DB65∕T 4292-2020 牛羊布鲁氏菌病荧光偏振（FPA）检测方法(新疆维吾尔自治区).pdf

ICS 11. 220 B 41 新疆维吾尔自主11习DB65 区地方标准DB65/T 4292-2020 牛羊布鲁氏菌病荧光偏振(FPA)检测方法Detection ofbrucellosis in cattle and sheep by Fluorescence Polarization Assay(FPA) 2021 - 01-01发布2021一02 -01实施新疆维吾尔自治区市场监督管理局发布0865/T 4292-2020 刚昌本标准按GB/T1.1-2020 (标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则相关要求编制。本标准由乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心提出。本标准由新疆维吾尔自治区畜牧兽医局归口并组织实施。本标准由新疆维吾尔自治区畜牧业标准化技术委员会技术归口。本标准由乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心、哈尔滨平:可生物技术有限公司起草。本标准主要起草人:李爱巧、王涛、李泽钦、周继萍、吴星星、连晓春、施远翔、周棕长、胡玉军、杨玲、马晓燕、张震、刘文伟、蔡扩军、李建玲、王立群。本标准实施应用中的疑问，请咨询乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心、哈尔滨平润生物技术有限公司。对本标准的修改意见建议，请反馈至新疆维吾尔自治区市场监督管理局(乌鲁木齐市新华南路167号)、新疆维吾尔自治区畜牧兽医局(乌鲁木齐市新华南路408号)、乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心(乌鲁木齐市南湖西路15号)、哈尔滨平河生物技术有限公司(黑龙江省哈尔滨市国家高新技术产业开发区太湖北街5号)。新疆维吾尔自治区市场监督管理局联系电话[phone];传真[phone];邮编:830004 新疆维吾尔自治区畜牧兽医局联系电话:[phone];传真[phone];邮编:830004 乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心联系电话:[phone];传真[phone];邮编:830063 哈尔滨平河生物技术有限公司联系电话[phone]传真[phone];邮编:150090IDLC:/T A1nl 叮r飞叮八UU.JI I -tL7L-一LV牛羊布鲁氏菌病荧光偏振(FPA)检测方法1 范围本标准规定了牛、羊布鲁氏菌病荧光偏振(FPA)检测的生物安全措施、仪器设备与耗材、试剂和操作方法。本标准适用于新疆维吾尔自治区境内的牛、羊布鲁氏菌抗体水平的初筛检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单适用于本文件。GB 19489 实验室生物安全通用要求NY/T 541 动物疫病实验室检验采样方法DB 65/T 3893 羊布鲁氏菌病监测样品采集技术规范3 缩略语下列缩略语适用于本文件。OIE W orld Organization for Animal Health 世界动物卫生组织FPA Fluorescence Polarization Assay 荧光偏振检测FPM Fluorescence Polarisation Analyser 荧光偏振分析仪mP Millipolarisation Units 荧光偏振值OPS O-Polysaccharide 0-多半唐mohms milliohms 兆欧姆4 生物安全措施为了保护实验室检测人员的安全，应由经过实验室生物安全培训的并取得检测员上岗证的工作人员进行布鲁氏菌病的实验室检测工作，采取必要的预防气溶胶感染的安全措施。实验所产生的废弃物按照GB 19489中的有关规定执行。5 仪器设备与耗材5. 1 荧光偏振检测仪:试管型的布病便携式FPA检测仪和96孔的台式FPA检测仪两种。5.2 微量移液器(1L 10L、20L200L、100L 1000L)、多道移液器(10 L200L) 和吸头。5. 