,a,b,）,经诱变剂处理后的突变株（,a,+,b,-,）,或（,a,-,b,+,）,经回复突变或重组后产生的菌株（,a,b,）,a.,基本培养基（,MM，,符号为）,2),与筛选营养缺陷型突变株有关的3类培养基,仅能满足某微生物的野生型菌株生长所 需的最低成分的组合培养基，称,MM,MM=,M,inimum,M,edium,b.,完全培养基（,CM,符号为）,一般可在基本培养基中加入一些富含,氨基酸、维生素、核苷酸和碱基,之类的天然物质，如,蛋白胨或酵母膏,等配制而成,凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基，称为,CM,CM=,C,omplete,M,edium,c.,补充培养基（,supplemental medium，SM，,符号为,A,或,B,等,）,在基本培养基上再添加对某一营养缺陷型突变株所不能合成的某,营养物,所组成，可专门选择相应的突变株。,凡只能满足,相应的营养缺陷型,突变株生长需要的培养基，称为,SM,SM=,S,upplemental,M,edium,3,）营养缺陷型的筛选方法,第一步，诱变剂处理,第二步，淘汰野生型,第三步，检出缺陷型,第四步，鉴定缺陷型,第二步，淘汰野生型,选择培养基：野生型不生长，缺陷型生长？,MM:,野生型生长，缺陷型不长,菌丝过滤法,抗生素法,青霉素（细菌）,干扰细胞壁的合成,青霉素法（细菌）,诱变后,菌悬液,MM+,青霉素,野生型,缺陷型,死亡,幸存,CM,结果：不长,死亡,青霉素,诱变后,菌悬液,洗涤,饥饿,高渗透压,MM+,青霉素,洗涤,CM,生长,夹层培养法,限量补充培养法,逐个检出法,影印平板法,第三步，检出缺陷型,夹层培养法,逐个检出法,影印平板法,Complete medium,Minimal medium,第四步，鉴定缺陷型,109,Ames,试验,“生物化学统一性”法则：,人和细菌在,DNA,的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的,DNA,，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果。,诱变剂的共性原则：,化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比,超过,95%,的致癌物质对微生物有诱变作用,90%,以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用,110,111,112,六、基因重组（,Gene recombination）,基因重组（或遗传重组）,：两个,独立,基因组内的遗传基因，通过,一定的途径,转移到一起，形成,新,的,稳定,基因组的过程。,原核微生物,的基因重组：转化、转导、接合、原生质体融合等。,真核微生物,的基因重组：有性杂交、准性杂交、转化、原生质体融合等。,1、Transformation（,转化）,转化：,受体菌（,recipient cell,）,直接,吸收供体菌（,donor cell,）,的,DNA,片段，通过,交换,，把它,整合,到自己的基因组中，而获得,部分新,的遗传性状的现象。,转化子（,transformant）：,通过转化方式而形成的,杂种后代,。,感受态,：受体细胞,最易,接受外源,DNA,片段并能,实现转化,的一种生理状态。,转化不是两个细胞的直接接触，而是供体细胞的离体,DNA,与受体细胞直接接触而转移遗传物质,转化包括两个基本过程,（1）从供体菌中提取遗传物质,DNA,并转移到受体中；,（2）供体的遗传物质在受体中的作用。,人工转化,用,CaCl,2,处理细胞，,电穿孔,等是常用的人工转化手段。,在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组,手段，是基因工程的奠基石和基础技术。,用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一,种可以摄取外源,DNA,的,“人工感受态”。,噬菌体,DNA,被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒,转染(,transfection),提纯的噬菌体,DNA,以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。,特点：,2,、接合,(conjugation),定义：,供体菌,通过,性菌毛,与,受体菌,直接接触，把,F,质粒,或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者，使后者获得若干,新遗传性状,的现象，称为,接合,。通过接合而获得新遗传性状的受体细胞，称为,接合子,。,1946,年，,Joshua Lederberg,和,Edward L.Taturm,建立的,细菌的多重营养缺陷型杂交实验,发现了细菌的接合现象。,细菌的多重营养缺陷型杂交实验,1,）、接合的发现,证实接合过程需要细胞间的直接接触的,“,U”,型管实验（,Bernard Davis，1950,）,Bernard Davis U tube expreiment，1950,2,）、接合机制,接合作用是由一种被称为,F,因子,的质粒,介导,。,F,因子的分子量通常为,510,7,，上面有编码细菌产生性菌毛及控制接合过程进行的,20,多个基因。,F,因子为附加体质粒,既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（整合）,到染色体上,3,）、,F,因子的四种细胞形式,a,）,F,-,菌株,(“,雌性”,),，,不含,F,因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收,F,因子而变成,F+,菌株,b）,F,+,菌株,(“,雄性”,),，,F,因子独立存在，细胞表面,有性菌毛,c,）,Hfr,菌株,，,F,因子插入到,染色体,DNA,上，细胞表面,有性菌毛,。,d,）,F,菌株,，,Hfr,菌株内的,F,因子因不正常切割而,脱离染色体,时，形成游离的但携带,一小段染色体基因,的,F,因子，特称为,F,因 子。细胞表面同样,有性菌毛,。,F,+,F,-,杂交,F,+,菌株的,F,因子向,F,-,细胞转移，但含,F,因子的宿主细胞,的染色体,DNA,一般不被转移。,杂交的结果,供体细胞和受体细胞均成为,F,+,细胞,F,+,F,-,杂交,F,+,菌株的,F,因子向,F,-,细胞转移，但含,F,因子的宿主细胞的染色体,DNA,一般不被转移。,F,+,细菌通过性毛与,F,-,细菌接触并发生相互作用；,F,+,细菌的,F,因子出现缺口，双链之一被切断，从断端以“滚环模型”转移,F,因子的一条链到,F,-,细菌中。,F,因子的一条链一进入,F,-,细菌中，就在,F,-,细菌中合成互补双链，经环化后形成新的,F,质粒。,复制完成后，,F,-,细菌变成,F,+,，同时原有,F,+,细胞也完成,F,因子另一条链的复制，所以转移是,F,+,的拷贝。,所以最终,杂交的结果,是,F,-,细菌变成,F,+,细菌，而原有的,F,+,细菌则不变。,Hfr,菌株的,F,因子插入到染色体,DNA,上，因此只要发生接合转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给,F,-,细胞并发生重组，由此而得名为,高频重组菌株,。,Hfr F,-,杂交,Hfr,菌株仍然保持着,F,+,细胞的特征，具有,F,性菌毛，并象,F,+,一样与,F,-,细胞进行接合。,所不同的是,，当,OriT,序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，,F,因子的先导区,(leading region),结合着染色体,DNA,向受体细胞转移。,F,因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此,F,因子不易转入受体细胞中。,HfrF-,杂交后的受体细胞,(,或接合子,),大多数仍然是,F-,中断杂交（,interrupted mating,）技术,利用,HfrF,-,的接合过程，在不同时间取样，并把样品猛烈搅拌以分散接合中的细菌，然后分析受体细菌基因型，以时间,(,分钟,),为单位绘制遗传图谱，该图谱是细菌染色体上基因顺序的直接反映。