3 96孔黑色平底不透明微量板(聚苯乙烯板)。5.4 10 mmx75 mm棚硅玻璃试管。D865/T 4292-2020 5.5 旋涡振荡器。6 试剂6. 1 标准阳性血清:布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂。6. 2 标准阴性血清:布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂。6.3 FPA标记抗原:布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂或自行配置方法见附录A。6.4 10 xFPA样品稀释液:布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂或试剂自行配置方法见附录A。7 操作方法7. 1 样品采集和处理按照NYfT541和DB65fT 3893中的方法采集和分离受检牛、羊的血清，分离后的血清应没有溶血现象，血清量通常为1mL备用。7. 2 操作前准备工作7.2.1 将试剂和样品恢复至室温18oc 28 oc。检测操作应在室温18oc 28 oc下进行。7.2.2 10倍FPA样品稀释液:在商业化稀释液瓶中加入200mL (电阻为18.2mohms)的去离子水，混合均匀后为1xFPA样品稀释液，直接使用。7.2.3 FPA标记抗原，直接应用。7. 3 试管检测法7.3. 1 对照阴阳性血清检测7. 3. 1. 1 每天第一次试验前或FPA检测仪被移动后，都要检测对照血清。7.3.1.2 在两个10mmx75 mm棚硅玻璃试管(试管应清洁无指纹等，且无刮痕中分别加入1mL的lxFPA样品稀释液。7.3.1.3 分别在两个试管中加各入10L的阳性和阴性对照血清，充分混合均匀(旋涡混合器振动5s)。7.3.1.4 使用试管型便携式FPA仪分别读取两管的空白密度值。7.3.1.5 每管加入10L的FPA标记抗原，充分混合均匀(旋涡混合器振动5s)。7.3.1.6 孵育至少2min，最长不超过5mino 7.3.1.7 使用便携式FPA仪读取两管的mP值。试管的检测顺序与读取空白密度值时的顺序一致。7.3.1.8 对照结果:阴性对照牛血清的mP值应低于90mP (通常在75mP左右)阳性对照牛血清的mP值在200mP左右。如果对照成立，再进行样品检测。否则，按照FPA仪器的操作软件和操作程序，调试便携式FPA仪的参考因子值，直到满足对照结果成立的数值，才可进行样品的检测。7.3.2 样品检测7.3.2.1 在10mmx75 mm棚硅玻璃试管加入1mL的1xFPA样品稀释液(一个试管加一个样品。7.3.2.2 在上述试管中加入10L的牛血清(或25L绵羊血清、或40L山羊血清)，充分混合均匀(旋涡混合器振动5s)。不同畜种血清稀释度不同，具体如下:a) 牛血清1:100 (即10L血清加到1.0mL样品稀释液中);b) 绵羊1:40 (即25L血清加到1.0mL样品稀释液中); c) 山羊1:25(p 40L血清加到1.0mL样品稀释液中)。7.3.2.3 使用试管型便携式FPA仪读取被检样品试管的空白密度值。2 nDt.只/TA勺0)r.)r. LlLlUvl I -，.r一-一VLV7.3.2.4 在上述试管中加入10L的FPA标记抗原，充分混合均匀(旋涡混合器振动5s)。7.3.2.5 孵育至少2min，最长不超过5min。7.3.2.6 使用试管型便携式FPA仪读取被检样品的mP值。试管的测量顺序与读取空白密度值时的顺序一致。7.3.2. 7 结果判定:被检样品mP值大于其阂值时，判为阳性mP值小于阂值时，判为阴性mP值.等于阂值时，需重做。7.3.2.7. 1 没有接受疫苗接种的动物，阳性与阴性之间的临界值是:a) 牛血清为95mP;b) 绵羊血清78mP;c) 山羊血清88mP。7.3.2.7.2 接种疫苗(6-9)个月后:a) 牛血清116mP为阳性:b) 绵羊88mP为阳性;c) 山羊88mP为阴性;注88mP为阳性。7.4 微量法检测7.4.1 对照阴阳性血清检测7.4. . 每天第一次试验前或FPA检测仪被移动后，都要检测对照血清。7.4. 1. 2 在干净的黑色96孔板的第一列中的6个孔中分别加入190L的己稀释的1xFPA样品稀释液。复孔分别加入10L的阳性(c+)、阴性(c-)的对照牛血清和样品稀释液(cc)7.4.1.3 振动2min，充分混合均匀。使用台式FPA仪读取平板的空白密度值。7.4.1.4 每孔加入10L的FPA标记抗原，振动2min，充分混合均匀。7.4.1.5 孵育至少2min，最长不超过5min。7.4.1.6 使用台式FPA分析仪读取平板的检测密度值mP值。检测顺序与读取空白密度值时的顺序一致。7.4.1.7 对照结果:阴性对照血清的mP值应该低于90mP(通常在75mP左右);阳性对照血清的mP值通常在200mP左右。如果对照成立，再进行样品检测。否则，按照FPA仪器的操作软件和操作程序，调试FPA检测仪的参考因子值，直到满足对照结果成立的数值，才可进行样品的检测。7.4.2 样品检测7.4.2. 1 在干净的黑色96孔板中每个孔加入190L的己稀释的lxFPA样品稀释液。其中设置阳性对照和阴性对照孔各两个。7.4.2.2 向每个对照孔和样品孔中分别加入10L的阳性、阴性对照血清和被检牛血清(二个孔检测一个样品)，室温下振动2min，充分混合均匀。96孔板置入荧光偏振检测仪中进行第一次读数，得到对照血清和样品的空白值。7.4.2.3 从FPA检测仪上取出96孔板向每个孔中分别加入10L的FPA标记抗原，室温下振动2min，充分混合均匀。7.4.2.4 如台式FPA检测仪是非自动加样的，需要将96孔板置入荧光偏振检测仪中进行第二次读数，得到对照血清和样品的mP值。平板的测量顺序与读取空白板时的顺序一致。7.4.2.5 如台式FPA检测仪是自动加样的，后续程序设置好后，仪器自动加入10L的FPA标记抗原、然后振动2min，充分混合均匀;再孵育至少2min; FPA检测仪进行第二次读数，得到对照血清和样品的mP值。3 rOLC / T Aln 叮叮n叫 nUOUv/ I -tL7-LVLV 7.4.2.6 结果判定:阴性对照血清的读值必须介于(60 90) mP之间，阳性对照血清的读值必须介于(140 300) mP之间，当二者读数都成立时，才能对样品进行判断。待检血清样品mP值大于其阙值时，判为阳性mP值小于阂值时，要u为阴性mP值等于阂值时，需重做。7.4. 3 结果判定7.4.3. 1 非免疫牛布鲁氏菌病疫苗的家畜血清样品阙值为:牛血清95mP。7.4.3.2 免疫牛布鲁氏菌病疫苗的家畜血清样品阂值可比临界值高20mP，确定为可疑的范围，待3个月后再进行复检。7.4. 3. 3 接种疫苗(6-9)个月后，牛血清116 mP为阳性。4 A.1 FPA标记抗原制备附录A(规范性附录)i式齐IJ自己需IJnR=;/ T LI.?O?一_?门?()制备OPS时，5 g干重(或50g湿重)牛种产布鲁氏菌S119-3株菌体悬液中加入400mL2 % (V /V)醋酸，121 oc高压灭菌15min，于5oC:i:3 oC 10000 g离心10min，去除菌体碎体。然后，上清液用20g的三氯醋酸沉淀任何蛋白质和核酸，4oC 1000 g再离心10min去除沉淀。取上清液置100倍体积的蒸馆水透析，浓缩后冻干备用。将3mg OPS溶于0.6mLO.l M的氢氧化纳(NaOH4 g/L)中，370C士2oC孵育1h，加入二甲亚pJXt配制的异硫氨酸荧光素异构体-I(浓度为100mg/mL)O.3 mL再于37oC:i:2 oC温育1h。结合的OPS加到1xl0 cm的用0.01M pH 7.4士0.2磷酸缓冲液平衡的二乙氨基乙基葡聚糖凝胶(DEAE)层析柱上。加10mL 15 mL缓冲液后为亮绿色，然后换为pH7.4:i:0.2的0.1M的磷酸缓冲液，这将导致10mL 15 mL的缓冲液洗脱后有25mL40mL的绿色荧光物质洗脱下来。将此物质用作FPA中的抗原。抗原可按比例增加。每次试验所用抗原的量可通过洗脱上述物质直至FPM的荧光强度达到250000至300000而确定。抗原于5oC:i:3 oC以液体状态可贮存于深色瓶中数年，或冻干保存于深色瓶中。标记抗原可以从少量商业来源处获得。A.2 10 x样品稀释液称取8.5g氯化纳，12.1 g Tris, 0.5 mL吐温20，5.7 g EDTA，加蒸馆水至100mL，混匀。调节pH值至7.2，121 oC高压灭菌30min。室温保存。使用前用200mL (电阻为18.2mohms)的去离子水稀释至l样品稀释液直接使用。5